Validazione dell'integrazione e dell'espressione casuale dei transgeni nei parassiti di Eimeria

Sommario

Qui presentiamo un metodo standardizzato per convalidare l'integrazione e l'espressione di geni estranei nei parassiti transgenici di Eimeria . Integrando analisi genomiche e a livello proteico, questo flusso di lavoro conferma l'inserimento e l'espressione genica stabili. Questo approccio facilita lo sviluppo di Eimeria transgenica per la ricerca e le applicazioni vaccinali.

Abstract

La validazione dei parassiti transgenici di Eimeria è essenziale per confermare l'integrazione genomica stabile e l'espressione dei geni esogeni. Questo protocollo descrive un flusso di lavoro completo per verificare l'inserimento dei transgeni e l'espressione proteica in Eimeria tenella. La procedura inizia con l'estrazione del DNA genomico da oocisti sporulati, seguita da un'amplificazione PCR per verificare preliminarmente la presenza del frammento bersaglio. Per confermare ulteriormente l'integrazione genomica, viene eseguita una risequenziazione dell'intero genoma per identificare i siti di inserimento e valutare la stabilità del costrutto integrato nel genoma del parassita. L'espressione proteica viene successivamente esaminata tramite Western blotting di lisati preparati da sporozoiti purificati, permettendo la rilevazione della proteina ricombinante bersaglio. Inoltre, la localizzazione intracellulare viene visualizzata tramite un saggio di immunofluorescenza indiretta (IFA) utilizzando cellule ospiti infette. Insieme, questi saghi forniscono un quadro solido e riproducibile per la validazione delle linee transgeniche di Eimeria . Questo flusso di lavoro consente una conferma affidabile dell'integrazione genomica e dell'espressione proteica, supportando così applicazioni a valle nella manipolazione genetica, nella genomica funzionale e nello sviluppo di vaccini che mirano ai parassiti di Eimeria .

Introduzione

La coccidiosi, causata dalle specie di Eimeria, rappresenta una delle malattie parassitarie più significative dal punto di vista economico nel pollame, portando a una riduzione dell'aumento di peso, una cattiva conversione del mangime e perdite finanziarie globali stimate di miliardi di dollari ogni^{anno 1, 2, 3}. La manipolazione genetica dei parassiti Eimeria è diventata uno strumento potente sia per la ricerca fondamentale sia per lo sviluppo di^{vaccini 4,5,6}. La trasfezione stabile consente l'integrazione e l'espressione di geni esogeni, come i reporter fluorescenti o gli antigeni protettivi, consentendo la visualizzazione in tempo reale dello sviluppo dei parassiti e la valutazione mirata dei candidati ^{vaccini 7,8,9}.

Una precedente pubblicazione di Duan et al. ha fornito un protocollo standardizzato per la nucleofezione e la propagazione in vivo di Eimeria transgenica, stabilendo un metodo efficiente per generare e arricchire le linee di parassiti^{ricombinanti 10}. Tuttavia, attualmente non esiste un flusso di lavoro unificato per confermare l'integrazione genomica stabile e l'espressione funzionale dei transgeni. Tale validazione è fondamentale per garantire l'autenticità, la stabilità e la riproducibilità delle linee transgeniche utilizzate per studi biologici a valle o applicazioni vaccinali.

Questo articolo presenta un protocollo completo e passo dopo passo per la validazione dell'integrazione e dell'espressione dei transgeni in Eimeria tenella, utilizzando una linea transgenica di E. tenella che esprime l'antigene VP2 (Et-VP2) virus della malattia borsale infettiva (IBDV) come modello¹¹. Il plasmide di espressione p5′AMic2linkerVP2m3′A, portante il gene VP2 e un reporter mCherry, è stato trasfetato in sporozoiti selvatici di E. tenella (Et-WT). Gli oocisti fluorescenti rossi sono stati isolati tramite selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) e passati in serie in polli privi di coccidia. Questo flusso di lavoro dimostra procedure per l'estrazione del DNA genomico, l'analisi preliminare di integrazione basata su PCR, il risequenziamento dell'intero genoma per identificare i siti di inserimento, il Western blotting per verificare l'espressione proteica e il saggio indiretto di immunofluorescenza (IFA) per visualizzare la localizzazione intracellulare della proteina ricombinante. Insieme, questi metodi forniscono un quadro riproducibile e completo per confermare l'autenticità delle linee transgeniche di Eimeria , consentendone un uso affidabile nella ricerca genomica funzionale e nello sviluppo di vaccini.

Protocollo

Tutti gli esperimenti con animali che coinvolgono polli sono stati approvati dal Comitato per la Cura e l'Uso Istituzionale degli Animali dell'Università Agricola Cinese (numero di approvazione: CAU20160628-2). Tutte le procedure di allevamento e sperimentali sono state condotte in conformità con le linee guida del Comitato per la Cura e l'Uso Istituzionale degli Animali dell'Università Agricola Cinese e conformi ai Principi Guida Internazionali per la Ricerca Biomedica che coinvolge gli Animali. In questo studio sono stati utilizzati polli White Leghorn maschi specifici senza patogeni (SPF) di sette giorni. Gli uccelli furono mantenuti in condizioni standard di allevamento, con libero accesso a cibo e acqua per tutto il periodo sperimentale. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Estrazione del DNA genomico da oocisti sporulati di Eimeria spp.

1. Trasferire 1 mL di una sospensione di oocisti (≥1 × 10⁷/mL) in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL. Aggiungi un volume uguale di perline di vetro da 1 mm corrispondenti al pellet di oocista. Interrompi gli oocisti usando un omogeneizzatore tissutale battendo vigorosamente la perla a 60 Hz per 5 minuti finché le pareti dell'oocisti non si rompono completamente e il contenuto viene rilasciato.
2. Raccogli la miscela (escluse le perline di vetro) in un nuovo tubo e centrifuga a 12.000 x g per 1 minuto. Scartare il soprantantante, aggiungere 500 μL di tampone CTAB e 40 μL di proteinasi K, e incubare la miscela a 60 °C per 30 minuti.
3. Aggiungi 500 μL di fenolo:cloroformio:isoamil alcol (25:24:1), vortice per 10 secondi e centrifuga a 12.000 x g per 5 minuti. Trasferisci la fase acquosa superiore in un nuovo tubo.
   NOTA: Coprire e scartare ben strettamente il tubo contenente lo strato organico per prevenire la contaminazione dell'ambiente. (Opzionale) Se la contaminazione proteica rimane alta, ripeti il passaggio 1.3 1–2 volte in più.
4. Aggiungi 500 μL di cloroformio: alcool isoamilico (24:1), vortice per 10 secondi e centrifuga a 12.000 x g per 5 minuti. Trasferire la fase acquosa in un nuovo tubo e aggiungere un volume uguale di isopropanolo. Mescola per inversione finché non compaiono precipiti di DNA.
   NOTA: Le precipitazioni a −20 °C per ≥1 ora o durante la notte aumentano la resa.
5. Centrifuga a 12.000 x g per 10 minuti per pelletare il DNA. Lava il pellet con etanolo al 70%, centrifuga a 12.000 x g per 5 minuti e poi elimina il soprandante. Rimuovere con attenzione il liquido residuo con una pompa a vuoto e asciugare il pellet all'aria a temperatura ambiente o a 37 °C.
6. Sciogliere la pellet di DNA essiccata in un tampone_{ddH 2O}o TE contenente RNasi. Incubare a 37 °C per ≥1 ora oppure a 4 °C durante la notte per rimuovere l'RNA residuo. Conservare il DNA purificato a −20 °C.
   NOTA: Per la conservazione a lungo termine, i pellet di DNA non disciolti possono essere conservati direttamente a −20 °C o −80 °C. Valutare l'integrità e la concentrazione del DNA tramite elettroforesi su gel di agarosio prima delle applicazioni a valle.

2. Verifica PCR della presenza del costrutto Et-VP2 nel genoma del parassita

1. Progettare coppie di primer (Tabella 1) per verificare l'integrazione genomica del costrutto Et-VP2.
   NOTA: Le sequenze di innesco sono state progettate utilizzando Primer-BLAST, con parametri tipici di lunghezza di innesco di 18–24 pb, una temperatura di fusione di circa 55–60 °C e una formazione di strutture secondarie minima. La specificità di ogni coppia di primer è stata ulteriormente confrontata con il genoma di Eimeria tenella per evitare un'amplificazione aspecifica.
2. Prepara una miscela di reazione da 50 μL contenente 25 μL di 2× Taq Master Mix, 21 μL ddH₂O, 1 μL ciascuno di primer frontale e inverso, e 2 μL di modello di DNA.
3. Eseguire l'amplificazione utilizzando le seguenti condizioni di ciclo termico: denaturazione iniziale a 95 °C per 5 minuti; 30 cicli a 95 °C per 30 secondi, 55 °C per 30 secondi e 72 °C per 1 minuto; seguita da un'estensione finale a 72 °C per 10 minuti.
   NOTA: Assicurati che tutti i reagenti siano ben miscelati prima del ciclo termico. Utilizza modelli di DNA appena preparati per ottenere un'efficienza ottimale di amplificazione.

3. Resequenziamento della linea del parassita transgenico (Et-VP2)

1. Invio di esempi e costruzione della biblioteca
   1. Invia una sospensione di oocisti da 1 mL (≥1 × 10⁷/mL) a un fornitore commerciale di servizi di sequenziamento per un'analisi di risequenziamento di nuova generazione.
   2. Dopo la valutazione della qualità del DNA genomico, frammentare il DNA tramite interruzione meccanica tramite ultrasuoni. Purificare il DNA frammentato, eseguire la riparazione delle estremità, aggiungere una base adenina (A) alle estremità a 3′ e legare gli adattatori di sequenziamento.
   3. Seleziona frammenti di DNA della dimensione desiderata utilizzando elettroforesi in gel di agarosio ed esegui l'amplificazione PCR per costruire la libreria di sequenziamento.
   4. Sottoporre la biblioteca costruita a ispezioni di qualità. Esegui sequenziamento a estremità pari sulla piattaforma Illumina NovaSeq utilizzando una lunghezza di lettura di 150 bp. Mantenere una profondità di sequenziamento del 100× per garantire l'accuratezza dei dati, generando almeno 6 GB di dati grezzi con un punteggio minimo di qualità di Q20 >90%.
      NOTA: Maneggiare tutti i reagenti e i campioni di DNA utilizzando tecniche asettiche per prevenire la contaminazione. Verifica che i parametri di sequenziamento soddisfino le metriche di profondità e qualità richieste prima di procedere con l'analisi dei dati.
2. Analisi dei dati
   1. Filtra i dati grezzi di sequenziamento usando il software Fastp (v0.23.2) secondo i seguenti criteri¹²:
      1. Rimuovi le sequenze degli adattatori.
      2. Imposta la soglia di bassa qualità a Q20 e rimuovi le letture in cui le basi di bassa qualità rappresentano più del 30% della lunghezza totale della lettura.
      3. Rimuovi le letture più corte di 50 bp.
   2. Allineare le letture controllate dalla qualità al genoma di riferimento di E. tenella (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_905310635.1) utilizzando il software Bowtie2 (v2.4.5)¹³. La casualità dei dati di sequenziamento di nuova generazione viene valutata in base alla profondità e all'uniformità della copertura.
   3. Assicurarsi che le letture di sequenziamento siano allineate alla sequenza vettoriale transgenica. Rimuovere le letture che non mappano la regione del T-DNA per ottenere letture chimeriche, in cui un'estremità si mappa al T-DNA e l'altra al genoma di riferimento di E. tenella .
   4. Sulla base delle sequenze delle letture chimeriche, esegui l'allineamento usando ToxoDB (release 64) per determinare la posizione specifica dei potenziali siti di inserimento del T-DNA. Analizzare la profondità di sequenziamento tra le regioni omologhe tra il vettore e il genoma di Eimeria (ovvero le regioni regolatorie 5′ e 3′) utilizzando il software Mosdepth (v0.3.3)¹⁴.
   5. Identificare potenziali siti di integrazione del plasmide transgenico all'interno del genoma di E. tenella e verificarli tramite PCR utilizzando il sistema di reazione descritto nel passo 2.1.
      NOTA: Garantire l'uso coerente delle versioni software e delle impostazioni dei parametri durante l'analisi per mantenere l'accuratezza e la riproducibilità dei dati.

4. Western blotting delle proteine transgeniche di Eimeria

1. Raccogli una sospensione PBS contenente almeno 5 ×^{10 6} sporozoiti in un tubo centrifuga da 1,5 mL e centrifuga a 2500 x g per 5 minuti. Risospendere il pellet in un tampone di lisi RIPA da 100 μL e incubare sul ghiaccio per 1 ora. Aggiungi 20 μL di tampone proteico a 6× e riscalda la miscela a 100 °C per 10 minuti.
2. Prepara i gel SDS-PAGE utilizzando una lastra di vetro da 1,5 mm. Regolare la concentrazione di acrilammide in base al peso molecolare della proteina bersaglio. Durante la polimerizzazione, sovrappone il gel separatore con acqua distillata per garantire una superficie uniforme prima di aggiungere il gel di accumulo.
3. Centrifugare il lisato a 10.000 x g per 5 minuti e caricare 40 μL di soprantantante in ogni corsia campione. Caricare 10 μL di marcatore proteico in una corsia separata e riempire le corsie rimanenti con 40 μL di buffer di carico 1× come controlli.
4. Eseguire l'elettroforesi in 1× tampone di funzionamento a 70 V per 20 minuti, seguita da 120 V per 60–90 minuti, fino a quando il fronte del colorante raggiunge il fondo del gel.
5. Elimina il gel in base alla dimensione attesa della proteina. Pre-attiva una membrana PVDF nel metanolo per 1 minuto e assembla il sandwich di trasferimento nell'ordine seguente: spugna, carta filtrante, gel (lato catodoco), membrana PVDF, carta filtrante, spugna. Rimuovere eventuali bolle d'aria e trasferire proteine a 70 V per 3 ore nel tampone di trasferimento.
6. Lava la membrana tre volte con PBST (5 min ciascuno) e blocca con latte scremo al 5% per 1 ora a temperatura ambiente o durante la notte a 4 °C. Lava la membrana due volte con PBST per rimuovere la soluzione residua bloccante.
7. Incubare la membrana con anticorpi primari diluiti in buffer di anticorpi: anti-Flag policlonale del topo (1:2000) e anti-GAPDH monoclonale del topo (1:2000). Incubare per 1 ora a temperatura ambiente o durante la notte a 4 °C con lievi scuotere. Raccogli la soluzione di anticorpi e lava la membrana cinque volte con PBST (5 min ciascuno).
8. Incubare la membrana con IgG anti-topo coniugato con HRP (1:2000) per 1 ora a temperatura ambiente. Lava la membrana cinque volte con PBST (5 min ciascuno).
9. Preparare un substrato ECL mescolando volumi uguali di soluzione A e B. Applicare il substrato in modo uniforme alla membrana e rilevare i segnali proteici utilizzando un sistema di imaging chemiluminescenze.
   NOTA: Eseguire tutti i passaggi che coinvolgono campioni di proteine su ghiaccio, salvo diversa indicazione. Maneggiare substrati di metanolo ed ECL in una cappa fumaria indossando guanti e occhiali protettivi.

5. Saggio di immunofluorescenza indiretta intracellulare (IFA) di Eimeria transgenica

1. Purificazione degli sporozoiti utilizzando una colonna cromatografia
   1. Collega la colonna cromatografia a una pompa peristaltica e regola la portata a 50–60 Hz. Lava la colonna con acqua distillata e soluzione di glicina.
   2. Aggiungere la sospensione di cellulosa DE-52 alla colonna mentre si aggiunge continuamente la soluzione di glicina fino a raggiungere l'altezza del letto di cellulosa di circa 1 cm.
   3. Carica sporozoiti purificati con il metodo Percoll sulla colonna. Mantenere una portata di 30–40 Hz usando soluzione di glicina e raccogliere il flusso in un tubo centrifuga da 50 mL.
   4. Monitorare l'eluato posizionando gocce su un vetrino di vetro per l'osservazione microscopica. Quando non vengono rilevati sporozoiti, ferma la pompa. Centrifugare la frazione raccolta a 2.500 x g per 5 minuti, scartare il sovrantantante e risospendere il pellet in PBS.
      NOTA: Esegui tutti i passaggi in condizioni sterili per prevenire la contaminazione microbica. Smaltire glicina e rifiuti Percoll secondo le normative istituzionali sulla biosicurezza.
2. Infezione da sporozoite delle cellule HFF
   1. Semi 1 × 10^{10 6} sporozoiti in piastre a 24 pozzi contenenti monostrati di cellule HFF. Aggiungere penicillina-streptomicina a una concentrazione finale di 1× (100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di estreptomicina), mescolare delicatamente e incubare a 37 °C per 4–6 ore per consentire l'invasione. Rimuovi il substrato, lava una volta con 1 mL PBS e elimina il sovrantante.
   2. Rimuovere con cura le coperture di vetro dai pozzi usando pinze sterili e trasferirle su una piastra nuova a 24 pozzi. Fissare i campioni in 1 mL di paraformaldeide al 4% per 30 minuti, lavare una volta con 1 mL PBS e poi eliminare il surnadante.
   3. Permeabilizza le cellule con 1 mL di 0,25% Triton X-100 per 30 minuti. Lava una volta con 1 mL PBS e scarta il soprantantante.
   4. Blocca i campioni con 1 mL di BSA al 3% per 30 minuti. Lava una volta con 1 mL PBS e scarta il soprantantante.
   5. Diluire l'anticorpo anti-Flag monoclonale del topo (1:200) al 3% di BSA. Posizionare gocce dell'anticorpo diluito su pellicola sigillante e invertire le coperture (lato cellula verso il basso) sulle gocce. Incubare le coperture in una camera umidificata a 37 °C per 1 ora. Lava tre volte con 1 mL PBS (5 min ciascuno).
   6. Diluire IgG anti-topo coniugato con FITC (1:200) e Hoechst 33258 (1:100) in 3% di BSA. Posiziona gocce della miscela di macchia su pellicola sigillante e inverti le coperture sulle gocce. Incubare in una camera umidificata a 37 °C per 1 ora, poi lavare cinque volte con 1 mL di PBS (5 min ciascuno).
   7. Montare le coperture posizionando un mezzo antifade da 5 μL su una vetrata di vetro. Inverti la copertura (lato cella verso il basso) sul drop, evitando le bolle d'aria, e sigilla i bordi. Conservare le vetrine montate in una camera umidificata a 4 °C fino all'acquisizione dell'imagin.
      NOTA: Maneggiare paraformaldeide e Triton X-100 in una cappa chimica mentre indossa guanti e protezione per gli occhi. Le formulazioni dei reagenti utilizzate in questa procedura sono elencate nella Tabella 2.

Risultati

L'analisi PCR genomica ha confermato la presenza del frammento bersaglio nei parassiti transgenici, mentre nessuna banda corrispondente è stata rilevata nel controllo di tipo selvatico (Figura 1A). Il risequenziamento dell'intero genoma ha ulteriormente dimostrato che il plasmide linearizzato è stato integrato stabilmente nel genoma del parassita, e il sito di integrazione previsto è stato validato tramite amplificazione PCR attraverso la regione della giunz...

Discussione

Questo protocollo stabilisce un flusso di lavoro completo per la validazione dell'integrazione genomica, dell'espressione proteica e della localizzazione intracellulare di geni esogeni nell'E. tenella transgenico. Invece di affidarsi a un singolo saggio, l'approccio combina evidenze genomiche e a livello proteico, garantendo che l'inserimento del transgene sia sia sia strutturalmente espresso.

Diversi passaggi critici in questo protocollo influenzano ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Antifade Mounting Medium	MCE	HYK1042	Fluorescent mounting medium to prevent photobleaching
BSA (3%)	Beyotime	ST023	Blocking buffer and antibody dilution buffer for IFA; block at room temperature for 30 min
Chloroform:isoamyl alcohol (24:1)	Sigma	C0549	Reagent for removing residual phenol during genomic DNA extraction
Coccidia-Free Chickens	Boehringer-Ingelheim	SPF	Used for in vivo passage and amplification of transgenic strains; approved by the Ethics Committee (approval number: CAU20160628-2)
CTAB (Cetyltrimethylammonium bromide)	Merck KGaA	H5882	Component of genomic DNA extraction buffer; formulation: 3 g CTAB + 12.27 g NaCl + 15 mL 1 mol/L Tris-HCl + 6 mL 0.5 mol/L EDTA, adjusted to a final volume of 150 mL with ddH2O
DE-52 Cellulose	Solarbio	C8350	Ion exchange chromatography medium for sporozoite purification; sequentially treated with NaOH, HCl, and distilled water, then equilibrated with glycine solution
ECL Substrate (Solution A + Solution B)	thermofisher	32106	Chemiluminescent detection reagent; mix equal volumes of Solution A and B before use
FITC-Conjugated Goat Anti-Mouse IgG	Sigma	AP124F	Fluorescent secondary antibody for IFA, dilution ratio 1:200
Glass beads	Sigma	Z250473-1PAK
Glycine Solution	Sigma	67419	Equilibration and elution buffer for chromatography columns; formulation: 0.75 g glycine + 7.9 g NaCl dissolved in 500 mL distilled water, pH adjusted to 7.4-7.6, autoclaved
Hoechst 33258	Sigma	94403	Nuclear staining reagent, dilution ratio 1:100; used for IFA localization
HRP-Conjugated Goat Anti-Mouse IgG	Sigma	12-349	Secondary antibody for Western blotting, dilution ratio 1:2000
Illumina NovaSeq Sequencing Platform	Personalbio Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, China)		Next-generation sequencing platform; paired-end sequencing (150 bp read length), sequencing depth 100×, generating ≥6 GB raw data (Q20>90%)
Low Speed Centrifuge	BEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE	DT5-2
Mouse Monoclonal Anti-Flag Antibody	Sigma	F1804	Primary antibody, dilution ratio 1:200; used for IFA detection of Flag-tagged fusion protein
Mouse Monoclonal Anti-GAPDH Antibody	Sigma	G8795	Primary antibody, dilution ratio 1:2000; used as a loading control for Western blotting
Nonfat Milk (5%)	Beyotime	P0216	Blocking buffer for Western blotting; block at room temperature for 1 h or 4°C overnight
Paraformaldehyde (4%)	Merck KGaA	30525	Cell fixation solution; fix at room temperature for 30 min
PBS	Solarbio	P1010
Penicillin-Streptomycin (100×)	Yeasen	60162ES76	Antibiotic for cell culture; inhibits microbial contamination
Percoll (DG gradient stock	GE Healthcare	17-0891-09
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1)	Merck KGaA	77617	Reagent for protein removal during genomic DNA extraction
Protein Loading Buffer (6×)	Beyotime	P0015F	Protein electrophoresis loading buffer; formulation: 100 mM Tris (pH 6.8), 4% SDS, 2 mM EDTA, 2% glycerol, 6 M urea; mix with 50 μL 2 M DTT and 50 μL 5% bromophenol blue before use
Proteinase K	Merck KGaA	39450-01-6	200 mg dissolved in 10 mL ddH2O, used for protein digestion during genomic DNA extraction
PVDF Membrane	thermofisher	88518	Protein transfer membrane; activated with methanol for 1 min before use
RIPA Lysis Buffer	Yeasen	20101	Lysis buffer for sporozoite protein extraction
RNase A	Merck KGaA	9001-99-4	25 mg dissolved in 2.5 mL 0.01 mol/L NaAc, heated at 100°C for 10-15 min, pH adjusted to 7.4 with 1 mol/L Tris-HCl; used for RNA removal from DNA samples
SDS-PAGE Gel Reagents (Acrylamide, Bis-acrylamide, Tris, SDS, APS, TEMED)	Bio	101	Reagents for SDS-PAGE gel preparation; acrylamide concentration adjusted according to the molecular weight of the target protein
Sodium taurodeoxycholate hydrate	Sigma	T0875
solution)
Taq Master Mix (2×)	Vazyme	P112-01/02/03	PCR amplification premix containing Taq polymerase, dNTPs, etc.
Triton X-100 (0.25%)	Merck KGaA	9036	Cell permeabilization solution; incubate at room temperature for 30 min
Trypsin	Solarbio	T8150
Vortex Mixer	Beijing North TZ-Biotech	HQ-60-II
Water Bath Thermostat	Grant Instruments (Cambridge)	GD120,GM0815010