Articolo metodologico

Un protocollo ottimizzato per l'infezione da Candida albicans in Schmidtea mediterranea per studiare la patogenesi fungina e la difesa dell'ospite

DOI:

10.3791/70500

⸱

17 aprile 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Merced, 2Quantitative and Systems Biology Graduate Program, University of California, Merced, 3Health Sciences Research Institute, University of California, Merced, 4Center for Cellular and Biomolecular Machines, University of California, Merced

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo fornisce una guida ottimizzata e dettagliata per l'utilizzo della planaria Schmidtea mediterranea come sistema modello per studiare le interazioni ospite-patogeno durante un'infezione fungina. Il metodo si basa sulla precedente procedura per infettare planarie con il patogeno fungino umano Candida albicans, fornendo indicazioni dettagliate per migliorare la riproducibilità e la coerenza sperimentale.

Abstract

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Candida albicans è un patogeno fungino opportunista comune che colonizza asintomaticamente la maggior parte degli esseri umani. Sebbene tipicamente benigna commensale, la disbiosi causata dall'uso di antibiotici, dalla disfunzione immunitaria o dalla alterazione della barriera epiteliale può scatenare una crescita eccessiva e infezioni fungine, che vanno da malattie mucose superficiali a candidosi sistemica potenzialmente letale. Sono necessari nuovi modelli preclinici di infezione per analizzare la patogenesi di C. albicans in vivo , attraversando diversi stadi di infezione e con diversi esiti misurabili per l'ospite. La planaria Schmidtea mediterranea era stata precedentemente stabilita come ospite invertebrato per studiare le interazioni ospite-patogeno durante l'infezione da C. albicans . S. mediterranea si basa interamente su meccanismi immunitari innati conservati in grado di superare l'infezione con microrganismi patogeni, inclusi batteri e funghi. La straordinaria capacità rigenerativa delle Planarie e le popolazioni di cellule staminali accessibili rendono questo organismo un modello pratico per analizzare le risposte immunitarie precoci, la riparazione dei tessuti e la rimozione dei patogeni in vivo. Questo modello supporta l'analisi simultanea della virulenza fungina e delle risposte trascrizionali dell'ospite, fornendo preziose informazioni sulla dinamica delle infezioni. Qui è stato presentato un protocollo aggiornato con modifiche dettagliate, procedure standardizzate e passaggi ottimizzati per infettare S. mediterranea con C. albicans , progettato per aumentare la riproducibilità e consentire studi sistematici sulla patogenesi fungina e sulla difesa dell'ospite.

Introduzione

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Candida albicans è un comune patogeno fungino opportunista che colonizza asintomaticamente il 50-70% degli esseriumani 1,2,3. Tipicamente, un comensale innocuo, C. albicans, può crescere troppo in condizioni come squilibri microbioti, uso di antibiotici, immunosoppressione, alterazione della barriera epiteliale o presenza di dispositivi medici, portando a malattie che vanno da infezioni mucose superficiali a candidosi sistemica potenzialmenteletali 4,5. Negli individui immunodepressi – inclusi quelli con HIV/AIDS, pazienti sottoposti a chemioterapia o terapie immunosoppressive, individui con malattie croniche o in unità di terapia intensiva – i tassi di mortalità possono superare il 70%, sottolineando il significativo onere per la salute pubblica della candidosi invasiva 6,7,8. A livello globale, le infezioni fungine invasive colpiscono più di 6,5 milioni di persone ogni anno, con i costi sanitari diretti solo negli Stati Uniti che superano gli 8 miliardi di dollari all'anno per le infezioni correlate alla Candida 9,10. Nonostante i trattamenti antifungini disponibili, i tassi di morbilità e mortalità associati alle infezioni da C. albicans sono rimasti sostanzialmente invariati per decenni, evidenziando l'urgente necessità di comprendere meglio le interazioni ospite-patogeno nelle malattie fungine.

C. albicans impiega un repertorio diversificato di fattori di virulenza che supportano la colonizzazione, la persistenza e la patogenesi in una vasta gamma di ambienti ospitanti. Questi includono l'adesione ai tessuti dell'ospite, l'evasione immunitaria, la rimodellazione della parete cellulare, la secrezione di enzimi idrolitici, la plasticità morfologica e la formazione di biofilm 11,12,13,14,15,16. Collettivamente, queste caratteristiche permettono a C. albicans di adattarsi a nicchie diverse degli ospiti, modulare le risposte immunitarie e resistere alle terapieantifungine 16,17,18,19,20,21. Chiarire come questi processi influenzino gli esiti dell'infezione – inclusa morbilità dell'ospite, mortalità ed eliminazione dei patogeni – è essenziale per sviluppare strategie preventive e terapeutiche più efficaci.

Per indagare queste dinamiche ospite-patogeno, abbiamo stabilito un sistema modello utilizzando la planaria Schmidtea mediterranea comeospite 22,23,24. Questo modello funge da piattaforma versatile per studiare la risposta multisistemica dell'ospite all'infezione fungina, sfruttando un metodo di infezione basato sull'ammollo che consente l'esposizione sincrona degli animali a C. albicans. La sezione seguente presenta procedure aggiornate passo dopo passo che perfezionano questo protocollo, migliorano la riproducibilità e facilitano un'implementazione coerente tra i laboratori.

Le Planarie sono invertebrati liberi con eccezionale capacità rigenerativa, capaci di sostituire rapidamente i tessuti persi per lesioni o infezioni25. Mancano di un sistema immunitario adattativo e si affidano interamente a difese innate conservate – inclusi recettori di riconoscimento di schemi, peptidi antimicrobici, secrezione di muco e cellule fagocitiche – per eliminare patogeni batterici e fungini entroi giorni 26, 27, 28 e 29. Poiché l'immunità innata rappresenta la prima linea di difesa tra gli eucarioti e rimane poco studiata al di fuori dei sistemimammiferi, le planarie offrono l'opportunità di esaminare questi processi in vivo con risoluzione cellulare e molecolare. La loro capacità rigenerativa è guidata da cellule staminali pluripotenti adulte, note come neoblasti, che costituiscono circa il 30% delle cellule adulte e contribuiscono al recupero dopo l'infezione23,30. Queste caratteristiche rendono S. mediterranea un modello potente per dissezionare la virulenza e la difesa degli ospiti patogeni su scala genetica, cellulare, tissutale e organismica, permettendoci di affrontare domande spesso difficili da studiare utilizzando sistemi mammiferi tradizionali.

Inoltre, le piccole dimensioni dei planari (tipicamente pochi millimetri di lunghezza), il basso costo e la facilità di manutenzione31 supportano esperimenti su larga scala evitando i vincoli finanziari, etici e normativi insiti nei modelli di vertebrati. Come C. albicans, S. mediterranea è genomicamente trattabile, con un genoma completamente sequenziato e annotato, e supporta tecniche molecolari e cellulari avanzate – tra cui profilazione trascrizionale, immunoistochimica ad alta risoluzione e istologia, e robusta interferenza RNA (RNAi)32,33,34,35,36,37,38. Questi strumenti consentono un'analisi parallela delle risposte dell'ospite e del patogeno durante l'infezione.

Sono stati utilizzati diversi modelli preclinici alternativi per studiare le infezioni fungine. Ospiti invertebrati come Galleria mellonella (falena cera), Caenorhabditis elegans (verme rotondo) e Drosophila melanogaster (mosca della frutta), così come il vertebrato Danio rerio (pesce zebra), offrono ciascuno vantaggi sperimentali distinti ma presenta anche limitazioni notevoli. Questi sistemi spesso si affidano alla sopravvivenza come endpoint primario perché le infezioni inducono rapidamente la morte dell'ospite, impedendo una valutazione dettagliata della morbilità, del recupero e delle risposte multisistemiche – caratteristiche che il modello planario cattura facilmente.

Modelli mammiferi come Mus musculus (topo), Rattus norvegicus (ratto), Oryctolagus cuniculus (coniglio) e Cavia porcellus (cavia) riassumono più da vicino la fisiologia umana, ma sono limitati da costi elevati, dimensioni ridotte delle coorti, requisiti etici e normativi e la sfida di distinguere le risposte immunitarie innate da quelle adattative. Inoltre, decenni di ricerca sulla patogenesi fungina nei topi si sono concentrati prevalentemente sull'infezione sistemica in stadioavanzato 39,40,41,42,43, spesso trascurando eventi precoci come la rottura della barriera epiteliale e la crescita mucosa – le vie più comuni di innesco della malattia fungina nell'uomo 44,45,46.

Studiare le interazioni ospite-patogeno è quindi essenziale per comprendere i processi biologici che stanno alla base della virulenza fungina, della difesa dell'ospite e della progressione della malattia. Le infezioni fungine invasive rappresentano una minaccia globale crescente, con più specie che ora mostrano resistenza a tutte le principali classi di farmaci antifungini. Si stima che oltre 1 miliardo di persone siano colpite da infezioni fungine, e fattori come il cambiamento climatico, l'uso diffuso di antimicrobici e il crescente numero di individui immunodepressi stanno accelerando l'emergere di patogeni resistenti agliantifungini 47,48,49,50. Comprendere come i funghi patogeni colonizzino e interagiscono con i loro ospiti è fondamentale per sviluppare nuove strategie preventive e terapeutiche.

Quanto segue descrive un protocollo di infezione sistemica rivisto e standardizzato per le interazioni S. mediterranea-C. albicans, progettato per promuovere la riproducibilità e consentire un'indagine sistematica sulla patogenesi fungina e sui meccanismi di difesa dell'ospite. Il protocollo originale è stato seguito nelle pubblicazioniprecedenti 22, 23, 24. La Tabella 1 riassume gli aggiornamenti chiave incorporati in questa versione rivista, inclusi miglioramenti nelle procedure di inoculazione fungina, riduzione dei volumi di pozzi, criteri definiti per l'inclusione degli animali, determinazione di dosi infettive e letali e raccomandazioni aggiornate sull'allevamento animale. Questo flusso di lavoro fornisce indicazioni dettagliate per la coltivazione di C. albicans, l'infezione delle planarie tramite esposizione a ammollo e la valutazione della virulenza fungina e delle risposte dell'ospite utilizzando letture qualitative e quantitative in condizioni sintomatiche e a dose letale (Figura 1). Le procedure ottimizzate qui presentate incorporano variabili identificate empiricamente come determinanti chiave della dinamica delle infezioni e degli esiti dell'ospite, migliorando così la riproducibilità e consentendo una valutazione sistematica delle interazioni ospite–patogeno.

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Protocollo

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Questo protocollo si basa sui metodiprecedenti 22,23,24 e stabilisce procedure chiare e standardizzate per migliorare la riproducibilità e consentire un'indagine sistematica della patogenesi fungina e delle risposte dell'ospite in S. mediterranea. I principali miglioramenti del protocollo includono criteri predefiniti per l'inclusione e l'esclusione degli animali, la preparazione microbica standardizzata e la valutazione completa degli endpoint dell'ospite.

Tutte le procedure devono essere eseguite utilizzando tecniche di biosicurezza sterili e asettiche appropriate di livello 2. Gli strumenti standard di protezione individuale da laboratorio (DPI), inclusi guanti, camice da laboratorio e scarpe chiuse, devono essere indossati in ogni momento. Le procedure che coinvolgono la planaria S. mediterranea sono state condotte in conformità con le linee guida istituzionali per l'uso etico degli invertebrati.

Tutte le miglioramenti del protocollo sono riassunte nella Tabella 1. Tutti i reagenti, le attrezzature critiche, i medi, i tamponi e le ricette per l'immunocolorazione sono elencati nella Tabella dei Materiali e nella Tabella 2.
NOTA: Tutte le procedure che coinvolgono il modello animale invertebrato S. mediterranea devono essere condotte per garantire i più alti standard di benessere animale. S. mediterranea dovrebbe essere ospitata in condizioni ottimizzate che simulino habitat naturali. Gli esperimenti dovrebbero essere progettati per minimizzare il potenziale dolore o disagio al fine di garantire un trattamento etico durante tutto lo studio.

1. Coltivazione fungina

  1. Informazioni sul ceppo di C. albicans
    1. Il ceppo standard di laboratorio di C. albicans SN25051 è stato utilizzato come ceppo di tipo selvatico per tutti gli esperimenti, ed è disponibile pubblicamente presso il Fungal Genetics Stock Center (http://www.fgsc.net/). SN250 deriva dall'isolato clinico SC5314, originariamente raccolto da una coltura del sangue di un paziente con candidosidisseminata 52.
    2. I ceppi di C. albicans sono mantenuti come scorte di glicerolo al 25% a −80°C.
  2. Coltivazione dei ceppi di C. albicans per infezione
    1. Strisce da stock criogenico
      1. Utilizzando un applicatore sterile, si striscia il ceppo desiderato da stock a −80°C sulle lastre di agar estratto di peptone di lievito (YPD) (estratto di lievito al 1%, 2% peptone, 2% glucosio; pH 6,8).
      2. Incubare staticamente a 30°C per 72 ore.
  3. Preparazione delle colture notturne
    1. Inoculare una singola colonia in 4 mL di YPD liquido in tubi di vetro borosilicato sterili (18 mm × 150 mm) utilizzando un applicatore sterile.
    2. Includere un tubo di controllo negativo contenente YPD non inoculato in condizioni identiche.
    3. Coprire leggermente i tubi per permettere l'aerazione e incubare durante la notte (16 ore) a 30 °C con scuotimento a 220 giri/min (orbitale) in un incubatore a scuotere.
      NOTA: Se si verifica una crescita microbica nel controllo negativo, interrompere l'esperimento e ricominciare con nuovo substrato e tecnica sterile.
  4. Prelievo e lavaggio delle celle
    1. Utilizzando la tecnica asettica, trasferire le colture su tubi centrifughe etichettati da 15 mL.
    2. Centrifugare le colture per 5 minuti a ~3.000 × g per pelletare le cellule.
    3. Rimuovi con attenzione il sovrandanzante YPD senza disturbare il pellet.
    4. Risospendere il pellet in acqua planaria (vedi Tabella 2 per la composizione) in un volume pari a quello dello YPD utilizzato.
    5. Mescola accuratamente tramite vortice.
    6. Ripeti i passaggi 1.4.2-1.4.4 altre due volte per rimuovere completamente il materiale di crescita.
    7. Dopo il lavaggio finale, risospendere la pellet cellulare in acqua planaria fresca tramite vortice.
  5. Quantificazione della concentrazione cellulare di C. albicans
    1. Diluizione per la misurazione del diametro esterno
      1. Prepara tre tubi microcentrifughe sterili da 1,7 mL con diluizione 1:20 (coltura 50 μL + 950 μL acqua planaria) oppure un fattore di diluizione alternativo scelto. Mescola bene.
      2. Prepara un tubo vuoto contenente acqua planaria da 1000 μL.
    2. Spettrofotometria
      1. Imposta lo spettrofotometro per misurare la densità ottica a 600 nm (OD600).
      2. Svuota lo spettrofotometro con acqua planaria.
      3. Misura OD600 per ogni campione diluito e registra i valori.
      4. Fai la media delle tre letture e moltiplica per il fattore di diluizione per determinare il diametrodiametro 600 della coltura del stock. Converti OD600 in concentrazione cellulare.
        NOTA: Il fattore di conversione della densità ottica dovrebbe essere determinato empiricamente per ogni spettrofotometro. In base agli strumenti specifici utilizzati, un OD600 di 1 corrisponde a circa 2 ×10 celluledi C. albicans/mL53 di 7 albicans.
  6. Determinazione delle concentrazioni sperimentali di inoculi
    1. Preparare la concentrazione desiderata dell'inoculo per ogni condizione sperimentale.
      NOTA: Eseguire almeno tre repliche biologiche per determinare la dose efficace per la colonia planaria, in particolare per endpoint infettivi o letali. Un calcolo rappresentativo per la preparazione delle concentrazioni di inoculi infettivi e letali è fornito nel File Supplementare 1.

2. Specie planarie e manutenzione

  1. Specie planari e manutenzione
    1. Utilizzare la linea clonale asessuata CIW4 della planaria S. mediterranea per tutti gli esperimenti.
    2. Mantenere le colonie planarie in contenitori di plastica trasparenti di qualità alimentare contenenti 1.500–2.000 mL di 1× acqua planaria.
    3. Tieni i contenitori al buio a 20 °C con i coperchi chiusi leggermente per permettere lo scambio di gas.
    4. Non trattare le planarie con antibiotici.
  2. Manutenzione e alimentazione della colonia
    1. Dai da mangiare alle colonie una fritta di fegato di manzo fresca filtrata una volta a settimana.
    2. Pulire i contenitori due volte a settimana.
    3. Mantenere la densità planaria tra 200 e 400 animali per contenitore. I lavori precedenti dimostrano procedure dettagliate sulla preparazione della colonia e la manutenzione a lungotermine 31.
  3. Condizionamento pre-esperimento
    1. Prima dell'infezione sperimentale, si affamine le planarie per 7–12 giorni per standardizzare le condizioni metaboliche e di dimensione.
    2. Utilizzare gruppi di 5–10 animali per pozzo per ogni condizione sperimentale. Assicurati di avere un numero uguale di animali in tutte le condizioni, inclusi controlli positivi e negativi.
  4. Selezione della dimensione degli animali
    1. Seleziona planarie lunghe circa 5 mm, corrispondenti a ~5 ×10 5 cellule ospiti peranimale 54.
    2. Evita di usare planarie più piccole di 5 mm, poiché animali di questa dimensione possono includere individui con blastema o sviluppo incompleto che può produrre risultati incoerenti.
    3. Evitare di usare planarie più grandi di 5 mm, poiché animali di taglia maggiore sono meno adatti all'immunocolorazione a fluorescenza.
    4. Utilizzare planarie lunghe circa 5 mm per stabilire condizioni di dosi infettive (ID50) e dose letale (LD50).
      NOTA: Per facilitare una selezione costante delle dimensioni, stampare una griglia di riferimento da 5 mm × 5 mm e posizionarla all'interno di una custodia di plastica sotto il contenitore planario trasparente. Assicurati che le planarie siano completamente estese prima di misurare la lunghezza.
  5. Criteri di salute e inclusione
    1. PASSO CRITICO: Esaminare tutte le planarie sotto stereomicroscopio prima dell'uso.
    2. Escludere animali con danni o lesioni visibili, incluse le seguenti condizioni:
      1. Presenza di blastema (tessuti privi di pigmentazione) o sviluppo di pigmentazione incompleta.
      2. Pigmentazione anomala, come regioni significativamente più scure.
      3. Tessuto mancante o danneggiato.
      4. Lesioni o cicatrici.
      5. Ferite aperte.
      6. Anomalie o deformità morfologiche.
      7. Qualsiasi condizione cronica o non guarita.
    3. Escludere gli animali con anomalie dello sviluppo.
      1. Regioni biforcate o duplicate della testa o della coda.
      2. Morfologia corporea deforme o asimmetrica.
      3. Numero errato di fotorecettori (è accettabile solo una coppia bilaterale).
      4. Faringe posizionata in modo anomalo.
      5. Ciliazione difettosa che provoca motilità compromessa o comportamento di scivolamento irregolare.
    4. Includere solo animali lunghi circa 5 mm, completamente sviluppati e privi di lesioni o anomalie visibili.
  6. Preparazione del piatto
    1. Trasferire planarie sane che soddisfano tutti i criteri di inclusione in 2 mL di acqua planaria fresca per pozzo in una lastra di polistirene a 6 pozzi non trattata con coltura tissutale.
      NOTA: Trasferire gli animali un giorno prima dell'infezione per permettere l'acclimatazione al nuovo ambiente e alla densità di popolazione.
    2. Assegnare pozzi per le seguenti condizioni sperimentali:
      1. Controlli negativi: animali non infetti o trattati in simulazione.
      2. Controlli positivi: animali infetti da C. albicans di tipo selvatico.
    3. Rimuovere e sostituire tutta l'acqua con 2 mL di acqua planaria fresca per garantire uniformità tra i pozzi.

3. Configurazione dell'infezione

  1. Preparare l'inoculazione (vedi File Supplementare 1 per il calcolo del campione)
    1. Utilizzando la tecnica asettica, rimuovere delicatamente tutta l'acqua dalla piastra a 6 pozzi inclinando la piastra verso l'utente.
    2. Aggiungi il volume calcolato di acqua planaria a ciascun pozzo.
      NOTA: Procedi uno bene alla volta per evitare che gli animali si secchino.
    3. Aggiungi il volume calcolato della coltura di C. albicans in ciascun pozzo.
      NOTA: Evitare di esporre gli animali all'aria per lunghi periodi, poiché l'asciugatura può causare stress e alterare gli esiti delle infezioni.
  2. Condizioni sperimentali di incubazione delle placche
    1. Posizionare la piastra inoculata a 6 pozzi in un luogo buio e statico a temperatura ambiente.
    2. Mantenere le lastre sperimentali in un'area separata dalle colonie planarie non infette per prevenire contaminazioni incrociate.
    3. Annota la data e l'ora dell'inoculazione (indicate come ora 0 h).
      NOTA: Evitare aree ad alto traffico o soggette a vibrazioni (ad esempio, cassetti, superfici degli strumenti o piani di lavoro affollati), poiché il movimento può stressare gli animali e confondere i risultati.
    4. Incubare planarie con C. albicans per un massimo di 72 ore, a seconda dell'endpoint desiderato.
  3. Risospensione delle cellule fungine
    1. In ogni punto temporale, risospendere delicatamente le cellule di C. albicans stabilite senza disturbare le planarie.
      NOTA: Il tempo (ore [h] o giorni [d] dopo l'infezione) si riferisce al tempo trascorso dall'esposizione iniziale (tempo 0).
    2. A 24 ore dall'infezione (hpi)
      1. Utilizzando una pipetta di trasferimento sterile da 3 mL, inclina leggermente la piastra verso l'utente.
      2. Aspira l'acqua planaria e dispensala delicatamente in un'area del pozzo libera da animali per mescolare lo strato fungino sedimentato.
      3. Ripeti questo passaggio 5–10 volte per pozzo per rompere lo strato fungino sedimentato, evitando il contatto diretto con le planarie.
      4. Osserva l'insediamento fungino su uno sfondo scuro per la migliore visibilità prima e dopo i passi di sospensione.
      5. Sospendere i pozzi di controllo non infetti in condizioni identiche.
    3. A 48 hpi
      1. Ripeti la procedura di risospensione descritta sopra.
      2. Eseguire tutti i passaggi di sospensione entro ± 1 ora dal momento designato.
  4. Fine esposizione (72 hpi)
    1. A 72 hpi, trasferire delicatamente le planarie su una nuova piastra a 6 pozzi contenente 2 mL di acqua planaria fresca per pozzo.
    2. Minimizza il trasferimento della coltura fungina utilizzando il minor volume possibile di liquido.
    3. Una volta trasferiti gli animali, rimuovere tutta l'acqua e sostituirla con acqua planaria fresca.
      NOTA: Maneggiare con delicatezza gli animali e eventuali frammenti di tessuto per evitare danni meccanici o stress aggiuntivo.

4. Valutazione degli endpoint host

  1. Registrazione degli esiti dell'ospite
    1. Iniziare a valutare gli esiti dell'ospite a 1 giorno dall'infezione (dpi) e continuare quotidianamente fino al punto di riferimento sperimentale desiderato.
    2. Quantificare il danno all'ospite utilizzando il sistema standardizzato di punteggio 0–3 (Figura 2).
      Punteggio 0: Nessun cambiamento rispetto ai controlli non infetti (sani, asintomatici).
      Punteggio 1: Sintomo lieve.
      Punteggio 2: sintomo o sintomi gravi.
      Punteggio 3: Morte.
  2. Criteri per la valutazione dei sintomi dell'ospite
    1. Punteggio 0 (Asintomatico):
      1. Identificare animali che mostrano morfologia, pigmentazione, comportamento e reattività normali senza cambiamenti osservabili rispetto ai controlli non infetti.
    2. Punteggio 1 (Lieve):
      Assegnare un punteggio lieve quando almeno uno dei seguenti sintomi viene osservato rispetto ai controlli asintomatici.
      1. Velocità di movimento ridotta o comportamento anomalo di planata.
      2. Perdita parziale o totale della risposta fototattica.
      3. Contrazioni corporee prolungate o ripetitive.
      4. Pigmentazione anomala o non uniforme (regioni più chiare o più scure).
      5. Regressione del tessuto della testa o della coda.
    3. Punteggio 2 (Grave):
      Assegnare un punteggio grave quando uno o più dei seguenti sintomi sono presenti mentre gli animali sono ancora vivi.
      1. Pellicola oculare o perdita di uno o entrambi gli occhi.
      2. Perdita totale della testa o danni evidenti ai tessuti anteriori.
      3. Perdita tessutale importante nella regione pre-faringea.
      4. Frammentazione in più regioni corporee (cefalici, faringei o segmenti posteriori).
      5. Ferite aperte con o senza secrezione di muco o perdite interne.
      6. Lisi parziale dei tessuti che comporta perdita di integrità strutturale.
      7. Postura corporea a forma di "C", paralisi o grave distruzione della motilità.
    4. Punteggio 3 (Morte):
      Identificare la morte basandosi su uno o più dei seguenti criteri.
      1. Lisi completa di tessuto o su animali interi.
      2. Perdita totale di risposta agli stimoli.
      3. Mancato recupero o rigenerazione.
        NOTA: La Figura 2 fornisce immagini rappresentative e caratteristiche distintive per ogni punteggio per garantire una classificazione coerente del fenotipo ospite.

5. Determinazione della sopravvivenza dell'ospite dopo l'esposizione ai funghi

  1. A 3 dpi, trasferire delicatamente le planarie su una nuova piastra a 6 pozzi contenente 2 mL di acqua planaria fresca per pozzo, evitando il trasferimento di colture fungine residue.
  2. Osserva gli animali usando la microscopia lucica (≥ obiettivo 10x).
  3. Registra i risultati dell'host utilizzando il foglio di punteggio standardizzato fornito nel File Supplementare 2.
  4. Determinazione degli animali vivi
    1. Identificare gli animali viventi basandosi su uno o più dei seguenti criteri.
      1. Fototaxi negativa.
      2. Risposta a una perturbazione della pipetta di trasferimento gentile.
      3. Struttura corporea intatta.
      4. Attacco stabile alla placca.
  5. Determinazione degli animali morti
    1. Identificare gli animali morti basandosi su uno o più dei seguenti criteri.
      1. Lisi completa o disintegrazione (solo detriti residui).
      2. Corpo trasparente o eviscerato.
      3. Assenza di movimento o risposta agli stimoli.
      4. Mancato rigenero (assenza di formazione di blastema).
  6. Rimozione degli animali morti
    1. Rimuovere animali morti e detriti solo dopo aver confermato la non vitalità tramite microscopia.
    2. PASSO CRITICO: Rimuovere immediatamente gli animali morti per prevenire contaminazioni incrociate o misure di sopravvivenza alterate.
    3. Se restano detriti o residui fungini, trasferire nuovamente gli animali sopravvissuti su una piastra fresca contenente acqua planaria pulita per evitare la risemina di C. albicans o la formazione di biofilm.
      NOTA: Posizionare lastre a 6 pozzi su uno sfondo scuro durante l'ispezione visiva per migliorare il contrasto e facilitare la valutazione del fenotipo.

6. Valutazione del carico fungino

  1. Quantificazione delle unità formative di colonie (CFU)
    1. Nei momenti di infezione desiderati, raccogliere planarie (5–10 animali per condizione al giorno). Includere controlli non infetti/simulati abbinati e controlli infetti di tipo selvatico.
    2. Risciacquare delicatamente i pozzi due volte con 2 mL di acqua planaria fresca per rimuovere le cellule di fondo di C. albicans .
    3. Trasferire le planarie in tubi microcentrifuga sterili e etichettati da 1,7 mL o 5,0 mL e rimuovere tutta l'acqua residua.
    4. Aggiungi 300 μL di acqua planaria fresca a ciascun tubo.
    5. Omogeneizzare gli animali usando un pestello sterile finché non rimangono frammenti grandi (circa 30–45 s).
    6. Esegui diluizioni seriali dell'omogeneato (ad esempio, 1:10, 1:100, 1:1000).
    7. Placca 100–200 μL di ogni diluizione su piastre agar YPD integrate con 50 μg/mL ciascuna di ampicillina, rifampicina, estreptomicina e neomicina. Distribuisci uniformemente usando perline di vetro sterili o uno spreader cellulare sterile.
    8. Lascia che i piatti rimangano in posizione verticale sul piano di lavoro per 5–10 minuti dopo la piastratura per permettere l'assorbimento del liquido nell'agar.
    9. Prepara piastre triplice per ogni diluizione e condizione.
    10. Incubare le piastre a 30 °C per 48 ore.
    11. Conta le CFU e moltiplica per il fattore di diluizione.
    12. Normalizzare i valori delle CFU al numero di planarian per calcolare le CFU medie per planaria e per condizione. Ad esempio, se si osservano 100 colonie con una diluizione del 10× da un omogeneato di 5 animali, il valore calcolato è 200 CFU per animale.

7. Colorazione immunofluorescenza anti-Candida

  1. Considerazioni generali sulla colorazione
    1. Esegui tutti i passaggi con un leggero oscillazione orbitale (100–140 giri/min) a temperatura ambiente, salvo diversa indicazione. Consulta il File Supplementare 1 per i dettagli sugli anticorpi e le fonti dei reagenti.
      ATTENZIONE: Formaldeide, solfato di dodecile di sodio (SDS) e perossido di idrogeno sono sostanze chimiche pericolose e devono essere manipolate in conformità con le normative di sicurezza istituzionali. Il formaldeide è tossico e classificato come cancerogeno; La SDS è un irritante; e il perossido di idrogeno è un ossidante potente che può causare ustioni. Indossa l'attrezzatura di protezione individuale adeguata (camice da laboratorio, guanti in nitrilo, scarpe chiuse e occhiali di sicurezza). Eseguire procedure che coinvolgono reagenti volatili in una cappa chimica certificata e smaltire i rifiuti secondo le linee guida istituzionali per la salute e la sicurezza ambientale.
  2. Raccolta di campioni
    1. Raccogli animali da ogni condizione sperimentale e momento temporale.
    2. Trasferire gli animali in fiale di scintillazione marcate da 20 mL contenenti 2 mL di acqua planaria.
    3. Rimuovi tutto il liquido, risciacqua una volta con 2 mL di acqua planaria fresca, poi riprendi tutto liquido ancora una volta.
  3. Fissazione e permeabilizzazione
    1. Sacrificare animali in N-acetilcisteina (NAC) al 7,5% in 1× PBS per 3 minuti.
    2. Rimuovere la soluzione e fissare gli animali con formaldeide al 4% e allo 0,3% PBSTx per 15 minuti.
    3. Risciacquare i campioni due volte con 1× PBS.
    4. Permeabilizza i campioni in SDS all'1% per 15 minuti.
    5. Risciacquare i campioni tre volte con 1× PBS.
  4. Sbiancamento
    1. Campioni di candeggina in perossido di idrogeno al 6% in 1× PBS sotto una luce LED intensa per 4–12 ore.
      NOTA: Se lo sbiancamento non può procedere immediatamente, conservare i campioni fissi in 1× PBS a 4 °C per un massimo di 1 settimana oppure disidratare i campioni in metanolo al 100% per conservazione a lungo termine.
  5. Blocco e incubazione degli anticorpi
    1. Trasferire gli animali su piastre da 24 pozzi contenenti 1× PBS.
    2. Bloccare il legame aspecifico nel 2,5% di PBS-TB (PBS contenente Triton X-100 e albumina sierica bovina) per 4 ore a temperatura ambiente o 8 ore a 4 °C.
    3. Incubare campioni con anticorpo anti-Candida primario (1:500 nel PBS-TB) per 4 ore a temperatura ambiente o 8 ore a 4 °C.
    4. Rimuovere l'anticorpo primario e lavare i campioni otto volte ogni 20 minuti con lo 0,3% di PBSTx (totale ~2,5 ore).
    5. Incubare campioni con anticorpo secondario anti-coniglio coniugato con Alexa-568 (1:800 in PBS-TB) per 4 ore a temperatura ambiente o 8 ore a 4 °C.
      NOTA: Proteggere i campioni dalla luce per prevenire il fotosbiancamento. Le soluzioni di anticorpi possono essere riutilizzate.
    6. Rimuovere l'anticorpo secondario e lavare i campioni otto volte ogni 20 minuti con PBSTx allo 0,3%.
  6. Montaggio opzionale a carrello
    1. Posiziona gli animali su un vetrino al microscopio con tutti quelli orientati anteriormente verso l'alto.
    2. Rimuovere l'acqua in eccesso con una pipetta di trasferimento.
    3. Assorbi con cura il liquido residuo dai bordi usando il bordo di un tovagliolo di carta.
    4. Aggiungere 150–175 μL di mezzo da montaggio Gelvatol (Tabella 2 per la composizione) a goccia finché gli animali non sono completamente coperti.
    5. Posiziona con cura un sottoveste di copertura sopra il campione, evitando le bolle d'aria.
    6. Lascia solidificare il Gelvatol per almeno 2 ore prima dell'immagini.
    7. Conserva i diapositive in un luogo fresco e buio per una conservazione a lungo termine.
  7. Imaging
    1. Campioni di immagine usando eccitazione giallo-verde (~578 nm) e osservazione dell'emissione arancione-rossa (~603 nm).
    2. Usa una lente obiettivo 2x per visualizzare i pattern di macchia di animali interi.

8. Risoluzione dei problemi

  1. Se gli esiti dell'infezione sono incoerenti, eseguire una curva dose-titolazione utilizzando SN250 di tipo selvatico o un altro ceppo di base in incrementi di 5–10 × 107 cellule/mL.
  2. Eseguire almeno tre repliche biologiche contenenti 5–10 animali per gruppo.
  3. Includere gruppi di controllo negativi e positivi per identificare potenziali problemi come contaminazione incrociata, fallimento della tecnica asetttica, problemi di vitalità del ceppo o scarsa salute animale di base.
  4. Dopo aver completato l'esperimento di titolazione dose-dose, il pool si replica per determinare la sopravvivenza mediana per gruppo.
  5. Analizzare le differenze di sopravvivenza utilizzando l'analisi logaritmica di Mantel–Cox a coppie.
  6. Utilizzare l'analisi di sopravvivenza di Kaplan–Meier per valutare le differenze temporali fino alla morte tra ceppi o trattamenti.
  7. Per condizioni da dosi subletali o infettive, si analizzano gli esiti sintomatici dell'ospite (ad esempio, fenotipi lievi o gravi o colonizzazione fungina) invece della sopravvivenza.
  8. Confrontare le risposte dell'ospite tra i gruppi di dose per determinare l'intervallo di dosi infettivo o letale appropriato per gli esperimenti successivi.

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Risultati

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Viene presentato un protocollo aggiornato per infettare planarie con C. albicans (Figura 1) e quantificare sistematicamente gli esiti dell'ospite (Figura 2). Questo flusso di lavoro raffinato supporta una valutazione robusta di molteplici parametri di infezione, inclusa morbilità (gravità sintomatica della malattia), sopravvivenza (letalità), carico fungino (CFU) e dinamica spazio-temporale della colonizzazione patogeno...

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Discussione

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Variando la dose infettiva di C. albicans selvatico si producono differenze riproducibili e dipendenti dalla dose nella morbilità di S. mediterranea, sottolineando la sensibilità del modello alla valutazione quantitativa della virulenza fungina. Questo protocollo delinea strategie per stabilire dosi di base infettive e letali all'interno delle colonie planarie mantenute in laboratorio e presenta criteri per confermare un'infezione sistemica di successo tramite immersion...

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Dichiarazioni

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C.J.N. è co-fondatore di BioSynesis, Inc., un'azienda che sviluppa diagnostiche e terapie per infezioni da biofilm. Tutti gli altri autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Ringraziamenti

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Gli autori ringraziano tutti i membri dei laboratori Nobile, Oviedo e Hernday per le discussioni approfondite sul modello di infezione da S. mediterranea-C. albicans e sono grati a Edelweiss Pfister per la gestione del laboratorio e la manutenzione delle planarie. Questo lavoro è stato sostenuto dai National Institutes of Health (NIH) e dal National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) che assegnano R35GM156045 e R35GM124594 al C.J.N., e R35GM158501 e R01GM132753 al N.J.O. Questo lavoro è stato inoltre sostenuto dalla famiglia Kamangar sotto forma di una cattedra finanziata per C.J.N. N.M.S. è stato sostenuto dalle borse di studio Center for Cellular and Biomolecular Machines (CCBM) del Center of Research Excellence in Science and Technology (CREST) del Center for Cellular and Biomolecular Foundation (NSF) con i premi NSF-HRD-1547848 e NSF-EES-2112675.

I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e analisi dei dati, nell'interpretazione dei dati, nella stesura del manoscritto o nella decisione di pubblicare i risultati. N.M.S. riconosce l'uso di ChatGPT per l'assistenza nella modifica del manoscritto (controllo di ortografia, grammatica, formattazione e struttura delle frasi).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Tubi microcentrifughe da 1,7 mL  VWR/Genemate490004-436-BOXOF500Clear, scatola da 500 pezzi
Fiale di scintillon da 20 mLFisher Scientific12-100-006Bottiglie di vetro trasparente per l'immunomacchia
Piastre di polistirene non trattate a 24 pozziFisher Scientific08-772-51Immunocolorazione
Tubi microcentrifughe da 5,0 mL  Eppendorf/Sigma AldrichEP0030119487-200EATrasparente, scatola da 200 pezzi
Piastre di polistirene non trattate a 6 pozziFisher Scientific08-772-49Analisi di infezione
AgarVWR89405-066Grado batteriologico per il mezzo YPD
Stick applicatoriThermo Fisher/Puritano22-029-491C. albicans coltura
BioRenderBioRender Inc.N/ASoftware per la progettazione di figure utilizzato per generare illustrazioni schematiche
Cloruro di calcio (CaCl2)Sigma-AldrichC5080-500GAcqua planaria/1x Montjuï Sali C
Candida albicans anticorpi policlonali anti-Rabbit, IgGThermo FisherPA1-27158Immunocolorazione
Tubi centrifugheVWR89039-664C. albicans raccolta
Tubi di coltura in vetro borosilicato 18x150mmVWR47729-583C. albicans coltura
CuvettesFisher Scientific14-955-127Per misurare la densità ottica delle colture
Destrosio (D-glucosio)Fisher ScientificD16-3YPD medium
GliceroloFisher ScientificG33-4Grado di biologia molecolare per integrare per l'immagazzinamento criogenico di C. albicans 
Strumento di grafica e visualizzazione dei datiGraphPad/PrismSoftware statistico e strumento di visualizzazione. Versione 10.6.1.
Strumento di graficaRSoftware statistico. Versione 4.4.3.
Shaker IncubatoreEppendorfEPM1282-0004-1EANew Brunswick Innova 44/44R per < ess> C. albicans coltivazione
Cloruro di magnesio (MgCl2)SigmaM8266-100GPer le acque planarie   (1x Montjuï c sali)
Solfato di magnesio (MgSO4)Sigma-AldrichM7506-500GPer le acque planarie   (1x Montjuï c sali)
Vetri per microscopioVWR16004-368
Microscopio multizoomNikonNikon AZ100 
N-acetil-L-cisteinaSigma AldrichA7250-50GReagenti mucolitici e sacrificali  Fissazione
Paramaldeide, soluzione al 16%, grado biologico molecolareScienze della microscopia elettronica15710Reagente fissativo
Motore Cordless a Pestello a PelletFisher Scientific12-141-361Omogeneizzazione planaria
Peptone, grado batteriologicoHIMEDIA/VWR89129-480YPD medium
PestelliFisher Scientific12-141-368Pellet usa e getta senza RNasi per omogeneizzazione planaria
Piastre di Petri, 100 x 15 mmVWR25384-342
Poliuretano (alcol vinilico)Sigma-AldrichP-8136 Per Gelvatol
Cloruro di potassio (KCl)Sigma Life ScienceP9541-500GMezzo planario/acqua  (1x Montjuï c sali)
Anticorpo secondario anti-Rabbit per capra, IgG, Alexa Fluor 568Fisher ScientificA-11011Immunocolorazione
SN250Centro di Scorte di Genetica FunginaWildtype C. albicans strain (https://www.fgsc.net/)
Azida di sodioFisher ScientificS227-100Per Gelvatol
Bicarbonato di sodio (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761-1KGMezzo planario/acqua  (1x Montjuï c sali)
Cloruro di sodio (NaCl)Sigma Life ScienceS3014-500GMezzo planario/acqua  (1x Montjuï c sali)
SpettrofotometroAgilent26354Micropiastra BioTek Epoch 2 per misurare la densità ottica
Incubatore StaticoFisher Scientific15-015-2634C. albicans culturing
Pipette di trasferimentoFisher Scientific13-711-9CMPippette graduate sterili usa e getta per trasferire planarie
Tris BaseSigma-Aldrich252859Per Gelvatol
Estratto di lievitoThermo Fisher212750YPD medium

Riferimenti

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