Estrazione del DNA a colonna a media velocità utilizzando rack a 24 pozzi

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo conveniente per accelerare l'estrazione del DNA plasmidicale. Utilizzando rack personalizzati stampati in 3D compatibili con rotori standard a piastra a secchio oscillante, i ricercatori possono processare fino a 48 colonne di rotazione con tappi o fino a 116 colonne di rotazione senza condensatori simultaneamente, riducendo significativamente i tempi di manipolazione rispetto ai metodi manuali con microcentrifughe.

Abstract

L'estrazione di colonne spin-membrane siliciche è lo standard per la purificazione del DNA di alta qualità, ma richiede molta manodopera e è difficile da scalare manualmente oltre piccoli lotti. I robot automatizzati per la movimentazione dei liquidi esistenti sono spesso ancora troppo costosi per laboratori di piccole e medie dimensioni. Questo articolo presenta un approccio snello e semi-automatizzato utilizzando rack personalizzati stampati in 3D che si adattano ai rotori standard a piastra centrifugatorie.

Il sistema suggerito consente il trattamento parallelo di fino a 116 colonne di spin standard commerciali. Il design a rack consente una configurazione "annidata", permettendo la chiarificazione simultanea del lisato (tramite colonne di filtrazione) e il legame del DNA (tramite colonne di silice) in un unico passaggio di centrifugazione. Inoltre, il progetto incorpora un serbatoio di rifiuti condiviso, eliminando la necessità di scartare il flusso dai singoli tubi durante le fasi di lavaggio.

Questo metodo raggiunge una resa e una purezza del DNA paragonabili ai protocolli manuali standard, ma riduce il tempo totale di elaborazione di circa il 50–70% per lotti campioni superiori a 24 (60–90 min invece di 120–180 min). Il tempo totale necessario per le fasi che includono filtrazione del lisato, lavaggi e smaltimento dei rifiuti viene ridotto di 5–10 minuti indipendentemente dal numero di campioni processati. Questo approccio hardware open-source colma il divario tra i miniprep manuali e l'automazione costosa.

Introduzione

L'isolamento degli acidi nucleici tramite matrici di silice fu illustrato per la prima volta nel 1979 da Vogelstein e Gillespie, che stabilirono il principio fondamentale di adsorbire frammenti di DNA in polvere di vetro in presenza di alte concentrazioni di sali caotropici, in particolare iodio^{di sodio 1}. Questa scoperta offrì un'alternativa più sicura ed efficiente rispetto ai metodi tossici di estrazione del fenolo-cloroformio e ai laboriosi metodi di ultracentrifugazione con gradiente di cloruro di cesio che dominavano l'epoca. Successivamente, Boom e i coautori hanno ottimizzato significativamente questa metodologia introducendo il tiocianato di guanidinio (GuSCN) come principale agente^{caotropico 2}. Questa innovazione è stata fondamentale, poiché il GuSCN agisce contemporaneamente come potente denaturante proteico per le cellule di lisi e come potente inibitore di RNasi e DNasi, preservando così l'integrità degli acidi nucleici durante le fasi iniziali di estrazione.

Dalla sua nascita, questa tecnologia di estrazione in fase solida — ampiamente nota come "metodo Boom" — è stata sottoposta a un ampio perfezionamento. È stato adattato per isolare acidi nucleici da matrici biologiche sempre più complesse, che vanno dal plasmide^{batterico 3} e DNA^{genomico 4} al mitocondriale^{eucariotico 5} e DNA genomico ad alto peso molecolare. Inoltre, la tecnologia è stata adattata per applicazioni cliniche e forensi, inclusa l'isolamento di DNA circolante libero da cellule dal plasma⁶, l'estrazione di DNA vegetale recalcitrante e RNA ricchi di^{polifenoli 7}, e la purificazione degli acidi nucleici^{virali 8}. Sono disponibili anche molti kit commerciali che utilizzano colonne spinanti.

Il meccanismo fisicochimico alla base di questo processo si basa sulla rottura della struttura dell'acqua da parte di ioni caotropici. In presenza di alta forza ionica e pH basso, i gusci idratanti che circondano sia la spina dorsale di fosfato di acidi nucleici sia la superficie di silice vengono rimossi (disidratazione). Ciò facilita la formazione di ponti cationici—tipicamente mediati da cationi Na⁺ o caotropici—tra i gruppi silanoli carichi negativamente sulla superficie della silice e i gruppi fosfato dell'acido nucleico. La selettività riguardo al tipo di acido nucleico (DNA vs. RNA) e alla lunghezza dei frammenti si ottiene tramite la modulazione precisa della chimica del tampon. Ad esempio, concentrazioni specifiche di sale e livelli di pH possono favorire il legame di lunghi filamenti genomici rispetto a piccoli oligonucleotidi, oppure differenziare tra RNA e DNA. Inoltre, le moderne versioni di questa tecnologia spesso impiegano superfici di silice modificate per migliorare le isoterme di adsorbimento differenziale di specifiche specie di acidi nucleici.

Il flusso di lavoro canonico per la purificazione degli acidi nucleici a base di silice si svolge attraverso quattro fasi distinte: (1) Lisi, in cui il materiale biologico di partenza viene omogeneizzato e le strutture cellulari vengono disintegrate, spesso utilizzando condizioni alcaline o detergenti (SDS/Triton); (2) Chiarificazione, dove detriti cellulari, proteine precipitate e polisaccaridi vengono rimossi per prevenire l'ostruzione della colonna; (3) Legamento, in cui il soprantantante viene regolato con sali caotropici ed etanolo per promuovere l'adsorbimento alla membrana silicea; e (4) Lavaggio, in cui gli acidi nucleici legati alla membrana vengono risciacquati con tamponi a base di alcol per rimuovere sali residui e inibitori prima dell'eluzione in un tampone a bassa forza ionica.

Sebbene la chimica di questo processo sia robusta, la gestione meccanica delle singole colonne di spin rimane un importante collo di bottiglia per i flussi di lavoro a media velocità (24–100 campioni), creando un divario tra la lavorazione manuale e i costosi sistemi automatizzati di gestione dei liquidi. Gli approcci esistenti per semplificare l'estrazione manuale degli acidi nucleici su colonne includono collettori a vuoto e postazioni robotiche per la purificazione^{automatizzata} 9,10,11,12.

I collettori a vuoto sono tipicamente disponibili sia in configurazione a accesso casuale equipaggiata con adattatori a spina Luer da 20–24 per colonne centrifughe, sia in un progetto pensato per l'uso con piastre da 96 pozzi. I collettori a vuoto configurati per 20–24 campioni accelerano la fase di lavaggio della colonna durante la purificazione del DNA rispetto alla centrifugazione, poiché eliminano la necessità di rimuovere colonne dal rotore. Sebbene questo metodo sia conveniente, la contaminazione incrociata può verificarsi perché la punta di drenaggio della colonna entra in contatto con l'apertura Luer del collettore di vuoto. Se il DNA di una colonna entra nell'apertura di Luer, può essere trasferito a un'altra colonna campione durante un successivo utilizzo della varietà. Per prevenire la contaminazione, i produttori raccomandano accessori aggiuntivi^10,13; tuttavia, questi complicano l'assemblaggio dell'impianto di estrazione e spesso vengono omessi.

I collettori a vuoto progettati per il formato a 96 pozzi presentano una costruzione diversa e non sono destinati a colonne di microcentrifuga ma a piastre compatibili di estrazione del DNA a 96 pozzi, in cui i pozzi contengono una membrana silicea. In questo caso, l'estrazione del DNA viene effettuata utilizzando kit di isolamento del DNA preconfezionati in formato 96^{pozzi 14}. Questi kit offrono un'elevata capacità di rendimento ma hanno un'applicabilità limitata, poiché l'elaborazione di meno di 96 campioni è spesso poco pratica.

Le postazioni robotiche automatizzate per l'estrazione degli acidi nucleici sono senza dubbio il metodo più comodo per la purificazione del DNA, poiché richiedono un coinvolgimento minimo degli operatori, risparmiando così tempo ai ricercatori e minimizzando fattori stocastici come la contaminazione. Purtroppo, la maggior parte delle stazioni di estrazione manca di universalità e opera esclusivamente con kit dedicati. Queste postazioni di lavoro sono utilizzate principalmente nei laboratori diagnostici, ma non sono economicamente convenienti per la maggior parte dei laboratori accademici di piccole e medie dimensioni.

Pertanto, esiste una lacuna nella pratica di laboratorio per i metodi di estrazione del DNA a media produzione capaci di elaborare tra 12 e 96 campioni in meno di 1 ora. Presentiamo un rack a 24 pozzi che consente l'isolamento manuale di fino a 48 campioni usando colonne di spin con capo e fino a 116 campioni tramite colonne di spin non limitate. Una centrifuga con rotore a piastra a secchio oscillante e una microcentrifuga ad angolo fisso sono utilizzate come apparecchiature aggiuntive. La procedura per la purificazione del DNA plasmidico è presentata come esempio di utilizzo di rack a 24 pozzi, poiché l'isolamento del DNA plasmidico include una fase di chiarificazione per rimuovere i detriti cellulari lisati, il che rende il processo difficile da automatizzare. Tuttavia, questi rack possono essere impiegati praticamente per qualsiasi metodo di estrazione degli acidi nucleici a colonna.

Protocollo

1. Preparazione di apparecchiature stampate in 3D

1. Stampare il rack usando una stampante 3D a filamento fuso con ugello da 0,4 mm. Usa filamento generico di PLA, PETG o ABS con riempimento al 100%. Imposta l'altezza dello strato a 0,1 mm e abilita il levigamento della superficie. Regola le impostazioni di stampa per garantire l'impermeabilità e la stabilità meccanica.
   NOTA: I file STL per componenti rack sono forniti nel File Supplementare 1. Segui i parametri di stampa specificati per il Base Reservoir. Testare il serbatoio prima dell'uso riempendolo con etanolo al 70% e centrifugandolo per durate crescenti (1, 2, 5, 10 e 30 minuti) per confermare l'assenza di perdite o danni strutturali.
2. Incollare insieme i componenti del Base Reservoir per formare un'unità sigillata.

2. Coltura batterica e lisi

1. Inoculare i trasformanti di E. coli in 3–5 mL di mezzo LB contenente antibiotici appropriati. Incubare durante la notte (12–16 ore) a 37 °C con scuoti.
2. Prelevare le celle tramite centrifugazione a 2.000 × g per 10 minuti. Scartate il soprannatante.
   NOTA: I pellet cellulari possono essere conservati a −20 °C prima della lavorazione.
3. Aggiungi 250 μL di buffer di risospensione (buffer P1 con RNase A) al pellet. Sospensa completamente tramite vortex o pipetta.
4. Aggiungi 250 μL di buffer di lisi (Buffer P2). Mescola invertendo delicatamente il tubo 4–6 volte.
   NOTA: Evitare la miscelazione vigorosa per evitare il taglio del DNA genomico.
5. Aggiungere 350 μL di buffer di neutralizzazione (Buffer N3). Mescola immediatamente accuratamente per inversione.
   NOTA: Dovrebbe formarsi un precipitato bianco, indicando una neutralizzazione riuscita a favore.

3. Assemblaggio dell'unità di filtrazione

1. Inserire colonne di legame del DNA nello strato di supporto della colonna della grappa.
2. Posizionare i coperchi delle colonne in scanali designati per fissarli durante la centrifugazione.
3. Posiziona le colonne di chiarificatura/filtro nello strato della colonna del filtro direttamente sopra le colonne di lego.
   NOTA: Se non sono disponibili colonne di filtro, centrifugare il lisato in microtubi e trasferire il soprantantante alle colonne di legame.

4. Clearance del lisato e legame al DNA

1. Trasferire il lisato neutralizzato dal Passo 2.5 nelle colonne di filtrazione.
2. Inserisci il rack assemblato in un rotore a piastra a secchio oscillante.
   ATTENZIONE: Assicurati un corretto bilanciamento utilizzando una cremalliera per contrappeso di pari massa e configurazione identica.
3. Centrifuga a 2.000 × g per 1 minuto a temperatura ambiente.
4. Rimuovi la cremagliera dalla centrifuga.
5. Rimuovi e scarta lo strato di colonna del filtro.

5. Lavaggio

1. Scartare il flusso dal serbatoio in un contenitore di rifiuti. Rimonta il rack con colonne di ripuntamento.
2. Aggiungi 500–700 μL di wash buffer a ogni colonna di legatura usando una pipetta multicanale.
3. Centrifuga a 2.000 × g per 1 minuto.
4. Scartare il flusso dal serbatoio.
5. Ripeti il lavaggio aggiungendo il tampone di lavaggio a ogni colonna e centrifugando a 2.000 × g per 1 minuto.
   NOTA: Le colonne possono essere conservate a temperatura ambiente o a 4 °C dopo il lavaggio.

6. Asciugatura ed eluzione

1. Rimuovi le colonne di legatura dal rack e trasferile in tubi di raccolta da 2 mL.
2. Centrifuga a >10.000 × g per 1 minuto per asciugare la membrana.
3. Trasferire colonne per pulire tubi da 1,5 mL.
4. Aggiungi 50 μL di tampone di eluzione o acqua direttamente alla membrana. Incuba per 1 minuto a temperatura ambiente.
5. Centrifugare a >10.000 × g per 1 minuto per eluire il DNA.

7. Opzionale: co-precipitazione con anidride di titanio

1. Mescola il tampone di lisi con polvere di anidride di titanio in un rapporto volume/massa di 2:1.
2. Aggiungi 250 μL di sospensione al biossido di titanio al lisato. Mix per inversione.
3. Aggiungi 350 μL di buffer di neutralizzazione e mescola accuratamente.
4. Centrifuga a 2.000 × g per 1 minuto.
5. Raccogli il soprandanante senza disturbare il precipitato.
6. Trasferire il sovrantantante nella colonna di legagine.

Risultati

Varianti della cremagliera
Abbiamo sviluppato quattro versioni di rack adatte a una vasta gamma di modelli di centrifughe, permettendo l'uso delle risorse disponibili in diversi ambienti di laboratorio e adattandosi alle preferenze degli utenti. Tutti i rack presentano un formato a 24 pozzi ma, a seconda della versione, includono posizioni di seduta aggiuntive per le colonne. Le dimensioni dettagliate e la compatibilità sono fornite nel File Supplementare 2. Un'immagine ad alta risoluzione del rack assemblato è fornita nella Figura Supplementare S1.

La versione base a rack (Figura 1) è la configurazione più produttiva. È composto da quattro parti e ha dimensioni di 88 × 130 × 77 mm. Permette l'uso simultaneo di fino a 48 colonne quando si usano colonne con maiuscolo o fino a 116 colonne con colonne senza maiuscolo. I componenti del rack sono progettati per facilitare l'uso e per minimizzare gli effetti indesiderati durante la centrifugazione. Le colonne di spin sono posizionate nello strato di colonna, che ha scanalature per inserire i tappi; Queste stesse scanalature possono anche ospitare colonne senza tappi. Lo strato di colonne si trova sul serbatoio. L'apertura di drenaggio delle colonne è posizionata sopra il foro del bacino, il che aiuta a ridurre gli schizzi tra colonne adiacenti. Il liquido scorre attraverso un'apertura sul fondo del foraglio nel serbatoio. La capacità del serbatoio è di circa 100 mL, con due passaggi di lavaggio con un carico elevato sulla colonna. Lo strato di colonne filtro può essere posizionato sopra quello quando necessario, con le colonne di filtro posizionate sopra e a contatto con le colonne di lego. Il tappo sigilla lo strato contenente il filtro o le colonne di legame, limitando il flusso d'aria durante la rotazione della centrifuga. La versione base a cremagliera è compatibile con i rotori a secchio A-2-DWP (ad esempio Eppendorf 5804), i rotori 1770 (ad esempio, HETTICH Rotina 380) o sistemi equivalenti.

La versione a mini rack (Figura 2) è adatta a un'ampia gamma di rotori a secchio centrifuga. È composto da tre parti e ha dimensioni minime di 82,5 × 128 × 58 mm (con lo strato della colonna del filtro). Permette l'uso di fino a 48 colonne con maiuscule o fino a 90 colonne senza maiuscule. La geometria di questa versione è simile a quella della cremagliera base, ma le file esterne delle posizioni delle colonne vengono rimosse e sostituite con scanalature per i tappi delle colonne. La capacità del serbatoio varia a seconda della versione stampata. Il serbatoio più piccolo (20 mL) ospita un passaggio di lavaggio per circa 30 colonne; I serbatoi più grandi permettono una maggiore capacità di produttività. Lo strato della colonna filtrante ha bordi arrotondati per consentire il movimento del secchio del rotore nelle centrifughe più piccole. La versione mini rack è compatibile con rotori a secchio UC-124 (ad esempio, Accumax iFuge UC02) o sistemi equivalenti. Quando utilizzato senza lo strato a colonna filtrante, il rack è compatibile con rotori a secchio A-2-MTP (ad esempio, Eppendorf 5430) o i loro equivalenti.

La versione senza serbatoio (non coperta) (Figura 3) è adatta a utenti con esperienza limitata di stampa 3D, poiché il serbatoio viene sostituito da un contenitore esterno come una scatola a punta di pipetta. Questa versione è composta da tre parti e misura 79 × 115 × 61,5 mm. Permette l'uso di fino a 48 colonne con mazze o fino a 78 colonne senza mazzetti. La geometria è simile a quella delle versioni precedenti ma manca di un serbatoio integrato. Invece, si utilizza un contenitore adatto per la raccolta dei rifiuti. Gli strati di colonna e filtro hanno meno posizioni di sedile, e lo strato filtrante include sedute coniche per evitare interferenze con il movimento del rotore. La base è progettata per adattarsi a contenitori standard e può essere stabilizzata tramite distanziatori laterali. La compatibilità dipende dal contenitore selezionato ma include i rotori a secchio A-2-DWP (ad esempio, Eppendorf 5804), il rotore 1770 (ad esempio, HETTICH Rotina 380) e i rotori a canna UC-124 (ad esempio, Accumax iFuge UC02).

La versione a rack di condensatori (Figura 4) è la configurazione più semplice ed è utilizzata insieme a piastre da 5 mL o 10 mL a 24 pozzi profondi. È composta da un unico componente con dimensioni di 73 × 109 × 4 mm e consente l'uso fino a 48 colonne. Questa versione è compatibile con qualsiasi rotore di centrifuga che supporti il corrispondente formato di piastre.

Resa e purezza
L'estrazione del DNA è stata effettuata su colture di E. coli utilizzando sia il protocollo standard manuale della microcentrifuga sia il metodo a rack. L'analisi spettrofotometrica ha mostrato che la qualità del DNA estratto utilizzando i rack era comparabile a quella ottenuta con il metodo standard. I rapporti tipici A260/A280 variavano tra 1,8 e 1,9 per entrambi gli approcci. La resa totale del plasmide (μg) non ha mostrato differenze significative tra il metodo convenzionale e l'estrazione tramite le configurazioni a rack (Figura 5); i dati grezzi sono forniti nel Supplemental File 2. È stata preservata anche la conformazione plasmidiale, con distribuzioni simili di forme rilassate, linearizzate e sovraavvolte (Figura 6).

Analisi della contaminazione incrociata
Per valutare la potenziale contaminazione incrociata, è stato condotto un esperimento a scacchiera. Le colonne venivano caricate alternativamente con una soluzione di bromuro di etidio ad alta concentrazione (simulando DNA ad alto titolo) e acqua. Dopo la centrifugazione a 2.000 × g, la distribuzione del colorante fu confinata all'area di scarto direttamente sotto le colonne cariche, e non fu rilevato alcun segnale visibile nei pozzi adiacenti o sulle punte delle colonne vicine (Figura 7). Queste osservazioni indicano che il design a cremagliera riduce la probabilità di schizzi e trasferimento tra colonne trasversali nelle condizioni testate.

Per valutare ulteriormente la contaminazione, è stata eseguita una PCR in tempo reale utilizzando un amplicon come agente contaminante (vedi File Supplementare 2). L'amplificazione è stata rilevata solo in eluati provenienti dalle colonne a cui era stato aggiunto l'amplicon (Figura 8). Nelle condizioni testate, non è stata rilevata alcuna contaminazione incrociata; tuttavia, le prestazioni possono variare a seconda del flusso di lavoro e del tipo di campione.

Figura 1: Versione base dello schema dell'assemblaggio rack. Vista CAD esplosa che mostra (A) Cappuccio, (B) Layer Colonna del Filtro, (C) Layer Supporto Colonna e (D) Serbatoio di Base. Il rack è composto da quattro parti con dimensioni di 88 × 130 × 77 mm e consente l'uso simultaneo di fino a 48 colonne con tappi o fino a 116 colonne senza tappi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Versione mini dello schema di assemblaggio rack. Vista CAD esplosa che mostra (A) Filtro Colonna Strato, (B) Layer Colonna Holder e (C) Base Reservoir. Questa versione è geometricamente simile alla versione base, ma le due file laterali di sedili delle colonne sono state rimosse e sostituite con scanalature per i tappi delle colonne. È composto da tre parti, ha dimensioni minime di 82,5 × 128 × 58 mm (con lo strato della colonna filtro) e consente l'uso di fino a 48 colonne con mazze o fino a 90 colonne senza mappole. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Versione senza serbatoio (scoperta) dello schema dell'assemblaggio rack. Vista CAD esplosa che mostra (A) Filtro Colonna Strato, (B) Layer Colonna, (C) Base e (D) scatola della punta della pipetta. Questa versione sostituisce il serbatoio integrato con un contenitore esterno come una scatola a punta di pipetta. È composta da tre parti, ha dimensioni di 79 × 115 × 61,5 mm, e consente l'uso di fino a 48 colonne con mazze o fino a 78 colonne senza mazzetti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Versione a tappo dei rack a 24 pozzi. Vista dall'alto (a sinistra) e vista inferiore (a destra). Questa è la versione rack più semplice, utilizzata insieme a piastre da 5 mL o 10 mL a 24 pozzi profondi. Consiste in una singola parte con dimensioni di 73 × 109 × 4 mm e consente l'uso di fino a 48 colonne con o senza cappucce. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Confronto tra resa e purezza del DNA. Analisi spettrofotometrica della resa plasmidiale (μg/mL). Non è stata osservata alcuna differenza statisticamente significativa nella resa totale dei plasmidi tra il metodo convenzionale e l'estrazione tramite configurazioni a rack. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Confronto della qualità del DNA. Le forme del DNA sono state visualizzate tramite elettroforesi in gel di agarosio. Le forme rilassate, linearizzate e super-avvolte del DNA sono simili tra l'estrazione manuale standard e l'estrazione su rack. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Valutazione della contaminazione incrociata. Vista del serbatoio di rifiuti dopo la centrifugazione, che mostra pozze di rifiuti discrete senza sovrapposizione. Le colonne erano caricate con una soluzione di bromuro di etidio ad alta concentrazione (simulando DNA ad alto titolo) e acqua. Non è stato osservato alcun colorante nei pozzi adiacenti "d'acqua" o sulle punte delle colonne vicine dopo la centrifugazione, indicando una riduzione degli schizzi e del trasferimento tra colonne nelle condizioni testate. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Analisi della contaminazione incrociata tramite PCR quantitativa. Le curve di amplificazione per i campioni contenenti l'agente contaminante sono mostrate in rosso, mentre i campioni contenenti solo acqua sono mostrati in verde. L'amplificazione è stata rilevata solo nei campioni contenenti l'agente contaminante. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

File supplementare 1: File di modelli 3D per design di rack. Questo set di file contiene file STL per tutte le configurazioni di rack, inclusa la versione base rack, la versione mini rack (con diverse varianti di altezza del serbatoio), la versione senza serbatoio e la versione con rack di condensatori. Per la stampa 3D sono forniti singoli componenti (ad esempio, serbatoio della base, strato di supporto per colonna, strato filtro e cappuccio). Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 2: Dati e metodi di supporto. Questo set di file contiene la tabella di compatibilità delle centrifughe, procedure dettagliate di test di contaminazione incrociata, dataset di reso del DNA grezzo e file di output degli strumenti PCR associati all'analisi della contaminazione. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S1: Versione base rack (completamente assemblata). Immagine ad alta risoluzione della configurazione base del rack completamente assemblata, che illustra la struttura complessiva e la disposizione dei componenti. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Questo protocollo affronta il "gap di throughput" in molti laboratori di biologia molecolare. Sebbene le piastre filtranti a 96 pozzi siano più veloci, possono mostrare capacità di legame inferiori o concentrazioni finali ridotte rispetto alle singole colonne^{di spin 14}. Adattando le colonne di rotazione standard a un formato a rotore a piastra, questo metodo combina l'elevata resa delle colonne con la velocità dei flussi di lavoro basati su lastre.

I rack sono più vantaggiosi quando si elaborano più di 12 campioni. L'innovazione principale del protocollo è l'uso di rack da 24 pozzi, che semplificano e accelerano l'estrazione degli acidi nucleici su colonna impiegando un serbatoio condiviso per lo smaltimento di soluzioni di surnadante e di lavaggio. Quando si utilizzano i rack, il tempo necessario per eseguire questi passaggi per 14–116 campioni è paragonabile a quello richiesto per 2–12 campioni. Inoltre, lo sforzo dell'operatore viene ridotto, poiché i passaggi ripetitivi come la rimozione dei singoli tubi, il trasferimento delle colonne, lo smaltimento delle soluzioni di lavaggio e l'apertura dei tappi sono ridotti al minimo. Poiché i componenti originali del kit (soluzioni e colonne di spin) rimangono invariati, si prevede una qualità del DNA comparabile ed è supportata dai risultati presentati.

La stampa 3D dei rack a 24 pozzi è fattibile con l'equipaggiamento standard, ma può richiedere esperienza per le versioni base e mini. Le versioni senza serbatoio e con cap-rack sono più semplici e possono essere prodotte con una minima esperienza di stampa. Una considerazione chiave nella modellazione della deposizione fusa è la formazione di micro-spazi tra gli strati, che possono compromettere l'impermeabilità durante la centrifugazione. I test hanno indicato che il riempimento al 100%, uno spessore della parete del serbatoio di 7 mm e un'altezza dello strato di 0,1 mm garantiscono sufficiente stagnità. Riscaldare il piano di stampa e applicare la levigatura superficiale migliorava ulteriormente le prestazioni di sigillatura. Al contrario, gli approcci di sigillatura post-stampa che utilizzavano resine epossidiche o solventi organici non erano efficaci, poiché la deformazione durante la centrifugazione causava crepe e perdite. Uno spessore insufficiente della parete può anche causare cedimenti strutturali e perdita di stagnità, potenzialmente portando a uno squilibrio delle centrifughe. Pertanto, si raccomanda il test pre-utilizzo dei componenti stampati.

Le versioni a quattro cremagliere sono adatte a un'ampia gamma di centrifughe con rotori a secchio, permettendo agli utenti di selezionare la configurazione che meglio si adatta alle loro esigenze di attrezzatura e produttività. La versione base rack offre la massima capacità ma richiede centrifughe più grandi e una qualità di stampa superiore. La versione mini riduce i requisiti di dimensioni della centrifuga ma riduce anche la capacità produttiva. La versione senza serbatoio semplifica la fabbricazione ed è compatibile con contenitori comunemente disponibili come le scatole a punta di pipetta, anche se la compatibilità dipende dalla geometria del contenitore. La versione cap-rack è la configurazione più semplice ma non può essere utilizzata con colonne filtri.

Le colonne filtro che non legano gli acidi nucleici possono essere meno facilmente reperibili rispetto alle colonne di legame^{standard 9}. In loro assenza, potrebbero essere necessari ulteriori passaggi di chiarimento, aumentando i tempi complessivi di elaborazione. In alternativa, si possono utilizzare punte filtro per pipette (1000 μL) o il protocollo a biossido di titanio.

I rack di estrazione funzionano come un complemento meccanico ai flussi di lavoro standard di estrazione del DNA⁹ e non alterano la composizione del tampone o la chimica della colonna (eccetto nella variante a anidride di titanio). Di conseguenza, non si prevede un impatto sostanziale sulla qualità del DNA, il che è coerente con l'elettroforesi su gel di agarosio e produce confronti che mostrano forme e quantità di plasmidi simili rispetto al metodo standard.

Sebbene l'uso di un serbatoio di rifiuti condiviso introduca un potenziale rischio di contaminazione incrociata, ciò non è stato osservato nelle condizioni testate. Una caratteristica chiave del design è la geometria a "camino" delle uscite della colonna, che mantiene la separazione tra le punte della colonna e la superficie del liquido di scarto. Per preservare questa separazione, il serbatoio non dovrebbe essere sovraccarico e si raccomanda di svuotare dopo ogni flusso completo.

Una limitazione del metodo è la velocità massima dei rotori a secchio oscillante (tipicamente 2.000 × g). Sebbene sufficiente per le fasi di legatura e lavaggio, questa velocità non è sufficiente per l'asciugatura completa a membrana. Pertanto, è necessario un passaggio finale di centrifugazione ad alta velocità in una microcentrifuga ad angolo fisso. Nonostante questo passaggio aggiuntivo, il risparmio complessivo di tempo rimane sostanziale per i lotti che superano i 24 campioni.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
3D Printer Filament	NIT, Russia	-	PETG o PLA raccomandati
Buffer N3	Qiagen, Netherlands	19064
Buffer P1	Qiagen, Netherlands	19051
Buffer P2	Qiagen, Netherlands	19052
Creality Ender-3 S1 Pro	Creality, China
Elution Buffer	Qiagen, Netherlands	19086
Eppendorf Centrifuge 5702	Eppendorf, Germany	22626001	Rotore ad angolo fisso
Eppendorf Centrifuge 5804 R	Eppendorf, Germany	22625080	Rotore con piatto a cestello oscillante
Ethidium Bromide	Biolabmix, Russia	EtBr-10
Frit of 1000 μL Filter Pipette Tip	GenFollower, China	E-FTB1000	Parte delle Filter Columns
Miniprep Without Filter Barrier Spin Column	JVLAB, China	-	Parte delle Filter Columns
Phenol Red	Lenreactiv, Russia	200125
PrusaSlicer	Prusa Research, Czech Republic
QIAprep 2.0 Spin Miniprep Columns	Qiagen, Netherlands	27115
RNase A	Qiagen, Netherlands	19101
Wash Buffer	Qiagen, Netherlands	19065