Una piattaforma digitale di elettroporazione microfluidica per l'editing del genoma CRISPR a basso input e la trasfezione di mRNA in cellule T in sospensione e modelli di celle 3D

Sommario

Questo protocollo descrive la miniaturizzazione del genoma CRISPR–Cas9 del recettore TCRα/β nelle cellule T umane primarie utilizzando 'DMF-ection', una piattaforma di elettroporazione microfluidica digitale (DMF). Il metodo consente l'editing genico parallelo e a basso input con alta vitalità ed è ulteriormente adattabile per la somministrazione di mRNA in sferoidi 3D multicellulari.

Abstract

L'elettroporazione microfluidica digitale (DMF) consente una manipolazione genetica precisa e a basso volume delle cellule dei mammiferi, minimizzando l'input cellulare fino a 100 volte e preservando la vitalità. Questo studio presenta un flusso di lavoro di trasfezione ad alta produttività basato su DMF per l'eliminazione mediata da CRISPR del locus TRAC nelle cellule T in sospensione primaria umana e per la trasfezione di mRNA di sferoidi HEK293T tridimensionali. Utilizzando RNA guida CRISPR depositati spazialmente e assemblaggio di ribonucleoproteine (RNP) su cartuccia, è stata raggiunta una perturbazione efficiente del locus TRAC sia nelle popolazioni di cellule T CD4⁺ che CD8⁺ utilizzando solo 10.000 cellule per condizione, con vitalità post-editing superiori all'85%. La caratterizzazione biofisica tramite analisi indotte dal flusso e dispersione di Taylor ha rivelato che gli additivi polimerici stabilizzano i complessi Cas9–sgRNA in condizioni di tampone di elettroporazione, supportando l'editing riproducibile a volumi submicrolitri. Il flusso di lavoro è stato ulteriormente adattato per applicazioni 3D inserendo l'mRNA EGFP in sferoidi HEK293T intatti, ottenendo una fluorescenza robusta e spazialmente uniforme senza compromettere la crescita o la morfologia degli sferoidi. Insieme, questi risultati dimostrano che l'elettroporazione del DMF consente un'editing efficace del genoma e la consegna dell'mRNA sia nelle cellule immunitarie in sospensione sia negli sferoidi multicellulari. Questa piattaforma offre una soluzione scalabile e a basso input per applicazioni nella terapia con cellule CAR-T, nella genomica funzionale e nei modelli cellulari 3D avanzati.

Introduzione

L'editing genico nelle cellule umane primarie è sempre più centrale sia per lo sviluppo terapeutico che per la ricerca di base, incluse applicazioni nell'immunoingegneria, nella modellazione di malattie rare e nella genomica^funzionale. Sebbene l'elettroporazione consenta un'editing genomica altamente efficiente, i sistemi convenzionali basati su cuvette richiedono tipicamente fino a milioni di cellule per condizione, limitandone l'uso per campioni derivati dal paziente e popolazioni immunitarie^{rare 2}. Inoltre, questi sistemi sono poco adatti allo screening su larga scala a causa di limit....

Protocollo

Le cellule T umane primarie utilizzate in questo protocollo sono state ottenute da fornitori commerciali con il consenso informato del donatore e in conformità con le linee guida istituzionali, etiche e normative applicabili. Tutta la gestione di materiali biologici di origine umana è stata effettuata in conformità con i protocolli di biosicurezza istituzionale. I ricercatori che implementano questo protocollo sono responsabili di garantire che l'uso delle cellule umane primarie sia conforme ai requisiti del comitato di revisione istituzionale locale (IRB) o del comitato etico, alle normative applicabili sulla biosicurezza e a qualsia....

Risultati

Risultati attesi
L'elettroporazione di 10.000 cellule T attivate per ogni condizione porta tipicamente a un'efficienza di knockout TRAC dell'>85% con >95% di vitalità 72 ore dopo la trasfezione. La citometria a flusso rivela una chiara perdita di colorazione TCRα/β nella condizione di targeting TRAC rispetto ai controlli sgRNA (NTC) non targetting e ai controlli non esposti a campi elettrici. Salvo diversa indicazione, n rappresenta le corse di DMF-ection ind.......

Discussione

Questo protocollo descrive un flusso di lavoro microfluidico microfluidico miniaturizzato che consente una consegna intracellulare efficiente nelle cellule T primarie umane utilizzando gocce a scala nanolitro. Un vantaggio centrale di questo metodo è la capacità di eseguire l'editing genomico CRISPR–Cas9 utilizzando solo 10.000 celle per reazione, riducendo drasticamente i requisiti di materiale rispetto all'elettroporazione convenzionale. L'architettura basata sulle gocce supporta l'aut.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
12 Channel VOYAGER Adjustable Tip Spacing Pipette	Integra	4732	Strumentazione
1x PBS	Gibco		Flow Buffer
96 Well Plate, Sphera Low-Attachment Surface	Thermo Fisher	174927	Protocollo sferi
96-well conical-bottom plate	Sarstedt	82.1583.001	Protocollo sferi
Alexa Fluor 647 anti-human CD4 Antibody	Biolegend	357421	1 in 200, Clone A161A1
Attune Flow Cytometer	ThermoFisher		Strumentazione
DMEM Media	Gibco	10564011	Media Supplement- Coltura sferi
DMF compatible buffer	DropGenie		Trasfezione
DropGenie Transfection System	DropGenie		Strumentazione
Echo Acoustic Dispenser 650 Series	Beckman Coulter Life Scienes
Echo Qualified 384-well Low Dead Volume	Beckman Coulter Life Scienes
EDTA	Invitrogen		Flow Buffer
EGFP mRNA	Trilink	L-7201
EVOS Fluorescent Microscope	ThermoFisher		Strumentazione
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000044	Media Supplement- Coltura sferi
Fida 1 instrument and Fida Neo 480 nm detector	Fida Biosystems ApS		Strumentazione
Ghost Dye Violet 510	Cytek Biosciences	13-0870
HEK293T Cells	ATCC		Protocollo sferi
Human IL-2 Recombinant Protein,	Peprotech	200-02 50ug	Supplemento media per cellule T
Human Primary Pan CD3+ T Cells	All Cells		Sangue periferico, crioconservato, cellule T Helper pan CD3+, negativamente selezionate
Immunocult CD3/CD28 Activator	StemCell Technologies	10970	Media per l'attivazione delle cellule T
Immunocult Expansion Media	StemCell Technologies	10981	Media per l'attivazione delle cellule T
Incucyte Live Cell Analysis System	Sartorius		Strumentazione
INTEGRA ASSIST PLUS pipetting robot	Integra	4505, 4-Position Portrait Deck (PN 4521),	Strumentazione
non targeting synthetic guide RNA	Synthego		5’ GCACTACCAGAGCTAACTCA 3'
NucleoCounter NC-202	Chemometec
PE anti-human TCR α/β Recombinant Antibody	Biolegend	380805	1 in 200, Clone QA20B12
PE-Cy 7 Anti-Human CD8	BD Pharmingen	557750	1 in 200, Clone RPA-T8
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122	Media Supplement- Coltura sferi
Poly-L-glutamic Acid (PGA)	Sigma Aldrich	P4761-100MG	Usare a 100mg/ml
Prism version 8.0.0	GraphPad Software, Inc.		Software
sNLS-SpCas9-sNLS Nuclease	IDT	10017687
Spheroid Microplate	Corning	3830	Protocollo sferi
Surfactant F	DropGenie		Trasfezione- usare a 1:20 nel buffer DMF compatibile per preparare il buffer di trasfezione completo
TRAC synthetic guide RNA	Synthego		5’ AGAGTCTCTCAGCTGGTACA 3'
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25-300-062	Protocollo sferi