Articolo metodologico

Un metodo HPLC-QQQ-MS efficiente e rapido per la quantificazione degli alcaloidi tropani nelle piante medicinali

DOI:

10.3791/70510

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12 giugno 2026

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1College of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo studio ha sviluppato una cromatografia liquida ad alte prestazioni abbinata al metodo della spettrometria di massa a tripla quadrupola (HPLC-QQQ-MS) per identificare e quantificare gli alcaloidi tropani (iociammina, anisodamina, scopolamina) in Anisodus tanguticus. Il metodo si rivelò rapido, accurato e affidabile per l'analisi ad alto rendimento delle piante medicinali.

Abstract

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Anisodus tanguticus è una pianta medicinale tibetana importante. Gli alcaloidi tropani (TA), come iociaminamina, anisodamina e scopolamina, mostrano significative attività farmacologiche analgesiche e sedative, rendendo questa specie una preziosa fonte naturale per l'estrazione di questi composti bioattivi. Tuttavia, la composizione chimica di A. tanguticus è altamente complessia. Include un gran numero di composti senza strutture chiare, rendendo particolarmente importante l'identificazione sistematica e la caratterizzazione strutturale dei suoi costituenti attivi. Sebbene la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) sia stata ampiamente utilizzata per la separazione degli estratti da questo impianto, molti componenti sconosciuti restano difficili da identificare con precisione, anche con il confronto con database spettrali.

Questo studio ha stabilito un metodo analitico basato sulla cromatografia liquida ad alte prestazioni abbinata alla tripla spettrometria di massa quadrupolari (HPLC-QQQ-MS) per la determinazione degli alcaloidi tropani in A. tanguticus. Il metodo comprende una serie di procedure sistematiche, tra cui la preparazione standardizzata del campione, la configurazione dei parametri della spettrometria di massa, la pre-bilanciamento LC, l'istituzione del metodo, l'acquisizione di dati MS, la scansione della spettrometria di massa multistadio (MSⁿ) e l'interpretazione manuale dei dati. Utilizzando questa strategia, abbiamo identificato con successo tre alcaloidi rappresentativi di tropano in A. tanguticus: iosciamina, anisodamina e scopolamina. Inoltre, valida la precisione del metodo HPLC-QQQ-MS consolidato, confermando che il metodo è rapido, sensibile, fattibile e accurato per la determinazione quantitativa degli alcaloidi tropani (TA) in A. tanguticus. L'approccio consolidato dimostra buona versatilità e affidabilità, ed è adatto per l'identificazione ad alta produttività e la quantificazione degli alcaloidi tropani in A. tanguticus e altre piante medicinali.

Introduzione

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L'efficacia terapeutica della medicina tradizionale cinese (MTC) dipende in gran parte dai suoi metaboliti secondari, come alcaloidi, flavonoidi, terpenoidi e altri costituenti attivi 1,2,3. Di conseguenza, un'analisi qualitativa e quantitativa precisa e sensibile di metaboliti target specifici in queste miscele complesse è un passo chiave per garantire la qualità della MTC, chiarire la base materiale della sua efficacia e far progredire la ricercamoderna 3. Tuttavia, la diversità e complessità dei componenti della MTC, unite alle concentrazioni estremamente basse di molti ingredienti attivi chiave, presentano notevoli sfide per ottenere una rilevazione efficiente e accurata.

Anisodus tanguticus (Maxim.) Pascher rappresenta una delle principali fonti botaniche di alcaloidi tropani (TA)4, nota per il suo ricco contenuto di composti di tipo tropano farmacologicamenteattivi5. Gli alcaloidi caratteristici chiave includono anisodamina, scopolamina e iosciamina, che condividono un nucleo comune di tropani ma mostrano distinte sostituzioni di gruppi funzionali (Figura 1), portando a profili farmacologicidivergenti 6,7,8. Sebbene le loro somiglianze strutturali complichino la risoluzione cromatografica, offrono anche un modello prezioso per indagini comparative fitochimiche e metaboliche. Studi recenti hanno indagato la composizione chimica e le variazioni geografiche di A. tanguticus utilizzando approcci metabolomici e farmacologi di rete 9,10. Gli approcci analitici attuali per i metaboliti di A. tanguticus si basano prevalentemente sulla cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC)11. Tuttavia, i livelli di alcaloidi tropani nello stadio A. tanguticus in fase di piantina possono essere bassi fino allo 0,01% (una parte ogni diecimila), e i metodi convenzionali HPLC sono spesso vincolati da risoluzioni, sensibilità e capacità analitiche limitate. Queste limitazioni ostacolano la completa separazione degli omologhi alcaloidi strutturalmente analoghi e ostacolano il rilevamento dei costituenti tracce, compromettendo così l'accuratezza analitica e limitando il supporto per applicazioni di ricerca più avanzate. Negli ultimi anni, i progressi nell'HPLC uniti alla spettrometria di massa tandem hanno fornito strumenti potenti per affrontare questi colli di bottiglia analitici. In particolare, la cromatografia liquida ad alte prestazioni - spettrometria di massa quadrupolo triplo (HPLC-QQQ-MS), offre una risoluzione cromatografica notevolmente migliorata, efficienza di separazione e sensibilitàeccezionale 12,13,14. Questa tecnologia è emersa come una piattaforma all'avanguardia per l'indagine dei metaboliti secondari nella MTC, consentendo una qualificazione e quantificazione efficiente e accurata degli analiti target traccia all'interno di intricate matricibiologiche 11,15,16,17. In quanto tale, fornisce una solida base tecnica per una profilazione chimica completa e una valutazione della qualità di piante medicinali come A. tanguticus. In questo studio, affrontiamo le sfide persistenti nel rilevamento degli alcaloidi tropani in A. tanguticus, con particolare attenzione all'identificazione e quantificazione accurata dei costituenti a livello di tracce. Ottimizzando sistematicamente le condizioni cromatografiche e di spettrometria di massa, abbiamo sviluppato e validato un nuovo metodo HPLC-QQQ-MS per la determinazione simultanea di molteplici alcaloidi tropani principali. L'approccio ottimizzato migliora significativamente sensibilità, selettività e robustezza metodologica, superando così le limitazioni comuni associate agli saghi convenzionali basati sulla spettrometria di massa — come sensibilità inadeguata, effetti matriciali e interferenze di co-eluzione — spesso riscontrati durante l'analisi di composti alcaloidi traccia.

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Protocollo

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1. Preparazione del campione

  1. Preparazione di soluzioni standard
    1. Pesare con precisione 10,0 mg ciascuno degli standard di riferimento di iosciamina, anisodamina idrobromuro e scopolamina idrobromuro utilizzando un bilancio analitico da dieci millesimi, e posizionarli in fiaschette volumetriche separate da 10 mL, rispettivamente.
    2. Aggiungere metanolo di grado cromatografico alla linea contrassegnata e sciogliere accuratamente gli standard tramite trattamento ultrasonico per preparare soluzioni standard singole con una concentrazione di 1,0 mg/mL.
    3. Trasferisci le soluzioni di stock in bottiglie di reagenti marroni, conservale a 4 °C al buio.
      NOTA: Gli alcaloidi utilizzati sono altamente tossici. Prendi precauzioni di sicurezza quando manipolhi i campioni standard. Tutte le soluzioni venivano preparate frescamente prima dell'analisi e conservate a 4 °C al buio per evitare il degrado.
  2. Preparazione di soluzioni di lavoro misto
    1. Pipettare 100 μL di ciascuna soluzione di base in una fiaschetta volumetrica da 10 mL, e diluire fino alla linea segnata con metanolo di grado cromatografico per preparare una soluzione intermedia standard mista di 10 μg/mL.
    2. Secondo i requisiti dell'intervallo lineare, si diluisce ulteriormente la soluzione intermedia a passo in passo con metanolo per ottenere una serie di soluzioni di lavoro miste.
    3. Prendi rispettivamente 50 μL, 200 μL e 500 μL. Ottieni concentrazioni di 0,5 μg/mL, 2 μg/mL, 5 μg/mL e 10 μg/mL. Prepara tutto fresco prima di usarlo.
    4. Trasferire 100 μL della soluzione intermedia da 10 μg/mL in una fiaschetta volumetrica da 1 mL per preparare una soluzione diluita da 1 μg/mL.
    5. Successivamente, trasferire 100 μL della soluzione da 1 μg/mL in un'altra fiaschetta volumetrica da 1 mL e diluirla al volume con metanolo.
  3. Pretrattamento del campione
    1. Effettuare la liofilizzazione dei materiali freschi di Sophora flavescens e successivamente polverizzare in una polvere omogenea utilizzando un macinacaffè ad alta velocità.
    2. Setaccia la polvere con un setaccio standard da 0,25 mm. Pesa con precisione 20 mg di questa polvere, trasferiscila in una fiaschetta volumetrica da 100 mL e aggiungi metanolo di grado cromatografico quasi sulla linea segnata.
    3. Esegui l'estrazione ultrasonica a temperatura ambiente per 30 minuti. Dopo l'estrazione, estrai la fiaschetta volumetrica, lascia raffreddare a 25 °C a temperatura ambiente, rifornisci il metanolo di grado cromatografico fino alla linea segnata da 100 mL e miscela per 2 minuti.
    4. Pipettare 1 mL dell'estratto sopra citato in una fiaschetta volumetrica da 100 mL e diluire fino alla linea segnata con metanolo (diluizione 100 volte). Dopo aver agitato bene, funge da soluzione madre per l'iniezione di HPLC (Figura 2).
      NOTA: Quando si utilizza la macinatrice ad alta velocità, è essenziale indossare occhiali protettivi e una maschera antipolvere; Controlla la quantità di macinazione e la durata per evitare il surriscaldamento.
  4. Filtrazione e conservazione del campione
    1. Prepara una siringa usa e getta senza ago da 1 mL (specializzata in cromatografia, non adsorptiva) e una membrana microporosa in fase organica da 0,22 μm.
    2. Aspirare 1,2 mL della soluzione madre per l'iniezione e spingere lentamente per la filtrazione.
    3. Raccogli il filtrato successivo in una fiala campione da 2 mL con un inserto interno e sigilla ermeticamente con un tappo.
      NOTA: La frequenza del purificatore a ultrasuoni è fissata a 40 kHz. Evitare di allentare il tappo volumetrico durante l'estrazione per evitare la volatilizzazione del solvente. Regolare il fattore di diluizione in base alla risposta al picco del campione nel pre-esperimento per garantire che l'area di picco target rientri nell'intervallo lineare della curva standard. Tutti i campioni devono essere immediatamente conservati in frigorifero a 4 °C.

2. Prerun HPLC, creazione del metodo e acquisizione di MS

  1. Preparazione delle fasi mobili
    1. Preparare la fase mobile A: Misurare 1000 mL di acqua ultrapura, aggiungere 1,0 mL di acido formico di grado cromatografico (frazione volumetrica: 0,1% v/v) e mescolare uniformemente con un agitatore magnetico per 10 minuti.
    2. Preparare la fase mobile B: Utilizzare direttamente metanolo di grado cromatografico senza trattamenti aggiuntivi.
    3. Versare le fasi mobili A e B rispettivamente in dispositivi di degassaggio a ultrasuoni ed eseguire la degassazione ultrasonica a 40 kHz per 15 minuti.
    4. Trasferire immediatamente le fasi mobili degassate alle bottiglie di solvente dopo la degassazione, sigillarle e collegarle alle corrispondenti linee di solvente A e B del sistema HPLC.
      NOTA: Tutti i solventi sono di grado cromatografico e devono essere filtrati attraverso una membrana microporosa in fase organica di 0,45 μm prima dell'utilizzo. Monitora regolarmente la pressione del sistema. Se la fluttuazione di pressione supera il ±±5%, controlla eventuali ostruzioni della colonna o bolle d'aria nella tubazione.
  2. Impostazione delle condizioni HPLC
    1. Utilizzare una colonna C₁₈ (2,1 mm × 100 mm, 2,7 μm) per la separazione cromatografica. Bilanciare la colonna con metanolo:acqua = 80:20 (v/v) per 30 minuti prima dell'uso, con una portata di 0,3 mL/min durante l'equilibrio. Imposta la temperatura del forno a colonna a 30 °C e inizia a preriscaldare 10 minuti prima.
    2. Ottimizzare un programma di eluzione del gradiente come segue: 0–10,0 min, 5% - 10% B; 10,0–15,0 min, 10% al 35% B; 15,0–20,0 min, 35% al 60% B; 20,0–25,0 min, 60% - 95% B. Impostare la portata a 0,60 mL/min, il volume di iniezione a 2 μL e la lunghezza d'onda di rilevamento a 210 nm.
  3. Condizioni di spettrometria di massa
    1. Eseguire la rilevazione della spettrometria di massa (MS) utilizzando uno spettrometro di massa triplo quadrupolo (QQQ) dotato di una sorgente di ionizzazione elettrospray (ESI) che opera in modalità ionizzazione positiva (ESI+).
    2. Impostare i parametri operativi come segue: pressione del nebulizzatore: 15 psi; Tensione capillare: 4000 V; temperatura del gas: 300 °C; e portata di gas: 11 L/min.
    3. Ottimizza sistematicamente i parametri MS/MS per ogni analita.
      1. Innanzitutto, identificare ioni precursori infondendo direttamente singole soluzioni standard in modalità SCAN MS2 .
      2. Ottimizzare la tensione del frammentatore per ogni ione precursore fino all'intensità massima del segnale usando la modalità SIM MS2.
      3. Successivamente, si utilizza la modalità Product Ion Scan per determinare gli ioni prodotto caratteristici. Ottimizza sistematicamente l'Energia di Collisione (CE) per lo ione precursore al fine di massimizzare l'intensità del segnale prodotto-ione.
      4. Seleziona lo ione prodotto più intenso per la quantificazione e usa il secondo ione più intenso per la conferma qualitativa.
        NOTA: Identificare ioni precursori tramite infusione diretta di singole soluzioni standard in modalità SCAN MS2. Assicurarsi che la concentrazione standard della soluzione sia appropriata per evitare la saturazione del segnale. Calibra regolarmente lo strumento per evitare la deriva dei parametri.
  4. Validazione del metodo
    1. Specificità
      1. Iniettare solvente bianco (metanolo), miscelare soluzione di lavoro standard e campionare separatamente l'estratto, confrontando i cromatogrammi.
      2. Assicurarsi che siano soddisfatti i seguenti requisiti: Nessun picco interferente nel solvente a vuoto; il tempo di conservazione dei componenti target nel campione è coerente con quello dello standard (deviazione ≤ ±±0,1 min); Il rapporto di area di picco tra ione quantificatore e ione qualificatore è conforme a quello dello standard (deviazione ≤ ±±10%).
    2. Linearità
      1. Iniettare la serie di soluzioni di lavoro miste preparate nello step 1.1 (0,1, 0,5, 2, 5, 10 μg/mL) in sequenza nelle suddetta condizioni HPLC-MS, con 3 iniezioni per concentrazione.
      2. Traccia la curva standard con la concentrazione (x, μg/mL) di ogni componente come l'ascissa e l'area media di picco (y) dello ione quantificatore come l'ordinata. Eseguire un'analisi di regressione lineare, richiedendo un coefficiente di correlazione (R2) ≥ 0,995.
    3. Precisione e accuratezza
      1. Precisione intraday (ripetibilità): Analizzare 6 repliche di campioni di controllo qualità (QC) a tre livelli di concentrazione (2 μg/mL, 5 μg/mL e 10 μg/mL) entro un solo giorno e calcolare la deviazione standard relativa (RSD%).
      2. Precisione intergiornata (precisione intermedia): Preparare indipendentemente i campioni di controllo qualità dallo stesso lotto di materia prima vegetale essiccata e analizzarli da diversi operatori per tre giorni consecutivi. e calcolare la RSD%. Assicurati RSD% ≤ 10% per entrambi.
      3. Valuta l'accuratezza utilizzando un test di recupero a picco ed esprimi come tasso di recupero (%). Assicurarsi che il tasso medio di recupero di bassa, media e alta concentrazioni vari dall'85% al 115%, con RSD% ≤ 5%.
        NOTA: L'intervallo lineare deve coprire l'intervallo di concentrazione atteso dei componenti target nei campioni reali (inclusi livelli bassi, medi e alti) per riflettere l'applicabilità pratica. Tutti gli esperimenti di validazione sono stati eseguiti in triplice e i risultati sono stati espressi come valore medio.

3. Acquisizione dati

  1. Effettuare l'acquisizione dati in modalità monitoraggio delle reazioni multiple (MRM). Consulta la Tabella 1 per i parametri MRM ottimizzati - inclusi ioni precursori, transizioni ioniche prodotto, tensione del frammentatore e energia di collisione (CE) - per ogni analita.
  2. Calcola il tempo di permanenza per garantire un numero adeguato di punti dati su ogni picco cromatografico per ogni transizione, mantenendo un tempo di ciclo adeguato.

4. Analisi dei dati

  1. Avvia il software di analisi qualitativa, clicca su File > Importa dati e importa tutti i file di dati raccolti (formato .d).
  2. Estrazione dei cromatogrammi ionici estratti (EIC): Nel modulo di quantificazione , seleziona MRM Transition, inserisci le coppie ionico-prodotto precursore di ciascun componente ed estrai i corrispondenti EIC.
  3. Validazione e integrazione dei picchi: Verifica la simmetria dei picchi e la coerenza temporale di ritenzione (deviazione ≤ ±±0,1 min rispetto allo standard) dei picchi target in ciascuna EIC.
  4. Il software esegue l'integrazione automatica di default; Se esistono deriva di base o picchi interferenti, si aggiustano manualmente i parametri di integrazione (punti di inizio e fine dell'integrazione) per garantire un'integrazione accurata.
  5. Calcola la concentrazione di ogni componente in campioni sconosciuti utilizzando la curva standard. Clicca su Report > Genera report, seleziona il formato Excel per esportare il report. Il rapporto include il nome del composto, il tempo di conservazione, l'area di picco, la concentrazione, la RSD%, ecc.

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Risultati

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Separazione cromatografica HPLC-QQQ-MS e identificazione delle TA
Un tipico cromatogramma MRM ottenuto dall'analisi di una miscela standard e di un estratto di radice di A. tanguticus è presentato nelle Figure 3 e 4. Nelle condizioni ottimizzate dell'HPLC, tutti e tre gli alcaloidi tropani bersaglio: iociamina, anisodammina e scopolamina, sono stati separati con successo entro 20 minuti, dimostrando ...

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Discussione

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Con il crescente interesse per i metaboliti secondari delle piante, le tecniche analitiche per la rilevazione degli alcaloidi hanno attirato notevole attenzione. Sebbenesia stato stabilito un sistema cromatografico fondamentale per l'analisi degli alcaloidi tropani (TA), i recenti progressi, come l'adozione dell'elettroforesi capillare (CE), il miglioramento delle prestazioni strumentali in GC–MS e HPLC–MS, e l'identificazione di nuovi composti strutturali tra cui...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è supportato dall'Amministrazione Provinciale di Medicina Tradizionale Cinese del Sichuan (n. 2024MS562) e dal Programma di Talenti Xinglin dell'Università di Chengdu della MTC (n. MPRC2022035). Abbiamo davvero apprezzato il sostegno dell'Istituto Innovativo di Medicina e Farmacia Cinese, Università di Medicina Tradizionale Cinese di Chengdu.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Agilent MassHunter softwareAgilent Technologies
Agilent ZORBAX SB-C18 columnAgilent Technologies880975-902C18 reversed-phase column, 4.6 × 250 mm, 5 μm
Anisodamine hydrobromideChengdu glip Biotechnology Co., Ltd101-31-5HPLC>98%
Formic AcidSigma-Aldrich5.33002
freeze dryerEYELA, Tokyo, JapanFDU-2110
High-speed universal grinderTaisite Instrument Co., Ltd., Tianjin, China6010210100FW-100,24,000 rpm, 100 g capacity, 80 mesh
HyoscyamineChengdu glip Biotechnology Co., Ltd55449-49-5HPLC>98%
MethanolThermo Fisher Scientific022909.K2
Microporous Membrane 0.22μmMilliporeSLGV033RB
Milli-Q Direct 8 water systemMilliporeSigma, Burlington, MA, USAZRQSVP0JP
Scopolamine hydrobromideChengdu glip Biotechnology Co., Ltd114-49-8HPLC>98%

Riferimenti

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