Una piattaforma digitale di elettroporazione microfluidica per l'editing del genoma CRISPR a basso input e la trasfezione di mRNA in cellule T in sospensione e modelli di celle 3D

Summary

Questo protocollo descrive la miniaturizzazione del genoma CRISPR–Cas9 del recettore TCRα/β nelle cellule T umane primarie utilizzando 'DMF-ection', una piattaforma di elettroporazione microfluidica digitale (DMF). Il metodo consente l'editing genico parallelo e a basso input con alta vitalità ed è ulteriormente adattabile per la somministrazione di mRNA in sferoidi 3D multicellulari.

Abstract

L'elettroporazione microfluidica digitale (DMF) consente una manipolazione genetica precisa e a basso volume delle cellule dei mammiferi, minimizzando l'input cellulare fino a 100 volte e preservando la vitalità. Questo studio presenta un flusso di lavoro di trasfezione ad alta produttività basato su DMF per l'eliminazione mediata da CRISPR del locus TRAC nelle cellule T in sospensione primaria umana e per la trasfezione di mRNA di sferoidi HEK293T tridimensionali. Utilizzando RNA guida CRISPR depositati spazialmente e assemblaggio di ribonucleoproteine (RNP) su cartuccia, è stata raggiunta una perturbazione efficiente del locus TRAC sia nelle popolazioni di cellule T CD4⁺ che CD8⁺ utilizzando solo 10.000 cellule per condizione, con vitalità post-editing superiori all'85%. La caratterizzazione biofisica tramite analisi indotte dal flusso e dispersione di Taylor ha rivelato che gli additivi polimerici stabilizzano i complessi Cas9–sgRNA in condizioni di tampone di elettroporazione, supportando l'editing riproducibile a volumi submicrolitri. Il flusso di lavoro è stato ulteriormente adattato per applicazioni 3D inserendo l'mRNA EGFP in sferoidi HEK293T intatti, ottenendo una fluorescenza robusta e spazialmente uniforme senza compromettere la crescita o la morfologia degli sferoidi. Insieme, questi risultati dimostrano che l'elettroporazione del DMF consente un'editing efficace del genoma e la consegna dell'mRNA sia nelle cellule immunitarie in sospensione sia negli sferoidi multicellulari. Questa piattaforma offre una soluzione scalabile e a basso input per applicazioni nella terapia con cellule CAR-T, nella genomica funzionale e nei modelli cellulari 3D avanzati.

Introduction

L'editing genico nelle cellule umane primarie è sempre più centrale sia per lo sviluppo terapeutico che per la ricerca di base, incluse applicazioni nell'immunoingegneria, nella modellazione di malattie rare e nella genomica^funzionale. Sebbene l'elettroporazione consenta un'editing genomica altamente efficiente, i sistemi convenzionali basati su cuvette richiedono tipicamente fino a milioni di cellule per condizione, limitandone l'uso per campioni derivati dal paziente e popolazioni immunitarie^{rare 2}. Inoltre, questi sistemi sono poco adatti allo screening su larga scala a causa di limitazioni di throughput, automazione e consumo^{di reagenti 3}.

L'elettroporazione microfluidica è emersa come un approccio promettente per l'editing genomico a basso^{input 4}. Tuttavia, la maggior parte delle piattaforme esistenti si basa su architetture a flusso continuo che prevedono una gestione complessa dei fluidi, una flessibilità limitata nella miscelazione dei reagenti e requisiti relativamente elevati per celle per condizione. Al contrario, la microfluidica digitale (DMF) consente la manipolazione attiva di gocce discrete in scala nanolitrica su un array di elettrodi planari, consentendo un controllo preciso sulla composizione della reazione, sul tempismo e sulla localizzazione spaziale. Questo formato plug-and-play basato su gocce è particolarmente adatto a workflow a basso volume e alta produttività, dove la conservazione di cellule primarie e reagenti è^{essenziale 5}.

Lavori recenti hanno dimostrato la fattibilità della consegna intracellulare basata su DMF utilizzando architetture di elettroporazione a tri-gocce che generano campi elettrici localizzati a bassa corrente per una consegna efficiente di RNP e mRNA minimizzando allo stress termico ed^{elettrochimico 6,7,8}. Sulla base di queste basi, è stata sviluppata una piattaforma di elettroporazione DMF di nuova generazione, denominata 'DMF-ection', con 48 siti di reazione indirizzabili indipendentemente, piena compatibilità con l'automazione e una produzione scalabile^{di cartucce 9} (Figura 1). La cartuccia DMF è composta da una piastra PCB inferiore e una piastra superiore in plastica separate da una guarnizione, assemblate tramite bottoni di allineamento in un'unica orientazione corretta (Figura 1A). La disposizione 48-plex è organizzata in otto famiglie identiche (Figura 1A–H), ciascuna contenente sei siti di elettroporazione indirizzabili indipendentemente, supportando fino a 48 condizioni di editing parallelo per cartuccia (Figura 1B). Le librerie di RNA guida vengono depositate sulla superficie del substrato tramite un distributore acustico prima dell'assemblaggio della cartuccia. La precisione posizionale della deposizione è stata confermata in tutti i 48 siti, con le posizioni di caduta che si raggruppano entro una deviazione sub-millimetrica dal punto medio dell'elettrodo (Figura 1C), supportando un affidabile assemblaggio RNP sulla cartuccia. Dopo il caricamento, celle e gocce di elettrodi liquidi vengono attivate sulla cartuccia per formare la geometria di elettroporazione a tri-gocce (Figura 1D). Dopo l'elettroporazione, le cellule vengono scaricate in piastre di coltura per il recupero e l'analisi a valle, inclusi citometria di flusso, sequenziamento e microscopia (Figura 1E). Questo sistema consente un'elevata efficienza di editing genomico utilizzando fino a 100 volte meno cellule rispetto ai metodi standard basati su cuvette, ampliando significativamente l'accesso all'ingegneria genomica in applicazioni a basso input e ad alto rendimento.

Questo studio valuta le prestazioni della piattaforma consegnando molteplici carichi biomolecolari, inclusi complessi di ribonucleoproteine (RNP) mRNA e CRISPR–Cas9, ottenendo una trasfezione efficiente e una perturbazione genica. Oltre alle cellule T primarie, la DMF-ection fornisce un quadro generalizzabile per la consegna degli acidi nucleici in strutture multicellulari complesse. Gli sferoidi tridimensionali (3D) e i modelli di tipo organoide impongono barriere significative alla penetrazione dei reagenti a causa della loro architettura e fragilità, e gli approcci convenzionali di elettroporazione spesso interrompono la morfologia o generano una consegna eterogenea. Per valutare se gli stessi principi miniaturizzati di elettroporazione utilizzati per l'editing delle cellule T si estendano ai tessuti strutturati, il flusso di lavoro DMF è stato applicato agli sferoidi HEK293T 3D. Questi esperimenti hanno dimostrato che l'elettrobagnatura basata su DMF può posizionare delicatamente sferoidi intatti all'interno delle geometrie tri-gocce e sostenere una distribuzione uniforme dell'mRNA preservando al contempo struttura e crescita. Sebbene questi risultati siano al di fuori del protocollo principale per cellule T descritto qui, illustrano la più ampia applicabilità dell'elettroporazione DMF programmabile per i sistemi cellulari 3D emergenti rilevanti per la scoperta di farmaci e la modellazione delle malattie.

Protocol

Le cellule T umane primarie utilizzate in questo protocollo sono state ottenute da fornitori commerciali con il consenso informato del donatore e in conformità con le linee guida istituzionali, etiche e normative applicabili. Tutta la gestione di materiali biologici di origine umana è stata effettuata in conformità con i protocolli di biosicurezza istituzionale. I ricercatori che implementano questo protocollo sono responsabili di garantire che l'uso delle cellule umane primarie sia conforme ai requisiti del comitato di revisione istituzionale locale (IRB) o del comitato etico, alle normative applicabili sulla biosicurezza e a qualsiasi legislazione nazionale o regionale pertinente che regoli l'uso del materiale biologico umano. Nessuna informazione identificabile dal paziente è stata associata al materiale cellulare utilizzato in questo studio.

1. Preparazione e attivazione delle cellule T umane primarie

1. Lo scongelamento criopreserva rapidamente le cellule T primarie umane CD3⁺ in un bagno d'acqua a 37 °C. Trasferire le celle in un mezzo basale per cellule T preriscaldato e centrifugare a 180 × g per 10 minuti. Scartare il soprandanante e risospendere il pellet in un mezzo fresco.
2. Determina la concentrazione e la vitalità cellulare utilizzando un contatore cellulare automatizzato.
3. Sospendere le cellule a 1 × 10⁶ cellule/mL in un mezzo di coltura per cellule T integrato con uno stimolo attivatore di anticorpi tetramerico solubile CD3/CD28 (secondo le istruzioni del fornitore) e 200 IU/mL di IL-2. Incubare le cellule per 72 ore a 37 °C, 5% CO₂.
   NOTA: Mantenere la densità cellulare tra 0,5–2 × 10⁶ cellule/mL durante l'attivazione. Eseguire l'attivazione nelle piastre U-bottom a 96 pozzi per ottimizzare l'efficienza del contatto cellula-attivatore e dell'attivazione.

2. Preparazione di macchie di RNA guida sul substrato DMF (spotting acustico del distributore)

1. Ricostituire sgRNA liofilizzato in acqua priva di nucleasi a una concentrazione stock di 100 μM. In un tubo separato, preparare una riserva da 100 mg/mL di poli-L-glutamamo (PGA, sale di sodio, MW 15.000–50.000 Da) in acqua priva di nucleasi. Combinare sgRNA e stocco PGA a un rapporto di volume 5:4 (sgRNA: PGA) che produce una concentrazione finale di sgRNA di 55,6 pmol/μL e una concentrazione finale di PGA di 44,4 mg/mL in acqua priva di nucleasi. Vortice brevemente e centrifuga a 1.000 × g per 30 secondi e aliquote in volumi monouso, e conserva le aliquote inutilizzate a −80 °C per un massimo di 6 mesi.
   NOTA: Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento.
2. Aggiungere la miscela guida-PGA a una piastra sorgente acustica a basso volume morto nei pozzi corrispondenti alla disposizione desiderata del sito di reazione.
3. Trasferire 40 nL (equivalenti a 2,2 pmol sgRNA) della miscela guida-PGA a ciascuna regione di spotting target del substrato DMF utilizzando un dispenser acustico calibrato.
   NOTA: A 55,6 pmol/μL, 40 nL fornisce 2,2 pmol sgRNA per sito (55,6 × 0,040 = 2,22 pmol). Le guide essiccate vengono ricostituite durante la fusione delle gocce sulla cartuccia; La risospensione completa è confermata dall'efficienza di editing costante tra i siti.
4. In un armadietto di sicurezza biologica, lascia asciugare completamente le goccioline a temperatura ambiente finché non rimane liquido visibile (circa 5 minuti).
   NOTA: Non usare flusso d'aria forzato o calore, poiché ciò potrebbe spostare o degradare l'RNA guida.
5. Assembla la cartuccia DMF.
   1. In un armadietto di sicurezza biologica, allinea la piastra superiore sul substrato maculato abbinando le caratteristiche di scatto plastico asimmetrico della piastra superiore con le tacche sulla piastra inferiore. Applicare una pressione uniforme e simultanea lungo i bordi corti finché non si avverte uno scatto meccanico distinto, confermando l'innesto completo delle caratteristiche di bloccaggio.
      NOTA: La cartuccia è progettata con un unico orientamento corretto; un assemblaggio errato non produrrà lo schiocco. Tieni sempre i substrati ai bordi per evitare contaminazioni o danni alle superfici funzionali ed evita che i substrati scivolino l'uno contro l'altro, poiché ciò potrebbe graffiare i rivestimenti superficiali.
   2. Checkpoint: Conferma il corretto assemblaggio con il bottone meccanico.
      NOTA: Non esiste un indicatore elettrico pre-run dell'integrità del rivestimento; qualsiasi guasto funzionale dovuto a un assemblaggio improprio viene rilevato automaticamente e riportato nel rapporto QC post-esecuzione.
      Punto di pausa: conservare le cartucce assemblate inutilizzate in un pacchetto sigillato con essiccante (bustine di gel di silice) a temperatura ambiente fino a 48 ore.

3. Preparazione delle celle

1. Prepara 1 mL di tampone di trasfezione completa prima di ogni utilizzo combinando il tampone di elettroporazione compatibile con DMF con il tensioattivo biocompatibile non ionico fornito in un rapporto 20:1 (v/v) (tampone di elettroporazione: tensioattivo), ottenendo una concentrazione finale di tensioattivo dello 0,05% (v/v). Mescola delicatamente e lascia con ghiaccio.
   NOTA: Il buffer di trasfezione compatibile con DMF utilizzato qui è un buffer isotonico a bassa conducibilità (conducibilità: 3,5 mS/cm, osmolalità: 305 mOsm/L). I ricercatori che utilizzano buffer alternativi dovrebbero verificare la compatibilità con l'attuazione del DMF e la vitalità delle celle. Il tensioattivo non ionico biocompatibile serve a ridurre il bloccaggio delle gocce; se il tensioattivo fornito non viene utilizzato, un sostituto adatto.
2. Lavare le cellule T attivate una volta con il tampone di trasfezione (senza tensioattivo). Centrifugare a 180 × g per 5 minuti, aspirare il surnatante e risospendere la pellet cellulare in un tampone di trasfezione completa (contenente tensioattivo) a 1,0 × 10⁷ cellule/mL in un volume totale di 100 μL per cartuccia. Tieni il ghiaccio.
3. Immediatamente prima di caricarla sulla cartuccia, aggiungere nucleasi Cas9 direttamente ai 100 μL di sospensione a cellule T e mescolare con una pipettura delicata; Tieni il ghiaccio.
   NOTA: Per le cellule T primarie, Cas9 è caricato a 42 pmol per volume di cartuccia da 100 μL (0,42 pmol/μL). Ogni sito di elettroporazione processa circa 1 μL di sospensione della cella, fornendo 0,42 pmol Cas9 per montaggio. Ottimizzare questo dosaggio quando si adatta ad altri tipi di cellule immunitarie (vedi Tabella 1).

Componente	Concentrazione finale per modifica
Cas9	0,42 pmol in ~1 μL goccia
sgRNA	2.1 PMOL (da 40 nL spot)
PGA	44,4 mg/mL di brodo in miscela per la magazzina
Tensioattivo	0,05% (v/v)
Ingresso della cella	~10.000 celle

Tabella 1: Tabella riassuntiva delle concentrazioni finali in ciascuna goccia di trasfezione.

4. Trasfezione sulla piattaforma DMF-ection

1. Utilizzando una pipetta multicanale, dispensare 10 μL della miscela T-cell/Cas9 in ciascuna delle 8 porte di carico delle celle e 10 μL di tampone di trasfezione completa nelle 16 porte di carico degli elettrodi liquidi (come mostrato nella Figura 1).
2. Imposta la tensione a 500 V, la durata dell'impulso a 3 ms e il numero di impulsi a 2. Avvia la sequenza di elettroporazione secondo le istruzioni della piattaforma.
   1. Checkpoint: Rivedi il rapporto QC post-run immediatamente dopo la corsa. I guasti sporadici (<10% dei siti) non richiedono alcun intervento. Se i guasti sono sistematici, sostituisci la cartuccia con la scheda QC fornita, esegui il controllo di salute del sistema (~2 min) e contatta il supporto tecnico se persistono problemi.

5. Scarica e recupero delle cellule T modificate

1. Utilizzando un handler di liquidi, trasferire le celle elettroporate da ciascun sito di reazione in una piastra U-bottom di 96 pozzi contenente 150 μL di mezzo basale per cellule T preriscaldate, integrato con 200 IU/mL di IL-2.
2. Incubare le cellule per 72 ore a 37 °C, 5% di CO₂ per permettere il ricambio proteico e i cambiamenti nell'espressione dei recettori superficiali.

6. Analisi citometrica a flusso del knockout TRAC

1. Trasferire le cellule su una piastra inferiore sterile a 96 pozzi conici per ridurre la perdita cellulare tra un lavaggio e l'altro. Lava le cellule due volte con il Flow Cytometry Buffer (1× PBS, 2% FBS, 2 mM EDTA) centrifugando a 400 × g per 5 minuti e rimuovendo il sovrantantante invertendo delicatamente la piastra conica inferiore. Le cellule rimarranno bloccate nella placca.
2. Prepara un master mix per colorazione superficiale contenente anticorpi anti-CD4, anti-CD8 e anti-TCRα/β in Flow Cytometry Buffer alle concentrazioni raccomandate dal produttore. Aggiungi 25 μL di miscela master per pozzo e incuba per 20 minuti a 4 °C protetto dalla luce. Lava due volte con 1× di PBS (senza FBS) centrifugando a 400 × g per 5 minuti. Risospendere le cellule in 100 μL di PBS 1× contenente un colorante di vitalità a 1:1.000 (v/v) e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente protetta dalla luce.
   NOTA: Le piastre coniche inferiori sono efficaci nel pelletare le cellule; Controlla che le cellule siano ben sospese in tutti i passaggi.
3. Lavare le cellule due volte con il tampone di citometria a flusso e risospendere in 150–200 μL per campione per l'acquisizione.
4. Configurare il citometro con linee laser appropriate e set di filtri per i fluorocromi utilizzati (ad esempio, eccitazione a 488 nm per coloranti di vitalità; 405 nm o 488 nm per marcatori superficiali a seconda di caso). Imposta le tensioni usando controlli di compensazione a singola colorazione e un campione non colorato. Raccogliere almeno 5.000 eventi live con singoletti per campione. Gate sequenzialmente su: singole scatter → cellule vive (colorante di vitalità negativa) → CD4⁺ o CD8⁺ → espressione TCRα/β.
   NOTA: In condizioni standard, il totale degli eventi vivi acquisiti può variare da 5.000 a oltre 10.000 per campione dopo perdite durante lavaggio e colorazione, dato che le cellule hanno avuto tempo per proliferare.
5. Determinare la disgregazione del gene TRAC misurando la frequenza delle cellule TCRα/β-negative all'interno delle popolazioni CD4⁺ e CD8⁺. Riporta l'efficienza del knockout come percentuale di celle TCRα/β-negative rispetto al singolo gate vivo per ciascun sottoinsieme.

Results

Risultati attesi
L'elettroporazione di 10.000 cellule T attivate per ogni condizione porta tipicamente a un'efficienza di knockout TRAC dell'>85% con >95% di vitalità 72 ore dopo la trasfezione. La citometria a flusso rivela una chiara perdita di colorazione TCRα/β nella condizione di targeting TRAC rispetto ai controlli sgRNA (NTC) non targetting e ai controlli non esposti a campi elettrici. Salvo diversa indicazione, n rappresenta le corse di DMF-ection indipendenti eseguite in giorni separati. Le repliche tecniche della stessa serie di cartucce venivano mediate prima dell'analisi statistica e non contribuiscono indipendentemente a n. Tutti gli esperimenti con le cellule T riportati qui sono stati condotti utilizzando cellule criopreservate provenienti da un singolo donatore sano. La variabilità donatore a donatore utilizzando la stessa piattaforma è ulteriormente^{caratterizzata 9}.

Migliorata stabilità delle ribonucleoproteine Cas9–sgRNA in condizioni di elettroporazione grazie agli additivi dei polimeri anionici
Un requisito centrale della microfluidica digitale è una superficie altamente idrofobica, che permette alle gocce di scivolare liberamente durante l'elettrobagnare. Sebbene questa proprietà sia essenziale per il moto delle goccioline e l'attuazione precisa, crea sfide per il carico dei reagenti. Per le applicazioni di screening in arrayed, è fondamentale che le librerie di payload definite dall'utente possano essere depositate direttamente sulla superficie della cartuccia. Questo consente ai layout dei reagenti di rispecchiare il design della libreria dell'utente e garantisce che il flusso di lavoro microfluidico digitale possa eseguire esperimenti array senza ulteriori trasferimenti o interventi manuali. La dispensa nano di un dispenser acustico è molto adatta a questo compito, poiché può fornire volumi di nanolitri con alta precisione posizionale su grandi array su diverse superfici. Tuttavia, quando le gocce colpiscono una superficie idrofobica della cartuccia, spesso rimbalzano, formano gocce o non si diffondono uniformemente, portando a una deposizione e un recupero incoerenti. Questa variabilità è più evidente a volumi intermedi di gocce che vanno da 40 nL a 120 nL (Figura 2A, n = 3 per condizione, *** valore p < 0,01), dove si ipotizza che l'energia cinetica della goccia sia sufficientemente alta da causare rimbalzo, ma l'adesione superficiale sia insufficiente ad ancorare il liquido. Di conseguenza, la deposizione diretta sulla cartuccia a dosi di carico utile più elevate può essere inaffidabile senza ulteriori modifiche. Per mitigare questo effetto, i reagenti sono stati integrati con il polimero biosicuro poli-L-glutamico acido (PGA). Il PGA è un polipeptide biodegradabile con cariche negative ampiamente utilizzato come stabilizzatore nelle formulazioni farmaceutiche, con un'eccellente compatibilità per i flussi di lavoro di cellule vive. Si ipotizza che la spina dorsale carica riduca l'angolo di contatto delle goccioline e favorisca una diffusione più uniforme, riducendo il rimbalzo e migliorando l'adesione superficiale. Con la presenza di PGA, i volumi depositati di fluoresceina si scalavano linearmente con l'assorbenza, e la varianza si riduceva notevolmente tra le cartucce. L'analisi statistica ha confermato che il PGA ha migliorato significativamente la riproducibilità a volumi di rilevamento di 40, 90 e 120 nL (***p < 0,001, ****p < 0,0001), mentre gocce molto piccole (10–20 nL) hanno mostrato poca differenza, poiché il rimbalzo è meno marcato a basse energie cinetiche.

Successivamente, l'aggiunta di additivi polimerici utilizzati nel flusso di lavoro DMF è stata valutata per la loro influenza sul comportamento delle ribonucleoproteine (RNP) Cas9–sgRNA nelle condizioni di tampone a basso volume utilizzate per l'elettroporazione. A tal fine è stata utilizzata la tecnologia di analisi della dispersione indotta dal flusso (FIDA). FIDA è stato selezionato perché fornisce una misurazione accurata in fase di soluzione del raggio idrodinamico e dell'affinità di legame, permettendo di quantificare le interazioni proteina-acido nucleico nelle stesse condizioni di tamponamento utilizzate in ambito sperimentale. FIDA dimostrò che gli sgRNA liberi mostravano un raggio idrodinamico (Rh) di 3,45 ± 0,26 nm, coerente con una specie di RNA piccola a singolo filamento. La titolazione con Cas9 ha prodotto un complesso RNP stabile con una Rh di 15,32 ± 0,46 nm e un'affinità di legame sub-nanomolare (KD = 0,70 ± 0,14 nM) (Figura 2).

Per valutare l'effetto della stabilizzazione polimerica, l'acido poli-L-glutammico (PGA) è stato aggiunto all'RNA guida prima della formazione dell'RNP. La presenza di PGA ridusse l'apparente affinità tra Cas9 e sgRNA (K_D = 67,7 ± 9,5 nM) e ridusse la dimensione del complesso a circa 10 nm (Figura 2A pannello destra). Sebbene la ridotta affinità suggerisca complessi meno strettamente associati, la_{R h} più piccola e uniforme indica che la PGA previene la formazione di assemblaggi RNP sovradimensionati (Figura 2B).

Successivamente, la stabilità RNP è stata valutata in condizioni di elettroporazione utilizzando l'analisi di dispersione di Taylor (Figura 2C). Senza polimero, le miscele Cas9–sgRNA producevano Taylorgrammi ampi e mal adattati, indicatori di aggregazione (Figura 2B). Al contrario, l'aggiunta di 0,0025 mg/mL PGA ha prodotto profili di dispersione monodispersi ben definiti (R² = 0,999) con_{R h} ~ 9,6 nm. Questi risultati dimostrano che il PGA previene l'aggregazione e migliora l'uniformità RNP, supportando così l'elettroporazione riproducibile su scala nanolitro. Questa stabilizzazione fornisce una giustificazione meccanicistica per le elevate efficienze di editing osservate negli esperimenti a valle delle cellule T.

Efficienza di editing dipendente dalla dose nelle cellule T primarie

Sebbene gli esperimenti FIDA indicassero che il PGA riduce l'efficienza dell'assemblaggio RNP, si ipotizzava che i risultati di editing funzionale fossero meno influenzati, poiché l'elettroporazione viene tipicamente eseguita con un eccesso di RNA guida rispetto a Cas9. Pertanto, il volume di input PGA–RNP è stato valutato per l'impatto sull'efficienza del knockout nelle cellule T primarie umane al locus TRAC (Figura 2D). Su quattro cartucce, l'efficienza di montaggio è stata costantemente elevata (>75–80%) agli ingressi RNP di 40 nL (2,1 pmol), 20 nL (1,05 pmol) e 10 nL (0,53 pmol), con minima variabilità tra i sottoinsiemi CD4⁺ e CD8⁺ . Anche a 5 nL (0,26 pmol), il montaggio è rimasto robusto, anche se è stata osservata una modesta riduzione rispetto alle dosi più elevate. Alla dose più bassa testata (2,5 nL, 0,13 pmol), l'efficienza di montaggio è diminuita notevolmente, raggiungendo un plateau vicino al ~60% TRAC KO. I controlli confermavano la specificità del montaggio: i pozzi senza elettroporazione (0V) e i controlli fuori cartuccia (OCC) mostravano solo knockout di fondo. La frequenza elevata di TCR-negativo osservata nella popolazione CD8⁺ di controllo fuori cartuccia (OCC) riflette probabilmente la downmodulazione basale del TCR specifica per donatore dopo l'attivazione, indipendentemente da elettroporazione o modifica genica poiché queste cellule non sono state esposte alla cartuccia. Insieme, questi risultati dimostrano che la DMF-ection consente un editing efficiente mediato da CRISPR a input RNP su scala nanolitro. È importante sottolineare che il montaggio è stato comparabile tra le cellule T CD4⁺ e CD8⁺ , evidenziando l'applicabilità della piattaforma tra i sottoinsiemi delle cellule T e suggerendo che l'uso dell'RNP può essere ridotto di oltre un ordine di grandezza senza compromettere l'efficienza del knockout.

Alterazione genica efficiente nelle cellule T primarie CD4⁺ e CD8⁺ utilizzando la DMF-ection miniaturizzata
Per validare in modo più approfondito le prestazioni del flusso di lavoro DMF-ection, è stata valutata la eliminazione mediata da CRISPR–Cas9 del locus TRAC nelle cellule T primarie umane CD4⁺ e CD8⁺ utilizzando solo 10.000 cellule attivate per condizione. Furono inclusi tre gruppi sperimentali: la condizione guida TRAC-targeting (TRAC KO), un controllo non targeting (NTC) per tenere conto degli effetti non specifici della somministrazione RNP, e un controllo fuori cartuccia (OCC) per stabilire l'espressione basale di TCRα/β in cellule non trattate e non manipolate. È stata applicata una strategia standard di gating per identificare i singoli vivi, seguiti dai sottoinsiemi CD4⁺ e CD8⁺ e dall'espressione TCRα/β (Figura 3A). La rottura genica ad alta efficienza del locus TRAC è stata raggiunta in entrambi i sottogruppi di cellule T in 40 corse di elettroporazione indipendenti. Nelle cellule T CD4⁺, l'efficienza di knockout TRAC ha raggiunto 88,4 ± 4,9%, rispetto al 3,2 ± 4,7% nelle NTC e 9,8 ± 5,1% nelle condizioni OCC. Un risultato comparabile è stato osservato nelle cellule T CD8⁺, dove TRAC KO ha raggiunto 89,8 ± 4,2%, contro 4,2 ± 7,4% (NTC) e 20,2 ± 4,9% (OCC) (Figura 3B, a sinistra). È importante sottolineare che l'elettroporazione non ha prodotto una citotossicità sostanziale in tutte le condizioni. La vitalità ha superato il 96% in tutti i gruppi, senza differenze significative tra le condizioni TRAC KO (97,1 ± 1%), NTC (96,8 ± 1%) e OCC (97 ± 1%) (Figura 3B, a destra). Insieme, questi dati dimostrano che l'elettroporazione DMF consente una robusta e ad alta efficienza di interruzione TRAC preservando la vitalità cellulare su più corse indipendenti. Le cellule T umane primarie sono state ottenute da fonti commerciali con il consenso informato del donatore e in conformità con le linee guida etiche istituzionali e dei fornitori.

Gestione di HEK293T sferoidi con microfluidica digitale
Successivamente, è stato valutato il flusso di lavoro di elettroporazione microfluidica digitale per applicazioni con strutture multicellulari tridimensionali. Gli sferoidi HEK293T cavi si sono formati seminando circa 100 cellule per pozzo in micropiastre a basso attacco e coltivando per 24 ore per permettere la formazione di sferoidi (Figura 4A). Gli sferoidi formati venivano successivamente raccolti, sosspesi e caricati sulla cartuccia microfluidica digitale per l'elettroporazione. Dopo il trattamento, gli sferoidi venivano scaricati in una piastra da 96 pozzi per l'imaging a valle e l'analisi della crescita.

Per ottenere un recupero medio di uno sferoide per pozzo dopo l'elettroporazione, un numero eccesso di sferoidi veniva intenzionalmente caricato sulla cartuccia per compensare la perdita di materiale durante la manipolazione e il trasferimento. Circa 192 sferoidi venivano risospesi in 100 μL di buffer di elettroporazione e caricati sulla cartuccia. Ogni famiglia di reazioni riceveva ~9,3 μL della sospensione, corrispondenti a ~18 sferoidi, con singole gocce contenenti ~1 μL (1–2 sferoidi per goccia). Poiché circa metà degli sferoidi rimaneva nella porta di carico durante il funzionamento della cartuccia, questa strategia di caricamento portava a una media di ~1 sferoide per ogni sito di elettroporazione tri-gocce.

L'analisi del recupero degli sferoidi ha indicato che 0–1 sferoidi venivano tipicamente scaricati per pozzo dopo l'elettroporazione, corrispondenti a circa 4–6 sferoidi recuperati per famiglia di reazioni (Figura 4B a sinistra del pannello). Questo recupero è inferiore al massimo teorico e riflette le perdite avvenute durante il lavaggio, l'aspirazione del surnatante e la ritenzione degli sferoidi nel porto di carico. Queste perdite sono attribuite al piccolo diametro dello sferoide (~100 μm) e alla difficoltà intrinseca di mantenere una distribuzione uniforme delle strutture non a cella singola all'interno della sospensione. Di conseguenza, alcuni sferoidi rimangono distribuiti in modo disomogeneo o non riescono a entrare nella regione tri-gocce. Caricare un numero eccesso di sferoidi ha garantito la presenza di almeno uno sferoide nella maggior parte dei siti di elettroporazione, permettendo un'analisi a valle coerente, come dimostrato dall'imaging al microscopio dello sferoide colorato con DAPI nella cartuccia microfluidica (Figura 4B, pannello destro). Ulteriori ottimizzazioni del processo possono ridurre il numero di sferoidi necessari per ottenere un recupero equivalente. Nonostante queste perdite nella manipolazione, il flusso di lavoro ha permesso un posizionamento delicato degli sferoidi intatti all'interno della geometria di elettroporazione a tre gocce.

Somministrazione e vitalità dell'EGFP mRNA negli sferoidi HEK293T
È stata osservata un'efficace somministrazione di mRNA di EGFP negli HEK293T sferoidi dopo l'elettroporazione (50 ng di mRNA GFP per sferoide). La microscopia a fluorescenza eseguita 24 ore dopo l'elettroporazione ha rivelato un'espressione robusta e spazialmente uniforme di GFP in tutti gli sferoidi elettroporati, mentre nessuna fluorescenza rilevabile è stata osservata in condizioni di controllo a 0 V o fuori dalla cartuccia (Figura 4C, pannello sinistro). L'analisi quantitativa dell'intensità media di fluorescenza (MFI) normalizzata per area sferoidea ha confermato il successo della trasfezione su entrambi i set di parametri di elettroporazione testati (Figura 4C, pannello centrale). In particolare, gli sferoidi elettroporati a 500 V, 2 ms, 2 impulsi hanno mostrato un MFI di 6,96 × ^10-5 ± 3,50 × ^10-5, mentre quelli elettroporati a 375 V, 6 ms, 1 impulso hanno mostrato un MFI di 5,05 × ^10-5 ± 3,29 × ^10-5. Non è stata rilevata alcuna fluorescenza misurabile nelle condizioni di controllo (0 ± 0). Entrambe le condizioni di elettroporazione hanno prodotto una fluorescenza significativamente superiore rispetto ai controlli (p < 0,05), senza differenze statisticamente significative tra i parametri dell'impulso. Per valutare se l'elettroporazione influisse negativamente sulla crescita degli sferoidi o sull'integrità strutturale, i diametri degli sferoidi sono stati misurati quotidianamente per 5 giorni dopo il trattamento. Gli sferoidi elettroporati hanno mostrato cinetiche di crescita paragonabili ai controlli non trattati, indicando che la trasfezione di mRNA non ha compromesso la vitalità degli sferoidi né la capacità proliferativa (Figura 4C, pannello destro). Insieme, questi risultati dimostrano che l'elettroporazione microfluidica digitale consente una consegna efficiente di mRNA in sferoidi multicellulari intatti, preservando al contempo l'integrità strutturale e la crescita, supportando la fattibilità di estendere questa piattaforma a modelli cellulari tridimensionali.

I dati sono presentati come media ± deviazione standard. La significatività statistica è stata determinata utilizzando ANOVA unidirezionale con la correzione post hoc di Tukey per confronti multipli, con una soglia di significatività di p < 0,05. I valori N rappresentano repliche biologiche indipendenti (donatori separati o serie indipendenti di cartucce) come specificato nella figura.

Figura 1. Architettura e flusso di lavoro della piattaforma di elettroporazione DMF. (A) Fotografia della cartuccia DMF. (B) Schema annotato della disposizione assemblata delle cartucce a 48-plex (immagine centrale), che mostra l'organizzazione (A–H) di otto famiglie identiche, ciascuna contenente sei siti di elettroporazione indirizzabili indipendentemente, con porte di carico elettrodi liquidi, porte di carico delle celle, anodo, catodo e regioni nano spot etichettate (immagine intasata a sinistra). Le caratteristiche chiave, tra cui porte di caricamento, porte di scarico e scattografi di assemblaggio, sono etichettate. La cartuccia viene assemblata con un attacco a scatto delle due piastre in un'unica orientazione corretta fino a percepire un innesto meccanico distinto. Immagine a destra: mappa delle dispense dei gestori di liquidi che mostra le posizioni codificate a colori per le porte di carico (rosso), le porte di scarico (rosa) e le regioni di individuazione dei bersagli (blu). (C) Sinistra: immagine che mostra l'accuratezza posizionale della distribuzione acustica su tutti i 48 siti (n = 48), con le posizioni delle gocce rappresentate rispetto al punto medio dell'elettrodo (mm). Il raggruppamento stretto conferma l'accuratezza della deposizione sub-millimetrica. A destra: immagini rappresentative che mostrano un punto correttamente centrato prima della reidratazione da parte della goccia cellulare (in alto) e durante la reidratazione, dove la goccia viene spostata avanti e indietro dove si trova la guida per essere risospesa (in basso, freccia rossa). (D) Immagine dall'alto di regioni di elettroporazione discrete, che mostra il movimento graduale delle goccioline da (i) reidratazione del carico utile spostando la goccia avanti e indietro sull'RNA guida depositato, (ii) spostamento verso il sito di elettroporazione, tra anodo e catodo, dove la goccia della cellula si unisce alle due gocce di elettrodo liquido laterali e viene pulsata, e (iii) il tri-drop completo si sposta al porto di scarico prima del recupero da parte del manipolatore di liquidi. (E) Schema di workflow end-to-end. L'RNA guida viene depositato sul substrato della cartuccia tramite un dispenser acustico. Le celle e il carico utile vengono preparati e caricati sulla cartuccia utilizzando un gestore automatico di liquidi. L'elettroporazione viene eseguita sulla piattaforma DMF. Le cellule vengono scaricate in una piastra da 96 pozzi e trasferite in un incubatore per il recupero. L'analisi a valle viene eseguita utilizzando citometria a flusso, microscopia, sequenziamento di nuova generazione o altre letture appropriate. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Impatto dell'integrazione polimerica sulla deposizione e sull'assemblaggio RNP. (A) L'integrazione polimerica migliora la fedeltà della deposizione acustica. Assorbimento della fluoresceina dopo deposizione e ricostituzione su quattro cartucce indipendenti, con o senza acido poli-L-glutammico. La varianza è stata ridotta a volumi intermedi (40–120 nL) in presenza di PGA. 
(B) Impatto della PGA sull'assemblaggio di Cas9–sgRNA. Curve di legame di affinità FIDA che misurano il raggio idrodinamico (Rh) in assenza (pannello sinistro) o presenza (pannello destro) di PGA. Lo sgRNA libero ha mostrato Rh di 3,45 ± 0,26 nm, mentre la titolazione Cas9 ha prodotto una dimensione del complesso RNP di 15,32 ± 0,46 nm (Kd = 0,70 ± 0,14 nM). L'aggiunta di PGA ridusse la dimensione del complesso e indebolì l'affinità di legame in modo dipendente dalla concentrazione. Con l'aggiunta di 0,005 mg/mL di PGA, lo sgRNA libero ha mostrato una Rh di 4,31 ± 0,07 nm, mentre la titolazione Cas9 ha prodotto una dimensione del complesso RNP di 10,21 ± 0,38 nm (K_d = 67,7 ± 9,5 nM). Gli esperimenti sono stati condotti in un tampone per saggio elettroporativo a bassa conducibilità con F-68 pluronico allo 0,05%. La fluorescenza è stata rilevata a 480 nm utilizzando il modulo LED integrato. Per tutti gli esperimenti è stato utilizzato un capillare rivestito permanentemente (Ø 75 μm, L = 100 cm). Per testare l'effetto dei polimeri polianionici sull'assemblaggio RNP, il PGA è stato aggiunto alle miscele di saggio a concentrazioni di 0,0025 mg/mL e 0,005 mg/mL. Queste condizioni sono state selezionate per modellare l'intervallo utilizzato nella microfluidica digitale, nell'elettrobagnatura e nei buffer di elettroporazione. Per l'analisi del legame diretto, è stato utilizzato come indicatore fluorescente uno sgRNA marcato con FAM a 10 nM che mira il locus TRAC. Concentrazioni crescenti di nucleasi Cas9 (fino a 500 nM) sono state titolate rispetto all'indicatore in un saggio CapMix per generare profili di dispersione per la formazione di complessi. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti a 25 °C, con ogni punto dati che consumava 40 nL di Indicatore e ~12 μL di analita (Cas9). Gli esperimenti sono stati condotti con la seguente sequenza: (1) lavaggio con acido fosforico allo 0,1% a 3.500 mbar per 30 secondi; (2) lavaggio con tampone di analisi a 3.500 mbar per 30 secondi; (3) riempire il capillare con analita a 3.500 mbar per 20 secondi; (4) iniettare l'indicatore a 50 mbar per 10 secondi; (5) mobilitazione e misurazione con analita a 400 mbar per 180 s. I raggi idrodinamici sono stati calcolati utilizzando la larghezza di picco estratta a metà altezza massima e costanti di dissociazione (K_D) erano determinati tramite regressione non lineare adattandosi a un modello di legame 1:1. (C) Effetto della PGA sulla stabilità RNP. Profili di dispersione di Taylor dei complessi Cas9–sgRNA con e senza PGA, eseguiti con nucleasi Cas9 da 500 nM e sgRNA marcati con FAM da 50 nM. In assenza di PGA, non è stato osservato un complesso stabile, come indicato dalla formazione crescente di grandi aggregati insieme a un segnale decrescente dal complesso nel tempo (a sinistra). L'aggiunta di 0,0025 mg/mL PGA ha prodotto un taylorgramma monodisperso ben definito con aggregazione minima di R_h ~ 9,6 nm (R² = 0,999, giusto). La stabilità complessa è stata valutata in condizioni standard di elettroporazione (500 nM Cas9 + 50 nM sgRNA) con o senza 0,0025 mg/mL PGA. I campioni sono stati premiscelati e mantenuti a 4 °C nel vassoio di ingresso, mentre le iniezioni sono state effettuate a intervalli di 10 minuti nell'arco di diverse ore. Gli esperimenti sono stati condotti con la seguente sequenza: (1) lavaggio con acido fosforico allo 0,1% a 3.500 mbar per 30 secondi; (2) lavaggio con tampone di analisi a 3.500 mbar per 30 secondi; (3) riempire il capillare con analite (tampone di saggio) a 3.500 mbar per 20 secondi; (4) iniettare l'indicatore a 50 mbar per 10 secondi; (5) mobilitazione e misurazione con analita a 400 mbar per 180 s. La formazione di complessi instabile è stata dimostrata attraverso la formazione di grandi aggregati (picchi nel Taylorgram) e il segnale decrescente. I complessi stabili sono stati identificati da Taylorgrammi monodispersi ben adattati (R² > 0,99), e R_h i valori sono stati estratti dai profili montati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Efficienza e vitalità del knockout alfa/beta TCR nelle cellule T primarie umane. (A) Strategia rappresentativa di citometria a flusso per singoleti vivi, sottoinsiemi di cellule T CD4⁺ e CD8⁺, ed espressione di TCRα/β in condizioni di controllo (sgRNA non targeting) e sperimentali (sgRNA TRAC). Le cellule sono state disegnate sequenzialmente su FSC/SSC, singoleti, vitalità e popolazioni CD4⁺ o CD8⁺ prima della valutazione dell'espressione superficiale TCRα/β. (B) Sinistra: TCRα/β efficienza di eliminazione nei sottoinsiemi di cellule T CD4⁺ e CD8⁺ in tre condizioni: TRAC KO, controllo non targeting (NTC) e controllo fuori cartuccia (OCC). CD4⁺: TRAC KO = 88,4 ± 4,9% (n = 40), NTC = 3,2 ± 4,7% (n = 24), OCC = 9,8 ± 5,1% (n = 18). CD8⁺: TRAC KO = 89,8 ± 4,2% (n = 40), NTC = 4,2 ± 7,4% (n = 24), OCC = 20,2 ± 4,9% (n = 18). Destra: Vitalità post-elettroporazione in tutte le condizioni, bloccata su singoletti. Vitalità: TRAC KO = 97,1 ± 1% (n = 40), NTC = 96,8 ± 1% (n = 24), OCC = 97 ± 1% (n = 18). I singoli punti dati sono mostrati con media e SD. n rappresenta esercizi di elettroporazione indipendenti su più cartucce e giorni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Efficiente consegna di mRNA negli sferoidi HEK293T tramite DMF-ection. (A) Diagramma del flusso di lavoro che descrive il processo di formazione degli sferoidi e l'esecuzione della trasfezione degli sferoidi. Cento HEK293T cellule vengono caricate per pozzo in micropiastre sferoidi specializzate e coltivate per 24 ore per formare sferoidi di 100 μm di diametro. Gli sferoidi (192) vengono scaricati e risospesi in 100 μL di buffer di trasfezione. Questa sospensione, con il carico utile appropriato, viene caricata sulla cartuccia DMF-ection a puntiate guida a 9,3 μL per famiglia. Una volta avvenuta l'elettroporazione, i campioni vengono scaricati in una piastra da 96 pozzi per l'analisi a valle. (B) Sinistra: Numero di sferoidi scaricati per famiglia sulla cartuccia DMF-ection rispetto ai comandi fuori cartuccia pipettati a mano. Centro: Immagine fluorescente del tri-drop, dove un quadrato rosso più grande delinea il tri-drop, e l'ovale rosso circonda lo sferoide. Destra: Immagine fluorescente che mostra la porta di caricamento con sferoidi carichi (cerchi blu). (C) Pannello sinistro: Immagini in campo chiaro di sferoidi HEK293T intatti prima dell'elettroporazione e immagini di fluorescenza degli sferoidi 24 ore dopo l'elettroporazione dell'EGFP mRNA, confrontate con i controlli a 0 V e fuori cartuccia. (D) Pannello superiore: Quantificazione dell'intensità media di fluorescenza normalizzata all'area sferoidea per due condizioni di elettroporazione (500 V, 2 ms, 2 impulsi; 375 V, 6 ms, 1 impulso). Non c'è differenza significativa tra le condizioni elettroporate, ma tutte le condizioni elettroporate sono significativamente diverse da 0 V e controlli fuori cartuccia (500 V 2 ms 2 impulso: 6,955 × ^10-5 ± 3,502 × ^10-5, 375 V 6 ms 1 impulso: 5,045 × ^10-5 ± 3,294 × ^10-5, 0 V: 0 ± 0, controllo fuori cartuccia: 0 ± 0 (*p < 0,05). Le immagini venivano elaborate utilizzando il pacchetto di elaborazione immagini^{FIJI 10}. (500 V, 2 ms, 2 impulsi: n = 6; 375 V, 6 ms, 1 impulso: n = 4; Controllo fuori cartuccia: n = 3; 0 V controllo: n = 3). (D) Pannello inferiore: diametro della sferoide dopo l'elettroporazione su 5 giorni in diverse condizioni. Il diametro è stato misurato utilizzando FIJI da immagini a contrazione di fase scattate a ingrandimento 20x con un microscopio invertito. (500 V, 2 ms, 2 impulsi: n = 6; 375 V, 6 ms, 1 impulso: n = 4; Controllo fuori cartuccia: n = 3; 0 V controllo: n = 3). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Questo protocollo descrive un flusso di lavoro microfluidico microfluidico miniaturizzato che consente una consegna intracellulare efficiente nelle cellule T primarie umane utilizzando gocce a scala nanolitro. Un vantaggio centrale di questo metodo è la capacità di eseguire l'editing genomico CRISPR–Cas9 utilizzando solo 10.000 celle per reazione, riducendo drasticamente i requisiti di materiale rispetto all'elettroporazione convenzionale. L'architettura basata sulle gocce supporta l'automazione, garantendo la gestione e l'assemblaggio di reazioni riproducibili su più siti paralleli.

In studi precedenti, il confronto diretto della piattaforma DMF-ection con un sistema ampiamente utilizzato ha dimostrato che la nucleofezione convenzionale produceva meno del 2% di cellule T GFP-positive a 10.000 celle per montaggio, mentre la piattaforma DMF-ection ha raggiunto un'efficienza di trasfezione del >90% nelle stesse condizioni di basso input. Per uno schermo in array di 192 condizioni, la piattaforma DMF richiedeva 25 volte meno celle e circa 50 volte meno Cas9 per condizione rispetto ai metodi^{convenzionali 9}. Questi confronti evidenziano i vantaggi materiali dell'elettroporazione DMF miniaturizzata per applicazioni a basso ingresso e screening

Passaggi critici e risoluzione dei problemi
Diversi passaggi sono fondamentali per il successo. Una calibrazione accurata del manipolatore acustico di liquidi garantisce una deposizione precisa dell'RNA guida sul substrato della cartuccia, essenziale per un assemblaggio coerente dell'RNP. Se le maculazioni sono incoerenti o le gocce non aderiscono al substrato, verifica che il PGA sia incluso nella miscela guida-RNA alla concentrazione corretta (5 mg/mL finale) e che il distributore acustico sia calibrato per la specifica geometria della piastra sorgente. Le spotting incoerenti a volumi intermedi (40–120 nL) sono più comunemente causate dal rimbalzo delle gocce sulla superficie idrofobica; Aumentare leggermente la concentrazione di PGA o ridurre l'altezza del dispensatore può risolvere questo problema.

Mantenere la corretta concentrazione cellulare prima del caricamento è importante, poiché le deviazioni di densità possono compromettere la formazione delle goccioline e ridurre l'efficienza di montaggio. Se l'efficienza di editing scende sotto il 75%, verifica prima che l'attivazione delle cellule T sia stata sufficiente (conferma la regolazione al rialzo di CD25 e CD69 tramite citometria di flusso prima dell'elettroporazione) e conferma che Cas9 e sgRNA siano stati combinati immediatamente prima del caricamento e non in anticipo.

Gli additivi polimerici svolgono un ruolo importante nella stabilizzazione dei complessi Cas9–sgRNA nelle condizioni di tampone di^{elettroporazione 11}. Sebbene il PGA riduca l'affinità nominale di legame, il suo effetto stabilizzante migliora la riproducibilità e previene l'aggregazione a volumi di nanolitri. Questo rappresenta un parametro sintonizzabile per i ricercatori che adattano il flusso di lavoro ad altri complessi proteina–RNA.

Risoluzione dei problemi
Ponte di gocce fallito
Rivedere il rapporto di controllo qualità strumentale post-esecuzione dopo ogni esperimento. L'assenza di corrente rilevata indica un fallimento del bridging, dovuto a gocce insufficienti o a mancato fuso, ed è automaticamente segnalato dal sistema. I siti interessati non possono essere recuperati nello stesso saggio. Se i guasti sono sporadici (<10%), non è necessaria alcuna azione; distribuire repliche su più cartucce per minimizzare l'impatto. Se i guasti sono sistematici, esegui la scheda di controllo qualità e il controllo di salute del sistema e contatta il supporto tecnico se persistono problemi.

Spotting incoerente dello sgRNA
Dopo la dispensazione, confermare visivamente che tutte le gocce attese siano presenti, centrate all'interno dei confini degli elettrodi e prive di gocce satellitari. Includere PGA nella miscela di RNA guida per prevenire la polidispersione. Per le gocce mancanti, controlla il rapporto di funzionamento del dispensatore e ri-dispensa se necessario. Per una formazione scarsa del menisco, mantenere almeno 5 μL per pozzo, far ruotare brevemente la piastra e battere delicatamente su una superficie piana. Lavora sul ghiaccio e sigilla le piastre quando non sono in uso per prevenire l'evaporazione.

Riduzione dell'efficienza di montaggio
Se si osserva una riduzione dell'efficienza di montaggio, si verifica il problema nell'ordine seguente: (1) validare le condizioni di consegna utilizzando l'EGFP mRNA prima di procedere con RNP; (2) confermare che la corrente di QC misurata corrisponde ai valori attesi; (3) densità cellulare titolata, RNA guida e concentrazione di Cas9; (4) confermare un'elevata vitalità delle celle immediatamente prima del caricamento; (5) verificare l'integrità del reagente e le condizioni di conservazione; (6) confermare che il metodo di lettura sia appropriato per la densità cellulare e il target di interesse.

Adattamento della piattaforma a tipi e modelli cellulari alternativi
Per altri tipi primari di cellule immunitarie, come le cellule NK o le cellule T regolatorie, i parametri di elettroporazione richiederanno ottimizzazione. La dimensione delle cellule è un determinante importante della soglia del campo elettrico richiesta per la permeabilizzazione della membrana: le cellule più piccole richiedono intensità di campo più elevate, mentre quelle più grandi sono permeabilizzate a tensioni più basse—una relazione ben documentata nella biofisica dell'elettroporazione. Come punto di partenza per tipi di cellule più piccole delle cellule CD3⁺ attivate, si deve mantenere o aumentare leggermente la tensione (500–550 V) mantenendo la durata dell'impulso breve (2–3 ms) per evitare stress termico eccessivo. Per celle più grandi, ridurre la tensione a 350–400 V e modulare la durata dell'impulso senza superare i 10 ms. Inoltre, la micro-ottimizzazione a livello di donatore è una pratica comune nell'elettroporazione, e i parametri validati nelle cellule sane di donatore potrebbero non tradursi direttamente in materiale malato o derivato dal paziente. Le cellule di donatori con neoplasie ematologiche, infezioni croniche o immunodeficienza mostrano frequentemente proprietà biofisiche alterate, e l'efficienza e la vitalità del montaggio dovrebbero essere rivalutate per ogni nuovo donatore, soprattutto quando si lavora con campioni non sani o clinici. La vitalità cellulare dovrebbe essere valutata a 24 ore e 72 ore dopo l'elettroporazione e i parametri devono essere regolati iterativamente. Il dosaggio di Cas9 potrebbe anche dover essere aumentato di 1,5–2× rispetto al protocollo delle cellule T se l'efficienza di somministrazione RNP è ridotta.

Per modelli 3D più grandi o più densi, come organoidi con diametro superiore a 200 μm, la guarnizione nella cartuccia può richiedere modifiche per adattarsi a dimensioni maggiori della struttura e barriere di diffusione. Gli utenti che tentano tali applicazioni dovrebbero considerare la pre-dissociazione degli strati cellulari esterni per migliorare la penetrazione dei reagenti o l'applicazione di condizioni di impulsi multipli in sequenza. Contatta l'autore corrispondente per indicazioni sull'adattamento della geometria delle gocce e dei parametri dell'impulso per strutture oltre i 100 μm di diametro sferoideo validato qui.

Rilevanza traslazionale
Il potenziale traslazionale di questo flusso di lavoro va oltre il semplice knockout. La piattaforma è stata applicata al knock-in di riparazione diretto dall'omologia di un costrutto GFP da 4 kb e di un CAR anti-HER2 funzionale al locus TRAC nelle cellule T primarie, nonché a uno schermo CRISPR array a 45 bersagli che identifica nuovi regolatori dell'esaurimento delle cellule T^{CD4⁺ 9}. Queste applicazioni illustrano un percorso dall'ottimizzazione a livello di protocollo alla scoperta funzionale in modelli cellulari primarie clinicamente rilevanti. Tuttavia, restano importanti limitazioni: esiti funzionali come i tassi di interruzione allelica tramite sequenziamento, secrezione di citochine e ingertamento in vivo non sono stati valutati nell'attuale protocollo e rappresentano i passi necessari per la traduzione terapeutica. Inoltre, sebbene la piattaforma supporti 48 reazioni parallele per cartuccia, sarà necessaria la parallelizzazione multi-cartuccia per schermi più grandi.

Limitazioni
Come per qualsiasi piattaforma miniaturizzata, devono essere riconosciuti alcuni vincoli pratici. Il fenotipaggio a valle deve essere adattato alla piccola scala di reazione; L'acquisizione della citometria a flusso può richiedere ulteriori passaggi di concentrazione o il pooling dei pozzi replicati per ottenere un numero sufficiente di eventi. Le impostazioni di elettroporazione della piattaforma potrebbero anche richiedere ottimizzazione per tipi di celle con alta sensibilità ai campi elettrici, e gli utenti dovrebbero considerare i parametri pubblicati come punti di partenza piuttosto che come valori universalmente fissi. Infine, la colorazione formale di vitalità in momenti prolungati post-elettroporazione non è stata eseguita per il flusso di lavoro sferoideo presentato qui; Il tracciamento della crescita basato sul diametro è stato utilizzato come misura surrogata dell'integrità strutturale e rappresenta una direzione importante per la caratterizzazione futura.

In generale, la DMF-ection, un metodo di trasfezione non virale, offre un approccio potente e flessibile per l'editing genomico e la somministrazione di mRNA in contesti a basso input e ad alta produttività. La sua compatibilità con le cellule T primarie, i modelli 3D strutturati e la gestione automatizzata dei liquidi amplia le opportunità nell'ingegneria della terapia cellulare, nello screening multi-condizione CRISPR e nella genomica funzionale miniaturizzata.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 Channel VOYAGER Adjustable Tip Spacing Pipette	Integra	4732	Strumentazione
1x PBS	Gibco		Flow Buffer
96 Well Plate, Sphera Low-Attachment Surface	Thermo Fisher	174927	Protocollo Spheroids
96-well conical-bottom plate	Sarstedt	82.1583.001	Protocollo Spheroids
Alexa Fluor 647 anti-human CD4 Antibody	Biolegend	357421	1 in 200, Clone A161A1
Attune Flow Cytometer	ThermoFisher		Strumentazione
DMEM Media	Gibco	10564011	Supplemento media- coltura Spheroids
DMF compatible buffer	DropGenie		Trasfezione
DropGenie Transfection System	DropGenie		Strumentazione
Echo Acoustic Dispenser 650 Series	Beckman Coulter Life Scienes
Echo Qualified 384-well Low Dead Volume	Beckman Coulter Life Scienes
EDTA	Invitrogen		Flow Buffer
EGFP mRNA	Trilink	L-7201
EVOS Fluorescent Microscope	ThermoFisher		Strumentazione
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000044	Supplemento media- coltura Spheroids
Fida 1 instrument and Fida Neo 480 nm detector	Fida Biosystems ApS		Strumentazione
Ghost Dye Violet 510	Cytek Biosciences	13-0870
HEK293T Cells	ATCC		Protocollo Spheroids
Human IL-2 Recombinant Protein,	Peprotech	200-02 50ug	Supplemento media T cell
Human Primary Pan CD3+ T Cells	All Cells		Sangue periferico, Crioconservato, Pan CD3+ Helper T Cells, Selezionati Negativamente
Immunocult CD3/CD28 Activator	StemCell Technologies	10970	Media per attivazione T Cell
Immunocult Expansion Media	StemCell Technologies	10981	Media per attivazione T Cell
Incucyte Live Cell Analysis System	Sartorius		Strumentazione
INTEGRA ASSIST PLUS pipetting robot	Integra	4505, 4-Position Portrait Deck (PN 4521),	Strumentazione
non targeting synthetic guide RNA	Synthego		5’ GCACTACCAGAGCTAACTCA 3'
NucleoCounter NC-202	Chemometec
PE anti-human TCR α/β Recombinant Antibody	Biolegend	380805	1 in 200, Clone QA20B12
PE-Cy 7 Anti-Human CD8	BD Pharmingen	557750	1 in 200, Clone RPA-T8
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122	Supplemento media- coltura Spheroids
Poly-L-glutamic Acid (PGA)	Sigma Aldrich	P4761-100MG	Utilizzare a 100mg/ml
Prism version 8.0.0	GraphPad Software, Inc.		Software
sNLS-SpCas9-sNLS Nuclease	IDT	10017687
Spheroid Microplate	Corning	3830	Protocollo Spheroids
Surfactant F	DropGenie		Trasfezione- utilizzare a 1:20 in buffer DMF compatibile per preparare il buffer di trasfezione completo
TRAC synthetic guide RNA	Synthego		5’ AGAGTCTCTCAGCTGGTACA 3'
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25-300-062	Protocollo Spheroids