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Articolo metodologico

Generazione e analisi trascriromica unicellulare degli organoidi del carcinoma epatocellulare dopo il trattamento farmacologico

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DOI:

10.3791/70511

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26 maggio 2026

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1School of Basic Medical Science, Guangzhou Medical University, 2Guangzhou Municipal and Guangdong Provincial Key Laboratory of Protein Modification and Degradation, Guangzhou Medical University, 3Affiliated Cancer Hospital and Institute, Guangzhou Medical University, 4The First Clinical School of Guangzhou Medical University, Guangzhou Medical University, 5Department of Obstetrics, Guangzhou Eighth People's Hospital, Guangzhou Medical University, 6Department of Pediatric Surgery, Guangzhou Institute of Pediatrics, Guangzhou Women and Children's Medical Center, Guangzhou Medical University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo delinea un metodo semplificato per generare organoidi del carcinoma epatocellulare, applicare trattamenti farmacologici ed eseguire sequenziamento dell'RNA a singola cellula prima e dopo il trattamento per caratterizzare i cambiamenti trascrizionali associati al tratto.

Abstract

Il carcinoma epatocellulare è una delle principali cause di mortalità correlata al cancro a livello mondiale ed è caratterizzato da una marcata eterogeneità intratumorale, che contribuisce a risposte terapeutiche variabili, ricurrenza tumorale e progressione della malattia. Una comprensione più profonda di come le cellule tumorali cambiano a livello trascrizionale prima e dopo il trattamento farmacologico è quindi essenziale per migliorare le strategie terapeutiche. Tuttavia, i flussi di lavoro sperimentali pratici che collegano il trattamento farmacologico a base di organoidi al profiling trascritomico a singola cellula a valle rimangono limitati. In questo studio, viene sviluppato un flusso di lavoro standardizzato per generare organoidi del carcinoma epatocellulare, applicare trattamenti farmacologici definiti e eseguire il sequenziamento dell'RNA a singola cellula su campioni raccolti prima e dopo il trattamento. Il protocollo include la rinascita e l'espansione degli organoidi, la valutazione della qualità pre-trattamento, l'esposizione ai farmaci, la preparazione degli organoidi per la dissociazione a singola cellula, la costruzione della libreria e l'analisi comparativa di base dei dati trascrivomici a singola cellula. Vengono prese precauzioni tecniche critiche per migliorare la riproducibilità e la qualità del campione. Questo flusso di lavoro consente la caratterizzazione fianco a fianco della composizione cellulare e dei cambiamenti trascrizionali associati al trattamento farmacologico negli organoidi del carcinoma epatocellulare. Il protocollo è robusto, scalabile e adattabile tra diversi sistemi organoidi, offrendo una piattaforma pratica per indagare i cambiamenti di espressione genica associati al trattamento a risoluzione cellulare singola.

Introduzione

Il carcinoma epatocellulare (HCC) è il cancro epatico primario più comune negli adulti e una delle principali cause di decessi correlate al cancro in tutto il mondo 1,2,3. Il suo esito clinico scarso è dovuto a una significativa eterogeneità intratumorale, che porta a resistenza al trattamento erecidiva 4. Uno studio recente indica che la diversità dello sviluppo e la plasticità dello stato cellulare guidate da programmi trascrizionali chiave come l'asse FOXM1/CEBPB contribuiscono alla resistenza terapeutica inHCC 5. Questi risultati evidenziano la necessità di comprendere come le popolazioni di cellule tumorali si adattino e si trasformino in uno stato di pressione terapeutica sostenuta. Tuttavia, la maggior parte dei modelli preclinici non cattura adeguatamente la natura dinamica e continua di queste transizioni di stato associate al trattamento, limitando l'indagine meccanicistica sull'adattamento tumorale e il fallimento terapeutico.

Gli organoidi derivati dal paziente (PDO) forniscono una piattaforma utile a questo scopo perché preservano importanti alterazioni genomiche e l'eterogeneità cellulare del tumoreoriginale 6. Gli organoidi HCC possono essere mantenuti in coltura a lungo termine mantenendo le caratteristiche chiave deltessuto 7, rendendoli particolarmente adatti agli studi di risposta al trattamento. Inoltre, studi basati su organoidi hanno dimostrato la fattibilità dell'uso di organoidi per il cancro al fegato per test farmacologici e per catturare differenze interpazienti e intratumorali nella sensibilità terapeutica, supportandone il valore come modelli preclinici per la ricercaterapeutico-risposta 8,9. Tuttavia, la maggior parte degli studi farmacologici basati su organoidi si basa ancora principalmente su misurazioni di vitalità degli endpoint o si concentra principalmente sulle risposte fenotipiche di massa, fornendo così solo informazioni limitate sulle risposte cellulari eterogenee e sui cambiamenti trascrizionali associati al trattamento. Parallelamente, lo sviluppo rapido di strategie terapeutiche basate su RNA per l'HCC sottolinea ulteriormente la necessità di sistemi preclinici in grado di prevedere e dissezionare meccanicamente le risposte terapeutiche a risoluzioneunicellulare 10.

Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) consente la caratterizzazione ad alta risoluzione della composizione cellulare e degli stati trascrizionali all'interno dei modelliorganoidi 11. Quando applicato agli organoidi raccolti prima e dopo il trattamento, scRNA-seq può rivelare cambiamenti nell'espressione genica, cambiamenti nelle popolazioni cellulari e risposte eterogenee che non vengono catturate dai test di massa. Questo approccio rappresenta quindi una strategia pratica e potente per indagare il rimodellamento trascrizionale associato al trattamento negli organoidi HCC. Tuttavia, manca un flusso di lavoro pratico e riproducibile che integri la coltura organoide HCC, il trattamento farmacologico e il sequenziamento dell'RNA monocellulare pre e post-trattamento. Un tale flusso di lavoro è più efficace quando l'integrità organoide viene mantenuta durante l'esposizione al farmaco e si recuperano cellule sufficienti vitali per la profilazione a valle delle singole cellule. Come per altri approcci basati su organoidi, le limitazioni importanti includono una rappresentazione incompleta delle componenti stromali, vascolari e immunitarie del microambiente tumorale, nonché il potenziale bias di selezione durante una prolungata coltura in vitro.

Viene descritto un flusso di lavoro sperimentale integrato per la generazione di organoidi HCC, l'applicazione di trattamenti farmacologici definiti e l'elaborazione dei campioni di organoidi per il sequenziamento di RNA a singola cellula prima e dopo il trattamento. Questo flusso comprende la rinascita e l'espansione degli organoidi, la valutazione della qualità pre-trattamento, l'esposizione controllata ai farmaci e il sequenziamento a valle dell'RNA a singola cellula di campioni abbinati. L'approccio fornisce un quadro pratico per confrontare, a risoluzione cellulare singola, i cambiamenti associati al trattamento nella composizione cellulare e nei programmi di espressione genica negli organoidi HCC.

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Protocollo

Gli studi che utilizzavano tessuti umani sono stati esaminati e approvati dai Comitati per la Revisione Etica della Ricerca dell'Università Medica di Guangzhou (approvazione n. GYZL-2024-KY31). Tutte le procedure che coinvolgevano campioni umani sono state condotte in conformità con le linee guida istituzionali per la ricerca sull'uomo. È stato ottenuto il consenso informato scritto da tutti i pazienti per l'uso dei loro campioni clinici a scopo di ricerca medica. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

Questo flusso di lavoro include il recupero e l'espansione degli organoidi del carcinoma epatocellulare criopreservato, con lievi adattamenti per perturbazioni terapeutiche a valle e sequenziamento dell'RNA a singola cellula. L'obiettivo è generare colture organoidi di qualità e coerenza sufficienti per i successivi esperimenti di trattamentofarmacologico 12.

1. Istituzione ed espansione degli organoidi derivati dal paziente con HCC

  1. Scongelamento e recupero degli organoidi criopreservati
    1. Preparazione prima dello scongelamento
      1. Preriscalda un bagno d'acqua a 37 °C. Pre-bilanciare una piastra a 24 pozzi in un incubatore a 37 °C per almeno 1 ora prima della placcatura.
      2. Prepara in anticipo un mezzo completo per la coltura organoide e tieni l'estratto della membrana basale (BME) sul ghiaccio fino all'uso. La composizione del mezzo completo di coltura organoide è fornita nella Tabella Supplementare 1.
    2. Scongelamento degli organoidi
      1. Rimuovere i cryovial contenenti organoidi HCC congelati dalla stoccazione di azoto liquido e metterli immediatamente in un bagno d'acqua a 37 °C.
      2. Agita delicatamente la fiala e smetti di scongelare quando rimane solo un piccolo cristallo di ghiaccio.
    3. Rimozione del crioprotettore
      1. Pipetta delicatamente la sospensione scongelata una volta per risospendere il contenuto.
      2. Trasferire la sospensione in un tubo conico da 15 mL contenente 3–5 mL di mezzo organoide completo per la coltura.
      3. Centrifuga a 300 × g per 5 minuti a 4 °C. Aspirare con cura e scartare il surnatante senza disturbare il pellet.
  2. Incorporazione e riplaccatura degli organoidi
    1. Preparazione della miscela di recupero
      1. Risospendere il pellet organoide in un mezzo completo di coltura organoide. La composizione del mezzo completo di coltura organoide è fornita nella Tabella Supplementare 1.
      2. Mescola delicatamente con un volume uguale di BME ghiacciato per ottenere la miscela di impiccatura.
        NOTA: Mantenere la miscela sul ghiaccio per prevenire una polimerizzazione prematura.
    2. Placcatura delle cupole organoidi
      1. Dispensare 50 μL della miscela organoide-matrice in ciascun pozzo di una piastra preriscaldata a 24 pozzi.
      2. Incubare a 37 °C per 30 minuti per permettere la solidificazione della matrice.
      3. Aggiungere 500 μL di mezzo organoide completo integrato con 20 μM Y-27632 a ciascun pozzo lungo la parete del pozzo.
        NOTA: Limita l'uso di Y-27632 ai primi 2–3 giorni dopo lo scongelamento o il passaggio di scongelamento. Assicurati che ogni cupola rimanga compatta e fissata al fondo del pozzo, senza espandirsi verso l'esterno.
  3. Cultura organoide ed espansione
    1. Condizioni della coltura di recupero
      1. Mantenere gli organoidi a 37 °C con il 5% diCO2.
      2. Utilizzare un mezzo contenente 20 μM Y-27632 durante i primi 2–3 giorni dopo lo scongelamento.
    2. Sostituzione media
      1. Sostituisci il substrato di coltura ogni 3–4 giorni usando un'aspirazione delicata.
      2. Aggiungi un nuovo substrato lungo la parete di ogni pozzo per evitare di disturbare le cupole della matrice.
      3. Mantenere lo stesso schema di sostituzione del mezzo su tutti i pozzi all'interno dello stesso esperimento.
    3. Monitoraggio della crescita
      1. Monitorare il recupero e l'espansione degli organoidi utilizzando un microscopio a campo chiaro con impostazioni di imaging coerenti.
      2. Registra immagini rappresentative in momenti temporali definiti durante il recupero e l'espansione.
      3. Confermare il recupero riuscito quando la maggior parte delle strutture rimane intatta, gli organoidi mostrano una morfologia rotonda o ovale con bordi lisci, si osserva un ingrossamento progressivo nel tempo e sono presenti detriti o strutture collassate minime.
      4. Escludere pozzi contenenti meno di 10 organoidi intatti dall'analisi quantitativa a valle.
    4. Criteri di approvazione e espansione
      1. Si osservano organoidi di passaggio dopo un'espansione stabile.
      2. Confermare l'espansione stabile tramite aumenti riproducibili della dimensione organoide o dell'area totale con morfologia preservata.
      3. Utilizzare criteri coerenti di intervallo di imaging, ingrandimento e inclusione tra gli esperimenti.
      4. Generare curve di crescita rappresentative basate sull'area o sul conteggio dell'organoide per confermare la stabilità.
    5. Criteri per esperimenti a valle
      1. Utilizzare linee organoidi che presentino una crescita tridimensionale stabile, non presentino contaminazione o collasso esteso, e offrano una resa sufficiente per condizioni sperimentali parallele.
      2. Mantenere le colture per almeno 7–10 giorni dopo lo scongelamento o fino al completamento del recupero e di un ciclo di espansione.
      3. Avanzare solo linee organoidi che mostrano morfologia consistente tra i pozzi replicati.

2. Preparazione di organoidi per la perturbazione terapeutica

  1. Valutazione della qualità pre-trattamento
    1. Valutazione basata sulla morfologia
      1. Conferma che gli organoidi sono morfologicamente rotondi o ovali.
      2. Conferma che gli organoidi presentino bordi lisci e ben definiti.
      3. Conferma la presenza minima di detriti cellulari all'interno della cupola.
      4. Escludere colture con frammentazione estesa, lumen scuriti, collasso diffuso o contaminazione evidente.
    2. Valutazione dello stato di espansione
      1. Utilizzare solo colture organoidi che abbiano completato il recupero ed entrato in un'espansione stabile.
      2. Conferma l'ingrandimento progressivo nel tempo.
      3. Confermare la morfologia coerente tra i pozzi replicati.
  2. Riplaccatura degli organoidi per il trattamento farmacologico
    1. Recupero degli organoidi dalla matrice
      1. Sciogliere le cupole organoidi sul ghiaccio usando 1 mL di soluzione di recupero delle cellule gelate per pozzo per 15–20 minuti.
      2. Pipetta delicatamente ogni 5 minuti durante l'incubazione.
      3. Centrifugare la sospensione recuperata a 300 × g per 5 minuti a 4 °C.
      4. Risospendere il pellet in un mezzo di coltura organoide completo.
    2. Standardizzazione prima della ripiacciatura
      1. Standardizzare il carico organoide iniziale tra i pozzi prima del trattamento farmacologico.
      2. Determina il numero cellulare vitale dopo una dissociazione parziale quando possibile.
      3. Normalizzare i campioni allo stesso numero di celle di ingresso per pozzo.
      4. Placca circa 1.000–5.000 celle vitali per pozzo in un formato a 24 pozzi.
      5. Se non viene effettuato il conteggio diretto delle cellule, si normalizza assicurando un numero comparabile di organoidi morfologicamente intatti per ogni pozzo e una distribuzione di dimensioni simile tra i gruppi.
      6. Registra il numero iniziale di organoidi e la morfologia di base per ciascun bene prima del trattamento.
      7. Utilizzare criteri di inclusione e strategia di impiacciatura identici su tutti i pozzi all'interno dello stesso esperimento.
    3. Riplaccatura per il trattamento farmacologico
      1. Mescolare organoidi recuperati con matrice di membrana basale gelida a una concentrazione finale del 30%–50%.
      2. Distribuire cupole di 50 μL in ciascun pozzo di una piastra a 24 pozzi.
      3. Incubare a 37 °C per 30 minuti per permettere la polimerizzazione.
      4. Aggiungere 500 μL di coltura organoide completa per pozzo lungo la parete del pozzo.
        NOTA: Assicurarsi che ogni cupola rimanga compatta e fissata al fondo del pozzo, senza espandirsi verso l'esterno. Utilizzare lo stesso volume della cupola e concentrazione della matrice su tutti i pozzi all'interno dello stesso esperimento.
  3. Recupero prima del trattamento farmacologico
    1. Recupero dopo la ripiastratura
      1. Permettere agli organoidi di riprendersi durante la notte in condizioni di coltura standard.
      2. Iniziare il trattamento solo dopo che la morfologia intatta è stata ristabilita all'interno delle cupole riplaccate.
    2. Criteri di ingresso per il trattamento delle droghe
      1. Iniziare il trattamento farmacologico solo quando gli organoidi rimangono intatti dopo la riplaccazione, non è presente un collasso diffuso o detriti eccessivi e il carico organoide è comparabile tra i pozzi.
      2. Registra immagini di base in campo chiaro per tutti i gruppi sperimentali prima del trattamento.
      3. Mantenere lo stesso carico organoide iniziale, tempo di recupero dopo la riplaccatura e tempo di inizio del trattamento su tutti i pozzi di controllo e trattati.
  4. Considerazioni sulla sicurezza
    1. Eseguire tutte le procedure che coinvolgono organoidi di origine umana utilizzando le appropriate attrezzature di protezione individuale e pratiche di biosicurezza.
    2. Maneggia con attenzione i reagenti enzimatici, dissociando, per evitare l'esposizione di pelle o occhi.
    3. Smaltire i rifiuti biologici liquidi e solidi secondo le normative istituzionali sulla biosicurezza.

3. Trattamento farmacologico degli organoidi HCC

  1. Preparazione e trattamento dei farmaci
    1. Preparazione dei farmaci
      1. Prepara la soluzione di stock lenvatinib in DMSO secondo le istruzioni del produttore.
      2. Diluire la soluzione di stocco in un mezzo di coltura preriscaldato immediatamente prima dell'uso fino alla concentrazione di lavoro predefinita.
      3. Mantenere la stessa concentrazione finale di DMSO su tutti i pozzi (≤ 0,1%).
      4. Prepara un volume sufficiente per garantire un volume finale di trattamento uguale in ogni pozzo.
    2. Trattamento farmacologico
      1. Aggiungere un mezzo contenente lenvatinib (20 μM) lungo la parete di ciascun pozzo per evitare di disturbare le cupole della matrice.
      2. Includere un controllo veicolo con la stessa concentrazione finale di DMSO.
      3. Incubare gli organoidi in condizioni di coltura standard per il periodo di trattamento predefinito.
      4. Sostituire il mezzo contenente farmaci ogni 48–72 ore per durate di trattamento superiori a 72 ore.
      5. Utilizzare lo stesso programma di sostituzione del mezzo su tutti i pozzi all'interno dell'esperimento.
      6. Registra immagini di base in campo chiaro prima del trattamento.
      7. Acquisire immagini a intervalli fissi durante il trattamento utilizzando le stesse impostazioni del microscopio, ingrandimento e posizioni di campo.
  2. Valutazione della risposta al trattamento
    1. Valutazione basata sulla morfologia
      1. Valutare la risposta al trattamento utilizzando le seguenti letture basate su immagini: curva di crescita dell'area organoide, diametro medio degli organoidi e conteggio degli organoidi sopravvissuti.
      2. Usa impostazioni di esposizione, ingrandimento e soglie di analisi identiche per tutte le immagini.
      3. Misura la curva di crescita dell'area organoide calcolando l'area organoide totale per pozzo o campo in ogni punto temporale e normalizzando alla linea di base.
      4. Misurare il diametro medio dell'organoide determinando il diametro dei singoli organoidi intatti e calcolando il valore medio per pozzo.
      5. Determinare il conteggio degli organoidi sopravvissuti contando organoidi intatti morfologicamente identificabili ed escludendo detriti e frammenti collassati.
    2. Misurazione opzionale della vitalità
      1. Eseguire un test tridimensionale di viabilità della luminescenza al punto finale del trattamento se è necessaria una valutazione aggiuntiva della vitalità in massa.
      2. Segui le istruzioni del produttore per l'esecuzione del saggio.
  3. Analisi dei dati
    1. Traccia le curve di crescita dell'area organoide nel tempo.
    2. Confrontare il diametro medio degli organoidi tra i gruppi trattati con veicoli e quelli trattati con lenvatinib.
    3. Confronta i conteggi di organoidi sopravvissuti tra i gruppi di trattamento.
    4. Applicare schemi identici di acquisizione delle immagini, criteri di inclusione degli organoidi e parametri di analisi in tutti i gruppi per garantire la riproducibilità.

4. Preparazione di organoidi per il sequenziamento di RNA a singola cellula

  1. Selezione e recupero degli organoidi
    1. Valutazione pre-dissociazione
      1. Alcuni pozzi organoidi selezionati che presentano una morfologia tridimensionale intatta senza collasso diffuso, contengono materiale sufficiente per la cattura a valle di una singola cellula e non mostrano contaminazioni evidenti.
      2. Raccogliere organoidi in punti temporali sperimentali corrispondenti tra campioni di controllo e trattati.
      3. Mantenere la stessa densità di placcatura, programma di trattamento e condizioni di sostituzione del mezzo tra i campioni.
      4. Registra immagini in campo chiaro di ciascuna selezione ben prima della dissociazione utilizzando le stesse impostazioni del microscopio, ingrandimento e criteri di selezione del campo.
    2. Rimozione della matrice
      1. Aspira completamente il substrato di coltura da ogni pozzo.
      2. Lava ogni pozzo due volte con PBS ghiacciato per rimuovere il materiale residuo e i detriti.
      3. Aggiungi 1 mL di soluzione di recupero a celle gelate in ciascun pozzo.
      4. Incubare sul ghiaccio per 20–30 minuti.
      5. Pipetta delicatamente ogni 5–7 minuti durante l'incubazione per facilitare la dissoluzione della matrice.
      6. Trasferire materiale disciolto in tubi pre-raffreddati utilizzando una punta a tubo largo o tagliata per ridurre al minimo lo sforzo di taglio.
      7. Si procede alla dissociazione enzimatica solo dopo che la matrice è in gran parte disciolta e rimane un residuo di gel visibile minimo.
  2. Dissociazione enzimatica e preparazione della sospensione a cellule singole
    1. Dissociazione enzimatica
      1. Centrifugare la sospensione organoide recuperata a 300 × g per 5 minuti a 4 °C.
      2. Rimuovi il sovrantante con cura senza disturbare il pellet.
      3. Risospendere la pellet in 1 mL di enzima di dissociazione cellulare ricombinante.
      4. Incubare a 37 °C per 5–10 minuti.
      5. Pipetta delicatamente 8–10 volte ogni 2–3 minuti usando una punta P1000 a largo diametro per favorire la dissociazione.
      6. Interrompere la digestione quando la maggior parte dei frammenti organoidi si è dispersa in singole cellule e rimangono solo piccoli gruppi residui.
      7. Evitare una digestione prolungata per prevenire una riduzione della vitalità cellulare, artefatti trascrizionali associati allo stress e aumento della contaminazione da RNA ambientale.
    2. Tempra e filtrazione
      1. Aggiungi 4 mL di PBS gelato contenente 2% di siero fetale bovino per fermare la digestione.
      2. Filtra la sospensione attraverso un filtro a celle da 40 μm.
      3. Lava una volta con PBS per rimuovere enzimi residui, aggregati e detriti.
      4. Eseguire la lisi dei globuli rossi se è presente contaminazione da eritrociti, seguendo le istruzioni del produttore.
    3. Preparazione delle celle e controllo qualità
      1. Contare le cellule usando l'esclusione del blu di tripano.
      2. Determina la vitalità delle celle prima della preparazione della biblioteca.
      3. Usa solo campioni con vitalità ≥ 85%.
      4. Regolare la concentrazione finale della cella a 700–1.200 cellule/μL.
      5. Escludere campioni con detriti eccessivanti, cellule morte abbondanti, grandi aggregati visibili o dissociazione incompleta.
      6. Ripeti la filtrazione prima del caricamento se sono presenti aggregati.
      7. Controllo del processo e campioni trattati in condizioni identiche, inclusi l'enzima di dissociazione, il tempo di digestione, la frequenza di pipettare, il metodo di filtrazione, la concentrazione cellulare e la strategia di carico.
  3. Preparazione e sequenziamento della libreria a singola cella
    1. Acquisizione a singola cella e preparazione delle librerie
      1. Caricare la sospensione a cella singola preparata su una piattaforma di cattura a singola a base di goccioline secondo le istruzioni del produttore.
      2. Eseguire trascrizione inversa, amplificazione del cDNA e costruzione di librerie utilizzando il corrispondente flusso di lavoro a singola cellula 3′.
    2. Parametri di sequenziamento
      1. Librerie di sequenze a una profondità di almeno 50.000 letture per cella.
      2. Celle di carico per raggiungere un recupero di circa 6.000–10.000 celle per biblioteca.
      3. Registrare la chimica del sequenziamento, la struttura di lettura e le impostazioni degli strumenti.
  4. Criteri di qualità per l'analisi a valle
    1. Assicurati che la preparazione finale abbia alta vitalità cellulare, detriti minimi e basso carico aggregato.
    2. Confermare l'idoneità per l'analisi trascritomica a valle di un'unica cellula dell'eterogeneità cellulare e delle transizioni cellulari-stato.

5. Elaborazione di base e controllo qualità dei dati di sequenziamento dell'RNA a singola cellula

  1. Elaborazione primaria
    1. Generazione della matrice di conteggio
      1. Elaborare i dati grezzi di sequenziamento utilizzando la pipeline raccomandata per la piattaforma selezionata.
      2. Genera una matrice di conteggio gene per cellula.
      3. Registra la versione software, riferisci la costruzione del genoma e rilascia l'annotazione della trascrizione.
    2. Valutazione iniziale della qualità a livello di biblioteca
      1. Riassumere le metriche di sequenziamento per ogni libreria, inclusi letture totali, numero stimato di cellule recuperate, geni mediani per cellula, UMI mediane per cellula e saturazione del sequenziamento (se applicabile).
      2. Usa le stesse impostazioni di genoma di riferimento e annotazione su tutti i campioni.
  2. Controllo qualità a livello di cella
    1. Filtraggio di celle di bassa qualità
      1. Valuta per ogni cellula il numero di geni rilevati, il conteggio totale di UMI, la proporzione di trascritti mitocondriali e le evidenze di doppietti o multipletti.
      2. Escludere cellule con numeri genici estremamente bassi, conteggi UMI estremamente bassi o frazioni di trascrizioni mitocondriali anormalmente elevate.
      3. Definire le soglie di filtraggio in base alla distribuzione del dataset.
      4. Applicare soglie identiche tra i gruppi di trattamento abbinati.
    2. Rimozione dei probabili doppietti
      1. Identificare i possibili doppi utilizzando un metodo computazionale appropriato.
      2. Rimuovere i doppietti utilizzando un flusso di lavoro di rilevamento compatibile con la piattaforma.
      3. Applicare la stessa strategia di rilevamento dei doppietti su tutti i campioni.
  3. Normalizzazione, clustering e annotazione
    1. Normalizzazione dei dati
      1. Normalizzare la matrice di conteggio filtrata utilizzando un flusso di lavoro standard a RNA-seq a cellula singola.
      2. Applicare procedure di normalizzazione identiche su tutti i campioni.
    2. Riduzione della dimensionalità e clustering
      1. Esegui una riduzione della dimensionalità.
      2. Effettuare un clustering non supervisionato per identificare le principali popolazioni trascrizionali.
      3. Visualizza gli stati della cella utilizzando un metodo di embedding a bassa dimensione come UMAP.
    3. Identificazione dei geni marcatori
      1. Identificare i geni marcatori utilizzando l'analisi di espressione differenziale tra gruppi.
      2. Assegnare l'interpretazione biologica ai principali stati cellulari epiteliali in base all'espressione dei marcatori.
  4. Analisi comparativa delle condizioni di trattamento
    1. Integrazione dei metadati
      1. Annota ogni cellula con la condizione di trattamento, la linea organoide derivata dal paziente e il lotto di elaborazione.
      2. Mantenere una struttura dei metadati coerente su tutti i campioni.
    2. Analisi dei cambiamenti associati al trattamento
      1. Confronta campioni di controllo e trattati.
      2. Identificare il rimodellamento trascrizionale associato al trattamento.
      3. Identificare cambiamenti nella composizione dello stato cellulare.
      4. Identificare popolazioni cellulari candidate associate all'adattamento terapeutico.
      5. Interpreta i risultati insieme a letture basate sulla morfologia e sulla vitalità.
  5. Output dell'analisi dei dati
    1. Genera una matrice di conteggio gene per cellula controllata dalla qualità.
    2. Generare visualizzazioni a bassa dimensione di popolazioni trascrizionalmente distinte.
    3. Identificare geni marcatori per i principali cluster.
    4. Mantenere la coerenza tra tutti i campioni nel genoma di riferimento, nel flusso di lavoro di pre-elaborazione, nei criteri di filtraggio, nella strategia di clustering e nei criteri di annotazione.
    5. Documenta eventuali deviazioni specifiche del campione rispetto al flusso di lavoro standard.

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Risultati

La Figura 1 delinea la generazione e la caratterizzazione degli organoidi del carcinoma epatocellulare (HCC). Nella Figura 1A, tessuti tumorali derivati dal paziente sono stati utilizzati per stabilire colture organoidi per analisi istologiche e studi terapeutici. La Figura 1B mostra immagini in campo chiaro degli organoidi nei giorni 1 e 6 dopo il recupero, dimostrando sopravvivenza ed espansione s...

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Discussione

Per garantire riproducibilità, efficienza e un'analisi trascritomica a singola cellula di alta qualità, diversi passaggi tecnici in questo flusso di lavoro richiedono un controllo attento. La coerenza durante il rinascimento e l'espansione degli organoidi HCC derivati dal paziente è essenziale, poiché variazioni nella densità di semina, nella composizione della matrice della membrana basale e nel tempismo della coltura possono influenzare la morfologia organoide, la crescita e le rispost...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata sostenuta dalla National Natural Science Foundation of China (82303022; 82122048; 82372714; 82203380), dalla Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2023A1515011416) e dalla Guangzhou Basic and Applied Basic Research Foundation (2024A04J6575). Alcuni elementi schematici sono stati creati utilizzando Home for Researchers (https://www.home-for-researchers.com) e sono stati adattati dagli autori. Le illustrazioni schematiche sono state create utilizzando Figdraw (https://www.figdraw.com) e sono state adattate dagli autori.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
[Leu15]-gastrina I umanoMerckG9145
Microtubi da 1,5 mLMerckAXYMCT150LC
1X Buffer di Lisi RBCThermo Fisher Scientific00-4333-57
Fiale criogeniche Intern Thread da 2,0 mlNido607001
A8301 (inibitore TGFb)Tocris Bioscienza2939
Anticorpo policlonale AFPProteintech14550-1-AP
Anticorpo anti-albumina [ALB/2144]abcamab236492
Anticorpo anti-HNF-4-alfa [EPR16885] - Grado ChIPabcamab181604
Anticorpi anti-prealbumina [EPR3219]abcamab92469
Anticorpo anti-SOX9 [EPR14335-78]abcamab185966
Integratore B27 (503), meno vitamina AThermo Fisher Scientific12587010
Soluzione di recupero cellulare, 100 mLCorning354253Reagente usato per sciogliere la matrice di membrana basale e recuperare gli organoidi prima della riplaccatura o del processo a valle
CellTiter-Glo®   Test di Viabilità delle Celle 3DPromegaG9681
CHIR99021MerckSML1046
Chromium Next GEM Single Cell 3' GEM, Biblioteca & Biblioteca Kit per perline in gel v3.110x GenomicaCG000227
Colino per cellule di Corning, 40 e mu; m, Blue, S, IND, 1/50Corning431750
Piastre Costar a 24 pozzi trasparenti con fondo piatto e ultra basso con attacco multiplo a pozzetti, avvolte singolarmente, steriliCorning3473
Cultrex Fattore di Crescita Ridotto BME, PathClear di Tipo 2 (BME)Merck3533-005-02Matrice extracellulare utilizzata per supportare la coltura organoide tridimensionale e la formazione di cupole
DMSOMerckC6164Solvente utilizzato per preparare soluzioni per il materiale di droga e il controllo dei veicoli
Eagle Medium Modificato di Dulbecco/F-12 di HamThermo Fisher Scientific12634028DMEM/F-12 avanzato
E7080 (Lenvatinib)SelleckS1164Inibitore della tirosina chinasi utilizzato per il trattamento organoide e la perturbazione terapeutica
Valore del siero bovino fetale FBSGibcoA5256701
ForskolinTocris Bioscienza1099
Integratore GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061
Kit per la colorazione di ematossilina ed eosinaBeyotimeC0105S
HEPES, 1 MThermo Fisher Scientific15630080
Microscopio motorizzato a fluorescenza Leica DM6 BLeicaN/A
Supplemento N2 (1003)Thermo Fisher Scientific17502048
N-acetilcisteinaMerckA0737-5MG
NicotinamideMerckN0636
Tubi centrifughe in polipropilene sterili conici Nunc da 15 mLThermo Fisher Scientific339651
Penicillina/streptomicina (10.000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
Soluzione salina tamponata con fosfatoGENOM BIOGNM20012Tampone utilizzato per lavare organoidi e preparare campioni per il trattamento a valle
EGF umano ricombinantePeprotechAF-100-15
FGF10 umano ricombinantePeprotech100-26
HGF umano ricombinantePeprotech100-39
Noggin umano ricombinantePeprotech120-10C
Inibitore della rho chinasi Y-27632 diidrocloruroMerckY0503Inibitore ROCK usato per aumentare la sopravvivenza degli organoidi dopo lo scongelamento o il passaggio
Mezzo condizionato R-spodin1(Broutier et al.)N/ASecrezione delle linee cellulari
Trypan Blue Stain, 0,4% filtrato a membrana Preparato in soluzione salina allo 0,85%Gibco15250061
Enzima TrypLE Express (1x), nessun fenolo rossoThermo Fisher Scientific12604013Sostituto della tripsina
Wnt-3a - mezzo condizionato(Broutier et al.)N/ASecrezione delle linee cellulari

Riferimenti

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