Method Article

Generazione e analisi trascriromica unicellulare degli organoidi del carcinoma epatocellulare dopo il trattamento farmacologico

DOI:

10.3791/70511

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May 26th, 2026

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1School of Basic Medical Science, Guangzhou Medical University, 2Guangzhou Municipal and Guangdong Provincial Key Laboratory of Protein Modification and Degradation, Guangzhou Medical University, 3Affiliated Cancer Hospital and Institute, Guangzhou Medical University, 4The First Clinical School of Guangzhou Medical University, Guangzhou Medical University, 5Department of Obstetrics, Guangzhou Eighth People's Hospital, Guangzhou Medical University, 6Department of Pediatric Surgery, Guangzhou Institute of Pediatrics, Guangzhou Women and Children's Medical Center, Guangzhou Medical University

In This Article

Summary

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Questo protocollo delinea un metodo semplificato per generare organoidi del carcinoma epatocellulare, applicare trattamenti farmacologici ed eseguire sequenziamento dell'RNA a singola cellula prima e dopo il trattamento per caratterizzare i cambiamenti trascrizionali associati al tratto.

Abstract

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Il carcinoma epatocellulare è una delle principali cause di mortalità correlata al cancro a livello mondiale ed è caratterizzato da una marcata eterogeneità intratumorale, che contribuisce a risposte terapeutiche variabili, ricurrenza tumorale e progressione della malattia. Una comprensione più profonda di come le cellule tumorali cambiano a livello trascrizionale prima e dopo il trattamento farmacologico è quindi essenziale per migliorare le strategie terapeutiche. Tuttavia, i flussi di lavoro sperimentali pratici che collegano il trattamento farmacologico a base di organoidi al profiling trascritomico a singola cellula a valle rimangono limitati. In questo studio, viene sviluppato un flusso di lavoro standardizzato per generare organoidi del carcinoma epatocellulare, applicare trattamenti farmacologici definiti e eseguire il sequenziamento dell'RNA a singola cellula su campioni raccolti prima e dopo il trattamento. Il protocollo include la rinascita e l'espansione degli organoidi, la valutazione della qualità pre-trattamento, l'esposizione ai farmaci, la preparazione degli organoidi per la dissociazione a singola cellula, la costruzione della libreria e l'analisi comparativa di base dei dati trascrivomici a singola cellula. Vengono prese precauzioni tecniche critiche per migliorare la riproducibilità e la qualità del campione. Questo flusso di lavoro consente la caratterizzazione fianco a fianco della composizione cellulare e dei cambiamenti trascrizionali associati al trattamento farmacologico negli organoidi del carcinoma epatocellulare. Il protocollo è robusto, scalabile e adattabile tra diversi sistemi organoidi, offrendo una piattaforma pratica per indagare i cambiamenti di espressione genica associati al trattamento a risoluzione cellulare singola.

Introduction

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Il carcinoma epatocellulare (HCC) è il cancro epatico primario più comune negli adulti e una delle principali cause di decessi correlate al cancro in tutto il mondo 1,2,3. Il suo esito clinico scarso è dovuto a una significativa eterogeneità intratumorale, che porta a resistenza al trattamento erecidiva 4. Uno studio recente indica che la diversità dello sviluppo e la plasticità dello stato cellulare guidate da programmi trascrizionali chiave come l'asse FOXM1/CEBPB contribuiscono alla resistenza terapeutica in

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Protocol

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Gli studi che utilizzavano tessuti umani sono stati esaminati e approvati dai Comitati per la Revisione Etica della Ricerca dell'Università Medica di Guangzhou (approvazione n. GYZL-2024-KY31). Tutte le procedure che coinvolgevano campioni umani sono state condotte in conformità con le linee guida istituzionali per la ricerca sull'uomo. È stato ottenuto il consenso informato scritto da tutti i pazienti per l'uso dei loro campioni clinici a scopo di ricerca medica. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

Questo flusso di lavoro include il recupero e....

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Results

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La Figura 1 delinea la generazione e la caratterizzazione degli organoidi del carcinoma epatocellulare (HCC). Nella Figura 1A, tessuti tumorali derivati dal paziente sono stati utilizzati per stabilire colture organoidi per analisi istologiche e studi terapeutici. La Figura 1B mostra immagini in campo chiaro degli organoidi nei giorni 1 e 6 dopo il recupero, dimostrando sopravvivenza ed espansione s.......

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Discussion

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Per garantire riproducibilità, efficienza e un'analisi trascritomica a singola cellula di alta qualità, diversi passaggi tecnici in questo flusso di lavoro richiedono un controllo attento. La coerenza durante il rinascimento e l'espansione degli organoidi HCC derivati dal paziente è essenziale, poiché variazioni nella densità di semina, nella composizione della matrice della membrana basale e nel tempismo della coltura possono influenzare la morfologia organoide, la crescita e le rispost.......

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Disclosures

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Acknowledgements

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Questa ricerca è stata sostenuta dalla National Natural Science Foundation of China (82303022; 82122048; 82372714; 82203380), dalla Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2023A1515011416) e dalla Guangzhou Basic and Applied Basic Research Foundation (2024A04J6575). Alcuni elementi schematici sono stati creati utilizzando Home for Researchers (https://www.home-for-researchers.com) e sono stati adattati dagli autori. Le illustrazioni schematiche sono state create utilizzando Figdraw (https://www.figdraw.com) e sono state adattate dagli autori.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
[Leu15]-gastrina I umanoMerckG9145
Microtubi da 1,5 mLMerckAXYMCT150LC
1X Buffer di Lisi RBCThermo Fisher Scientific00-4333-57
Fiale criogeniche Intern Thread da 2,0 mlNido607001
A8301 (inibitore TGFb)Tocris Bioscienza2939
Anticorpo policlonale AFPProteintech14550-1-AP
Anticorpo anti-albumina [ALB/2144]abcamab236492
Anticorpo anti-HNF-4-alfa [EPR16885] - Grado ChIPabcamab181604
Anticorpi anti-prealbumina [EPR3219]abcamab92469
Anticorpo anti-SOX9 [EPR14335-78]abcamab185966
Integratore B27 (503), meno vitamina AThermo Fisher Scientific12587010
Soluzione di recupero cellulare, 100 mLCorning354253Reagente usato per sciogliere la matrice di membrana basale e recuperare gli organoidi prima della riplaccatura o del processo a valle
CellTiter-Glo®   Test di Viabilità delle Celle 3DPromegaG9681
CHIR99021MerckSML1046
Chromium Next GEM Single Cell 3' GEM, Biblioteca & Biblioteca Kit per perline in gel v3.110x GenomicaCG000227
Colino per cellule di Corning, 40 e mu; m, Blue, S, IND, 1/50Corning431750
Piastre Costar a 24 pozzi trasparenti con fondo piatto e ultra basso con attacco multiplo a pozzetti, avvolte singolarmente, steriliCorning3473
Cultrex Fattore di Crescita Ridotto BME, PathClear di Tipo 2 (BME)Merck3533-005-02Matrice extracellulare utilizzata per supportare la coltura organoide tridimensionale e la formazione di cupole
DMSOMerckC6164Solvente utilizzato per preparare soluzioni per il materiale di droga e il controllo dei veicoli
Eagle Medium Modificato di Dulbecco/F-12 di HamThermo Fisher Scientific12634028DMEM/F-12 avanzato
E7080 (Lenvatinib)SelleckS1164Inibitore della tirosina chinasi utilizzato per il trattamento organoide e la perturbazione terapeutica
Valore del siero bovino fetale FBSGibcoA5256701
ForskolinTocris Bioscienza1099
Integratore GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061
Kit per la colorazione di ematossilina ed eosinaBeyotimeC0105S
HEPES, 1 MThermo Fisher Scientific15630080
Microscopio motorizzato a fluorescenza Leica DM6 BLeicaN/A
Supplemento N2 (1003)Thermo Fisher Scientific17502048
N-acetilcisteinaMerckA0737-5MG
NicotinamideMerckN0636
Tubi centrifughe in polipropilene sterili conici Nunc da 15 mLThermo Fisher Scientific339651
Penicillina/streptomicina (10.000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
Soluzione salina tamponata con fosfatoGENOM BIOGNM20012Tampone utilizzato per lavare organoidi e preparare campioni per il trattamento a valle
EGF umano ricombinantePeprotechAF-100-15
FGF10 umano ricombinantePeprotech100-26
HGF umano ricombinantePeprotech100-39
Noggin umano ricombinantePeprotech120-10C
Inibitore della rho chinasi Y-27632 diidrocloruroMerckY0503Inibitore ROCK usato per aumentare la sopravvivenza degli organoidi dopo lo scongelamento o il passaggio
Mezzo condizionato R-spodin1(Broutier et al.)N/ASecrezione delle linee cellulari
Trypan Blue Stain, 0,4% filtrato a membrana Preparato in soluzione salina allo 0,85%Gibco15250061
Enzima TrypLE Express (1x), nessun fenolo rossoThermo Fisher Scientific12604013Sostituto della tripsina
Wnt-3a - mezzo condizionato(Broutier et al.)N/ASecrezione delle linee cellulari

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Hepatocellular Carcinoma OrganoidsSingle Cell RNA SequencingDrug Treatment ResponseOrganoid Drug ScreeningOrganoid DissociationCell Viability AssayOrganoid Morphology AnalysisGene Expression ProfilingTumor HeterogeneityPathway Enrichment Analysis

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