Articolo metodologico

Rilevamento della senescenza utilizzando luce riflessa nella frazione vascolare stromale adiposa

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DOI:

10.3791/70588

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5 giugno 2026

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1Department of Cell and Molecular Biology, Karolinska Institutet, 2Nordiska Kliniken Stockholm

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo presenta una microscopia confocale a luce riflessa per la rilevazione oggettiva e monocellulare dell'attività beta-galactosidasi associata alla senescenza (SA-β-gal) nella frazione stromale vascolare isolata dal tessuto adiposo umano. Il metodo è compatibile con l'immunocitochimica, incorpora controlli del pH per la valutazione quantitativa e offre inoltre un'alternativa più sensibile e meno soggettiva rispetto alla colorazione convenzionale SA-β-gal.

Abstract

La senescenza cellulare è uno stato indotto dallo stress caratterizzato da un arresto permanente del ciclo cellulare e dallo sviluppo di un profilo secretorio distintivo che influisce sulla funzione tissutale e contribuisce all'invecchiamento e alle malattie metaboliche. L'attività di β-galattosidasi (SA-β-gal) associata alla senescenza è ampiamente utilizzata come marcatore delle cellule senescenti; tuttavia, i saggi convenzionali SA-β-gal spesso si basano su una valutazione visiva soggettiva e forniscono informazioni quantitative limitate. Queste limitazioni sono particolarmente evidenti nelle popolazioni cellulari primarie umane come la frazione vascolare stromaica (SVF) derivata dal tessuto adiposo, che contiene una miscela eterogenea di preadipociti, cellule immunitarie e cellule endoteliali. Qui presentiamo un approccio ottimizzato di microscopia confocale a luce riflessa per la rilevazione quantitativa ad alta risoluzione dell'attività SA-β-gal nelle cellule SVF umane. Questo protocollo consente un'analisi oggettiva a singola cellula dell'attività SA-β-gal, consente un'immunocitochimica simultanea per la rilevazione multiplexata di ulteriori marcatori di senescenza o lineaggio, e incorpora controlli con pH-match. Combinando queste caratteristiche, questo metodo fornisce un approccio sensibile, riproducibile e quantitativo allo studio della senescenza cellulare in popolazioni cellulari primarie umane eterogenee. Offre un'alternativa migliorata rispetto alla tradizionale colorazione SA-β-gal.

Introduzione

La senescenza cellulare è una risposta multifaccettata che può derivare da molti tipi di stress, tra cui danni al DNA, attrito dei telomeri e attivazione degli oncogeni. Porta a un arresto stabile del ciclo cellulare insieme a un aumento della resistenza all'apoptosi, in parte dovuto all'induzione di proteine anti-apoptotiche 1,2. La senescenza è stata collegata a un miglioramento della sopravvivenza cellulare in contesti in cui la conservazione dell'integrità tissutale è essenziale, come la riparazione e la manutenzione 3,4. Oltre al suo ruolo nell'omeostasi tissutale, la senescenza contribuisce anche allo sviluppo normale modellando il patternembrionale 5,6 e come barriera alla formazione tumorale promuovendo la eliminazione di cellule danneggiate o potenzialmentemaligne 7,8,9. Sebbene la senescenza possa avere funzioni benefiche, numerosi studi hanno evidenziato un aspetto contrastante in cui le cellule senescenti acquisiscono un profilo secretorio pro-infiammatorio che può disturbare il metabolismo locale, danneggiare i tessuti circostanti e persino sostenere la progressionetumorale 10,11,12,13.

La senescenza è stata rilevata in diversi tipi cellulari in molteplici tessuti ed è spesso associata all'invecchiamento, alle malattie, alla disfunzione tissutale o al cancro. Nel fegato, la senescenza delle cellule stellate epatiche ha dimostrato di promuovere la progressione tumorale alterando l'omeostasi metabolica tramite fattorisecreti 14,15. Studi che esaminano epatociti16 o biopsie epaticheintere 17 indicano che la senescenza in queste cellule può contribuire a comorbidità metaboliche come la steatopatia epatica associata a disfunzione metabolica e la steatoepatite associata a disfunzione. Inoltre, la relazione tra diabete di tipo 2 e senescenza ha ricevuto notevole attenzione nell'ultimo decennio, con evidenze che collegano la senescenza a complicazioni legate al diabete nelle cellule β pancreatiche, negli epatociti16 e negliadipociti 18,19,20,21. Questi risultati evidenziano l'importanza di identificare con precisione le cellule senescenti nei tessuti metabolici, dove la loro accumulazione ed eterogeneità contribuiscono alla progressione della malattia e al targetingterapeutico 22.

I cambiamenti di segnalazione e espressione proteica associati alla senescenza sono spesso specifici per cellule e tessuti; tuttavia, diverse caratteristiche sono generalmente caratteristiche delle cellule senescenti. Uno dei marcatori più diffusi è l'aumento dell'attività enzimatica della β-galactosidasi al pH 6,0, nota come β-galactosidasi associata alla senescenza (SA-β-gal)23. β-galactosidasi è un'idrolasi lisosomale presente in tutte le cellule ed è normalmente attiva a pH acido (~4,5–5,0), dove contribuisce alla degradazione dei substrati glicosilati. La caratteristica distintiva della SA-β-gal è la ritenzione dell'attività della β-galactosidasi in condizioni di pH subottimali. Nel saggio classico, le cellule vengono incubate con il substrato sintetico 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranoside (X-gal) al pH 6,0, dove l'attività enzimatica è ridotta nella maggior parte delle cellule ma rimane rilevabile nelle cellule senescenti. Questo porta alla formazione di un precipitato blu insolubile che può essere visualizzatomicroscopicamente 24.

Sebbene questo saggio sia stato ampiamente adottato, la rilevazione del precipitato X-gal si è tradizionalmente basata sulla microscopia da campo chiaro. Il rilevamento in campo chiaro si basa sull'identificazione visiva del precipitato blu e quindi ha una sensibilità limitata ai segnali a basso livello e agli stati di senescenza precoce. Al contrario, l'imaging con luce riflessa cattura la densità ottica del precipitato X-gal, consentendo una rilevazione quantitativa su un ampio intervallo dinamico. Più recentemente, sono stati sviluppati substrati fluorogenici per migliorare la sensibilità25. Tuttavia, questi approcci tipicamente misurano l'attività della β-galactosidasi in condizioni che non preservano la definizione classica dipendente dal pH di SA-β-gal. Di conseguenza, possono aumentare l'intensità del segnale ma ridurre la specificità per la senescenza. Al contrario, l'opacità intrinseca del precipitato X-gal ne consente la rilevazione tramite immagini confocali riflesse a luce riflessa, fornendo una lettura più sensibile e quantitativa mantenendo la definizione enzimatica originale di SA-β-gal26.

Nel corso degli anni sono stati identificati ulteriori segni distintivi della senescenza, tra cui l'aumento dell'espressione degli inibitori chinasi dipendenti da ciclina P16 e P21, così come il fattore di trascrizione P53, che regola l'arresto del ciclo cellulare e altri programmidi senescenza 27,28,29,30,31,32,33 . Questi progressi hanno portato a una definizione più solida di senescenza, in cui le cellule vengono tipicamente classificate in base alla presenza combinata di più marcatori. In pratica, tuttavia, questi marcatori vengono spesso misurati utilizzando modalità diverse: i marcatori nucleari, come P16 e P21, vengono tipicamente rilevati con tecniche basate sulla fluorescenza, mentre l'attività SA-β-gal è tradizionalmente stata valutata tramite microscopia a campo chiaro. Questa separazione ha limitato la capacità di valutare molteplici caratteristiche di senescenza all'interno della stessa cellula. L'imaging con luce riflessa supera questa limitazione consentendo l'integrazione diretta della rilevazione SA-β-gal con marcatori basati su fluorescenza all'interno di un unico flusso di lavoro di imaging, facilitando una valutazione più robusta e biologicamente significativa della senescenza in popolazioni cellulari eterogenee.

Sebbene Dedic e colleghi affrontino diverse limitazioni dell'imaging tradizionale SA-β-gal, tra cui il miglioramento della sensibilità, l'uso di controlli a pH abbinati per la soglia oggettiva e la compatibilità con l'immunocitochimica, il loro metodo confocale a luce riflessa è stato ottimizzato specificamente per adipociti maturiisolati 26. Tuttavia, la senescenza nel tessuto adiposo non è limitata agli adipociti 34,35, e ulteriori informazioni possono essere acquisite esaminando la frazione stromaica vascolare (SVF). La SVF comprende preadipociti, popolazioni endoteliali e fibroblastiche, e diverse cellule immunitarie, tutte le quali possono subire senescenza e contribuire al rimodellamento adiposo, all'infiammazione e alla segnalazione metabolica alterata. Caratterizzare la senescenza all'interno di questo compartimento eterogeneo è quindi importante per collegare processi specifici di tipo cellulare a risultati a livello tissutale e sistemici.

Qui, estendiamo la rilevazione della luce riflessa SA-β-gal alle cellule SVF, permettendone l'applicazione su più tipi di cellule del tessuto adiposo. Combinando questo approccio con l'immunocitochimica, il metodo consente un'analisi integrata a singola cellula dell'attività SA-β-gal insieme a lineage e marcatori funzionali nei campioni umani primari.

Protocollo

Tutti gli esperimenti furono condotti in conformità con gli statuti della Dichiarazione di Helsinki. Lo studio è stato approvato dal comitato etico regionale di Stoccolma, DNR 2012/50-31.

1. Preparazione delle celle

  1. Utilizzare cellule della frazione vascolare stromaica (SVF) isolate dal tessuto adiposo umano tramite digestione della collagenasi.
    NOTA: La resa cellulare varia a seconda della dimensione della biopsia e della composizione tissutale; tuttavia, circa 1,0 × 106 cellule SVF sono tipicamente ottenute per ogni 10 g di tessuto adiposo.

2. Colorazione X-gal e preparazione delle vetrine

  1. Fissare le celle in 1 mL di paraformaldeide (PFA) al 2% in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL per 20 minuti a temperatura ambiente (RT) su un bilanciere.
  2. Centrifuga a 600 × g per 10 minuti e rimuovi il soprantantante.
  3. Prepara la soluzione di colorazione X-gal utilizzando il kit di tintura senescenza β-Galactosidasi secondo le istruzioni del produttore.
  4. Dividere la soluzione di colorazione in 3 tubi (1 mL ciascuno) e regolare il pH a 5, 6 e 8 con 1 M HCl e 1 M NaOH. Misura il pH usando un misuratore calibrato.
  5. Aggiungere la soluzione X-gal a 0,5 × 106 cellule per la condizione e incubare per 24 ore a 37 °C senza CO2.
  6. Centrifuga a 600 × g per 10 minuti e rimuovi il soprandante.
  7. Lavare le celle con PBS (pH 7), centrifugare a 600 × g per 10 minuti e rimuovere il soprantantante.
  8. Prepara una soluzione primaria di anticorpi (CD31 [1:200] o controllo IgG [1:333]) in siero dell'asino normale (NDS) al 5%. Incubare le cellule durante la notte a 4 °C.
  9. Lava le cellule 3 volte in PBST (0,1%) per 10 minuti a RT su un rocker.
  10. Prepara una soluzione secondaria di anticorpi (anti-topo Alexa Fluor 555 [1:500]) e agglutinina germinale di grano (WGA [1:200]) in un 5% di NDS. Incuba per 1 ora a RT su un dondolo.
  11. Centrifugare a 600 × g per 10 minuti e rimuovere la soluzione secondaria di colorazione anticorpale.
  12. Lava le celle 3 volte in PBST (0,1%) per 10 minuti su un rocker a RT.
  13. Centrifuga a 600 × g per 10 minuti e rimuovi il soprantantante.
  14. Risospendere le cellule nel montante antifade.
  15. Pipetta la sospensione delle celle su vedute microscopiche.
  16. Lascia che il mezzo di montaggio si indurisca durante la notte a RT per immobilizzare le cellule.
  17. Aggiungi 100 μL di glicerolo al 100%, metti un sottocoperto sopra e sigilla con lo smalto.

3. Microscopia

NOTA: Cellule immagine con microscopio confocale configurate per il rilevamento della luce riflessa. Il segnale di luce riflessa dovrebbe essere raccolto alla lunghezza d'onda di eccitazione o nelle vicinanze utilizzando uno splitter di fascio fornito dal produttore o una configurazione a specchio dicroico. Usa un obiettivo al 30× con olio di silicone (apertura numerica 1.05) per tutti gli esperimenti.

  1. Seleziona l'impostazione dello splitter di fascio T90/R10 all'interno del software del microscopio.
  2. Usare l'eccitazione a 633 nm e raccogliere la luce riflessa tra 635 e 645 nm.
  3. Acquisire segnale Hoechst usando eccitazione a 405 nm.
  4. Acquisire il segnale WGA usando eccitazione a 488 nm.
  5. Acquisire il segnale CD31 usando eccitazione a 555 nm.
  6. Imposta la dimensione Z del passo all'ottimale del sistema (0,74 μm) e definisci uno stack Z basato sul segnale a membrana per catturare l'intero volume della cella.
  7. Acquisire immagini utilizzando le stesse impostazioni di acquisizione per tutti i campioni. Salva file nel formato nativo del microscopio (ad esempio, .oir) senza compressione.

4. Analisi delle immagini

NOTA: Analizza le immagini usando ImageJ e CellProfiler.

  1. Dividere i canali in ImageJ per generare Z-stack per ogni canale (405, 488, 555, 633).
  2. Genera proiezioni di intensità sommata usando la funzione Z Project ed esporta come file TIFF a 16 bit.
  3. Importare immagini in CellProfiler (versione 4.2.8) per la segmentazione automatica delle celle e la quantificazione dell'intensità della luce riflessa per cella (Figura Supplementare 1 e Figura Supplementare 2).
  4. Esporta le misurazioni di intensità in un foglio di calcolo per l'analisi a valle.

5. Punteggio SA-β-gal

  1. Definire la soglia per la positività SA-β-gal come l'intensità media della luce riflessa della condizione di pH 8 più tre deviazioni standard.
  2. Classificare le cellule in condizioni di pH 6 con valori di intensità superiori a questa soglia come SA-β-gal positivi.

Risultati

La colorazione riflessa SA-β-gal delle cellule SVF umane ha prodotto schemi chiari e riproducibili nelle tre condizioni controllate dal pH. La colorazione CD31 è stata inclusa per identificare le cellule endoteliali all'interno della SVF, permettendo di distinguere queste cellule da altre popolazioni. Sebbene fosse presente solo un piccolo numero di cellule CD31-positive, il marcatore ha confermato la presenza di cellule endoteliali e ha dimostrato la compatibilità del metodo con campioni primari eterogenei.

La condizione di pH 5 generava un segnale forte nella maggior parte delle cellule, coerente con un'elevata attività endogena di beta galattosidasi a pH acido (Figura 1Aa–Ac). Al pH 6, la condizione utilizzata per valutare l'attività SA-β-gal, l'intensità della colorazione è stata ridotta rispetto al pH 5, e solo un sottoinsieme di cellule ha mostrato segnale sopra il fondo (Figura 1Ba–Bc). Questo cambiamento sia nell'intensità che nella frequenza del segnale è coerente con la dipendenza prevista dal pH del test e consente l'identificazione di cellule con attività SA-β-galactosidasi mantenuta in condizioni subottimali. La condizione di pH 8 produceva un segnale luminoso riflesso minimo, con la maggior parte delle cellule vicine o ai livelli di fondo (Figura 1Ca–Cc). Questa condizione è stata utilizzata per definire la soglia di positività SA-β-gal, indicata dalla linea tratteggiata rossa nella Figura 1A c,Bc,Cc.

Per l'analisi quantitativa, la soglia per l'attività SA-β-gal è stata definita come l'intensità media della luce riflessa della condizione pH 8 più tre deviazioni standard. Le cellule in condizioni di pH 6 con valori di intensità superiori a questa soglia sono state classificate come SA-β-gal positive. Questo approccio fornisce un cutoff obiettivo e basato sui dati che tiene conto del segnale di fondo e minimizza la classificazione dei falsi positivi.

Per valutare la sensibilità e la compatibilità della rilevazione con l'immunocitochimica, sono state confrontate immagini a luce riflessa e a campo chiaro in tutte le condizioni di pH. A pH 5 (Figura 2Aa–Ad), la luce riflessa ha rivelato un forte precipitato X-gal, mentre il campo chiaro ha rilevato solo i depositi più prominenti. A pH 6 (Figura 2Ba–Bd), la luce riflessa ha identificato cellule SA-β-gal positive che non erano rilevabili in modo affidabile dal campo chiaro, dove il segnale appariva debole o diffuso. A pH 8 (Figura 2Ca–Cd), la luce riflessa ha rilevato un segnale minimo, coerente con una bassa attività enzimatica, mentre il campo chiaro non ha rivelato precipitazioni rilevabili. Queste osservazioni indicano che l'imaging a luce riflessa fornisce una migliore rilevazione del precipitato X-gal, in particolare a livelli di attività intermedi e bassi.

Il saggio SA-β-gal a luce riflessa è stato eseguito anche su una piastra a 96 pozzi (Figura supplementare 3). Questa configurazione ha portato a un aumento del segnale di fondo dovuto alla riflessione dalla superficie plastica, riducendo il contrasto tra celle positive e negative. Imperfezioni superficiali, come graffi, aumentano ulteriormente la riflessione dello sfondo (Figura supplementare 3, frecce nere). Di conseguenza, l'analisi quantitativa è stata meno affidabile rispetto all'imaging su vetri di copertura. Se è richiesto un formato a placca, si raccomandano piastre con fondo di vetro per una rilevazione ottimale del segnale.

Insieme, questi risultati mostrano una chiara separazione tra la condizione di pH 5 fortemente positiva, il segnale intermedio a pH 6 e il fondo minimo a pH 8. Questo schema è coerente con il comportamento atteso del saggio e supporta l'uso dell'imaging a luce riflessa per la rilevazione dell'attività di SA-β-gal in popolazioni cellulari primarie eterogenee.

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Figura 1: Rilevamento β di luce riflessa dipendente dal pH nelle cellule SVF.
WGA (Aa, Ba, Ca) e l'imaging a luce riflessa (Ab, Bb, Cb) rilevano il precipitato X-gal in condizioni di pH 5, 6 e 8. Il segnale è più forte al pH 5, ridotto al pH 6 e minimo al pH 8. La quantificazione dell'intensità della luce riflessa (Ac, Bc, Cc) mostra la distribuzione dell'attività della β-galactosidasi in ciascuna condizione. Ogni punto rappresenta una singola cellula, e la linea tratteggiata rossa indica la soglia utilizzata per classificare le cellule SA-β-gal-positive. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Confronto tra luce riflessa e rilevamento SA-β-gal in campo chiaro nelle cellule SVF. Immagini ingrandite di cellule SVF colorate con X-gal a pH 5, 6 e 8 mostrano colorazione WGA (Aa, Ba, Ca), colorazione CD31 (Ab, Bb, Cb) per identificare cellule endoteliali, immagini a luce riflessa (Ac, Bc, Cc) per rilevare il precipitato X-gal e corrispondenti immagini in campo chiaro (Ad, Bd, Cd). L'imaging con luce riflessa rileva precipitazioni X-gal in diverse condizioni, mentre i campi luminosi rivelano principalmente depositi di intensità elevata e forniscono una rilevazione limitata a livelli di segnale più bassi. La colorazione CD31 si osserva sia in condizioni di pH 5 che di pH 6, permettendo l'identificazione delle cellule endoteliali. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1: Panoramica della pipeline CellProfiler. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 2: Flusso di lavoro per la segmentazione di nuclei e cellule. Immagini rappresentative di (A) nuclei colorati con Hoechst e (B) corrispondente segmentazione dei nuclei. (C) Segmentazione cellulare basata sulla colorazione della membrana. (D) sovrapposizione di nuclei e confini cellulari. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 3: Imaging a luce riflessa SA-β-gal in una piastra a 96 pozzi con fondo di plastica. (A) colorazione WGA e (B) imaging a luce riflessa di celle SVF colorate a X-gal in una piastra standard a fondo plastico a 96 pozzi. Si osserva un segnale di fondo aumentato rispetto all'imaging su vetro, coerente con la riflessione della luce dalla superficie plastica, riducendo il contrasto per il rilevamento SA-β-gal. I graffi superficiali (frecce nere) aumentano ulteriormente il segnale di fondo (B). Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

La β-galattosidasi associata alla senescenza è uno dei marcatori più utilizzati per identificare le cellule senescenti; tuttavia, i metodi tradizionali di rilevamento dei campi luminosi sono limitati da una bassa sensibilità e un alto grado di soggettività. L'imaging a luce riflessa delle cellule SVF colorate con X-gal fornisce un approccio più sensibile e riproducibile per misurare l'attività SA-β-gal a livello di singola cellula, rimanendo compatibile con la colorazione con anticorpi fluorescenti. Ottimizzando questo metodo per la SVF, l'attività SA-β-gal può essere rilevata insieme a marcatori cellulari specifici come CD31, permettendo l'analisi di popolazioni cellulari primarie eterogenee senza la necessità di ordinamento cellulare.

Diversi parametri tecnici sono critici per un'implementazione affidabile. Una calibrazione accurata del pH della soluzione di colorazione X-gal è essenziale, poiché piccole deviazioni possono alterare l'attività enzimatica e influenzare il rilevamento del segnale. Il misuratore di pH deve essere calibrato immediatamente prima dell'uso con tamponi standard (ad esempio, pH 4,0 e pH 7,0), e il pH della soluzione di colorazione deve essere verificato dopo la preparazione. Inoltre, l'acquisizione dello Z-stack deve catturare l'intero volume della cella, poiché una copertura incompleta porta a una sottostima dell'intensità della luce riflessa. I parametri di immagigine, inclusi la potenza del laser e il guadagno del rivelatore, dovrebbero essere ottimizzati per massimizzare il segnale senza saturazione e mantenere la coerenza tra i campioni.

Rispetto agli saghi alternativi di senescenza, l'imaging a luce riflessa offre diversi vantaggi. La rilevazione SA-β-gal in campo chiaro si basa sull'identificazione visiva del precipitato e quindi ha una sensibilità limitata e non è facilmente compatibile con l'analisi multiplexata. Al contrario, l'imaging con luce riflessa rileva la densità ottica del precipitato X-gal preservando la definizione enzimatica dipendente dal pH di SA-β-gal. Ciò consente la rilevazione simultanea dell'attività SA-β-gal insieme a marcatori basati sulla fluorescenza, consentendo di valutare la senescenza utilizzando molteplici caratteristiche all'interno delle singole cellule.

Nonostante questi vantaggi, il metodo presenta delle limitazioni. L'imaging con luce riflessa rileva la densità ottica del precipitato X-gal ma non può distinguere in modo definitivo questo segnale da altre strutture intracellulari dense, rendendo essenziali condizioni controllate dal pH. La condizione pH 8 fornisce una base per la luce riflessa di fondo e supporta la discriminazione tra segnali specifici e non specifici. L'approccio richiede anche un microscopio confocale con capacità appropriate di rilevamento della luce riflessa, che potrebbero non essere disponibili su tutti i sistemi. Inoltre, le proprietà della superficie di imaging possono influenzare la qualità del segnale: le piastre con base di plastica aumentano il fondo dovuto alla riflessione e riducono il contrasto, mentre le superfici di vetro forniscono una rilevazione più affidabile.

Questo metodo si basa sul lavoro di Dedic et al., che hanno stabilito l'imaging a luce riflessa per il rilevamento SA-β-gal negli adipociti maturi, ed estende l'approccio a una gamma più ampia di tipicellulari 26. L'applicazione a SVF appena isolata dimostra che la rilevazione da luce riflessa del precipitato X-gal è compatibile con diverse popolazioni cellulari primarie umane. La capacità di combinare la rilevazione SA-β-gal con marcatori di linea come CD31 consente ulteriormente l'analisi di sottopopolazioni definite all'interno di tessuti eterogenei.

Sebbene la variabilità tra donatori sia attesa nei campioni umani primari, l'obiettivo di questo studio è stabilire l'implementazione tecnica del metodo piuttosto che caratterizzare la variabilità biologica. Le future applicazioni su più campioni biologici o condizioni sperimentali dovrebbero includere analisi statistiche appropriate. Inoltre, la validazione in modelli consolidati di induzione della senescenza e l'integrazione con marcatori di senescenza ortogonali affineranno ulteriormente l'interpretazione dell'attività SA-β-gal nelle popolazioni cellulari complesse.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi.

Ringraziamenti

Ringraziamo Liv Eidsmo e Keira Melican per aver fornito accesso alle biopsie di tessuti umani, e Lena Appelsved per l'assistenza nella lavorazione dei campioni. Questo studio è stato finanziato da sovvenzioni a KLS dal Consiglio Svedese per la Ricerca (2022-01236), dal Programma Strategico di Ricerca sul Diabete presso il Karolinska Institutet (C5471162), dalla Novo Nordisk Foundation (C5475033), dal Vallee Foundation Scholar Award (C5471234), dalla Mark Foundation Aspire Grant (C5477023), dalla Società Svedese per il Cancro (22 2420), dal Programma Strategico di Ricerca sulle Cellule Staminali e la Rigenerazione presso il Karolinska Institutet (C5472022) e dalla Knut and Alice Wallenberg Foundation (2020.0118; 2023.0536).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1.5 mL tubesBioSphere72.706.200Biosphere safeseal tube 1.5 mL, 250 PC
5 mL tubesEppendorf30119401Eppendorf tubes 5.0 mL microtube
96-well plateCorning4680Corning 96-well high content ccreening microplates with film bottom
CD31 primary antibodyAbcamAb9498Anti-CD31 antibody clone JC/70A
Confocal microscope with reflected light capabilitiesEvidentFV-4000
CoverslipsEprediaBB02400500A113MNZOCoverslips 24 mm x 50 mm, #1.5 thickness (0.13-0.16 mm) 
DPBSGibco14190-136DPBS, no calcium, no magnesium
Fixation bufferSigma Aldrich1.00496.5000Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 
HClSigma-Aldrich320331-500mLHydrochloric acid (37%)
IncubatorStuartS130HHybridization oven/shaker
Microscopy slidesAvantor VWR631-1560Single-frosted slides, coloured ends
Mounting mediaInvitrogenP36984ProLong glass antifade mountant excitation/emission max 361/497 nm
Mouse IgG1 isotype controlR&D SystemsMAB002
NaOHSigma-AldrichS8045-500GSodium hydroxide ≥ 98%
Normal donkey serumJackson ImmunoResearch Labs017-000-121
pH meterMeterLabR21M002 PHM210 standard pH meter 
Pipette tips (1000 µL)Biosphere70.1186.2101250µL filtered pipette tips
Pipette tips (200 µL)Corning4823200µL filtered pipette tips
SABG KitCell signaling9860SSenescence beta-galactosidase staining kit
Secondary antibody, Alexa Fluor 555InvitrogenA31570Donkey anti-mouse IgG (H+L) highly cross-adsorbed excitation/emission max
553/568 nm
Tween-20Fisher Scientific10419000Pure, Fisher chemical
Water bathRowe ScientificSWB20DStandard water bath
WGAInvitrogenW11261Wheat Germ Agglutinin (WGA) Alexa Fluor 488 conjugate: Excitation/emission max 495/519 nm

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