Assemblaggio e utilizzo di un sistema di crescita gnotobiotica vegetale per studi di interazione pianta-microrganismo nei cereali

Sommario

Questo protocollo descrive l'assemblaggio e l'uso di un nuovo sistema di crescita gnotobiotica vegetale progettato per accogliere cereali e validato nel grano e nel mais. Questo sistema gnotobiotico vegetale consente esperimenti controllati pianta-microrganismo fornendo condizioni di crescita sterili, gestione dell'irrigazione e compatibilità con substrati diversi a base di suolo.

Abstract

Lo sviluppo di modifiche agricole a base microbica che funzionino costantemente sul campo richiede una comprensione dei meccanismi molecolari delle interazioni pianta-microrganismo. Studiare questi meccanismi di interazione sottostanti richiede la capacità di far crescere piante in condizioni ambientalmente controllate e gnotobiotiche (cioè, tutti i microrganismi che interagiscono con la pianta sono noti, che siano liberi di germi, comunità microbiche definite o comunità naturali). I sistemi gnotobiotici vegetali attualmente disponibili non sono adatti allo studio di grandi piante di rilevanza agricola, come i cereali. Inoltre, la maggior parte di questi sistemi non è in grado di gestire l'irrigazione. Qui presentiamo GNOVA, un nuovo sistema gnotobiotico progettato per accogliere piante cerealicole con la capacità di gestire l'irrigazione. Questo nuovo sistema è una piattaforma accessibile composta da una base stampata in 3D e materiali disponibili in commercio. Questo protocollo fornisce una guida passo dopo passo per assemblare il sistema e l'installazione dell'esperimento. Inoltre, presentiamo un confronto delle prestazioni di GNOVA con un sistema di sacche gnotobiotiche. GNOVA ha esteso la crescita delle piante da due settimane nel sistema a sacchi fino a 17 settimane per il grano e 4 settimane per il mais. Il tasso di germinazione di entrambe le colture è aumentato anche all'interno della GNOVA, passando dal 66% al 100% per il grano e dal 75% al 100% per il mais. Il grano coltivato all'interno di GNOVA ha sviluppato motosiluri, che erano assenti nelle piante della stessa età all'interno del sistema a sacche. Il peso fresco del mais coltivato nella GNOVA era superiore del 594% rispetto al sistema di sacchi. Inoltre, l'altezza dei germogli e la lunghezza delle radici del mais erano rispettivamente superiori all'interno del sistema GNOVA rispetto ai sacchetti, rispettivamente. Il sistema GNOVA amplia la cassetta degli attrezzi a disposizione degli scienziati per l'esplorazione delle interazioni pianta-microbiota oltre la fase di piantina nei cereali, fornendo maggiore spazio di crescita e gestione dell'irrigazione.

Introduzione

I trattamenti agricoli a base di microrganismi hanno suscitato grande interesse negli ultimi decenni grazie al loro potenziale di migliorare la produttività delle colture migliorando la crescita delle piante e la resilienza allo stress ambientale. Allo stesso tempo, i meccanismi molecolari d'azione di questi biostimolanti restano poco compresi, il che può contribuire ai loro risultati incoerenti tra suoli, località e condizioni^{ambientali 1,2}. Promuovere una migliore efficacia dei trattamenti esistenti a base di microbi e lo sviluppo di nuove tecnologie richiede una comprensione più profonda dei meccanismi molecolari dell'interazione pianta-microrganismo ^3,4. Tuttavia, l'analisi di questi meccanismi rimane difficile a causa della complessità delle comunità microbiche^{naturali 5,6}. Per identificare gli effettori microbici e le interazioni che guidano i benefici delle piante, possiamo ridurre la complessità dei sistemi naturali impiegando comunità microbiche sintetiche (SynCom) all'interno di sistemi di crescita che permettono il controllo delle condizioni ambientali e della comunità microbica. La gnotobiologia, lo studio degli ospiti associati a comunità microbiche^{definite 7}, permette ai ricercatori di confrontare ospiti privi di germi con quelli colonizzati con comunità microbiche note per collegare la funzione microbica al fenotipo^{vegetale 8}.

I primi sistemi gnotobiotici furono costruiti utilizzando provette di vetro^{9, 10, 11, 12} e barattoli¹³. Da allora, abbiamo assistito a una rapida espansione di nuovi sistemi sviluppati per studiare le piante in modo gnotobiotico. I sistemi più comuni impiegati oggi includono l'uso delle piastre di Petri¹⁴, provette ^{15, 16}, barattoli di vetro¹⁷, scatole magenta¹⁸, sacchetti^{sigillati 19}, idroponica²⁰, FlowPot e GnotoPot²¹, sistemi microfluidici²² ed EcoFABs²³. Nonostante questi progressi, la maggior parte dei sistemi è ottimizzata per l'imaging²² o per la raccolta di^{essudati 17,20} o progettata per specie modello^{di piccole dimensioni} 14,18,21. Molti sono sistemi chiusi che limitano il controllo dell'irrigazione e la durata degli esperimenti. Questi vincoli rappresentano sfide per studiare colture agricole più grandi, come i cereali, che richiedono spazio, flusso d'aria e gestione dell'acqua aggiuntivi.

Riconoscendo la necessità di un sistema in grado di accogliere piante più grandi e studi più lunghi, l'EcoFAB 3.0 è stato recentemente sviluppato per espandere la coltivazione gnotobiotica a piante più^{grandi 24}. L'EcoFAB 3.0 offre un maggiore volume radicale e di spazio di testa, che supporta la crescita del sorgo bicolor fino a 4 settimane e consente la raccolta di essudati e l'imaging^{radicolare 24}. Anche se questo nuovo sistema è un esempio promettente di estensione dei sistemi gnotobiotici alle colture agricole, rimane la necessità di una piattaforma accessibile e versatile che possa essere facilmente adottata in laboratori e compatibile con una vasta gamma di flussi di lavoro sperimentali. Per questo motivo, abbiamo sviluppato GNOVA (GNotobiotic system for Versatile plant Applications), un sistema progettato per accogliere colture cerealicole in condizioni gnotobiotiche. Qui forniamo un protocollo dettagliato per assemblare e far funzionare GNOVA e ne dimostriamo le prestazioni rispetto a un sistema di sacche gnotobiotiche usata regolarmente nel nostro laboratorio. Con lo sviluppo di questo nuovo sistema, abbiamo migliorato la capacità di coltivare grano e mais in condizioni sterili offrendo uno spazio di crescita più ampio e un'irrigazione integrata rispetto ai sistemi chiusi precedenti. Le prestazioni della GNOVA sono paragonabili a quelle dell'EcoFAB 3.0, ampliando così il repertorio di strumenti per la dissezione delle interazioni pianta-microbioma in colture cerealicole non modello. Inoltre, la versatilità e l'adattabilità della gnotobiotica vegetale sono potenziate dal design semplice di GNOVA, dall'uso di materiali commerciali e dai file oggetti 3D disponibili, che permettono ai ricercatori di modificare materiali e design per adattare le loro esigenze di ricerca e budget.

Protocollo

NOTA: I file di stampa 3D per la base si trovano nei materiali supplementari e sono disponibili pubblicamente in Dryad (https://doi.org/10.5061/dryad.f7m0cfzbc). Per velocità ed efficienza dei costi, consigliamo di stampare in grandi quantità presso fornitori locali di servizi di stampa 3D commerciale.

1. Assemblaggio del sistema gnotobiotico

1. Avviare l'assemblaggio dei potenziometri (eseguire una volta prima di un uso sperimentale ripetuto).
   1. Chiudi il fondo della pentola posizionando il cerchio a rete metallica su un'estremità del tubo di policarbonato e fissando il cerchio usando la fascetta per tubo (Figura 1A).
   2. Forare le aperture per l'irrigazione creando un'apertura per l'irrigazione da 1/4 di pollice (6,35 mm) distante 1,5 cm dal bordo superiore dell'estremità aperta del tubo in policarbonato. Forare due fessure da 1/8 di pollice (3,18 mm) a 3 cm dalla prima apertura, con una fessura a 1 cm dal bordo e l'altra a 2 cm dalla fessura superiore.
      NOTA: Se necessario, ulteriori linee di tubaggio possono essere aggiunte attorno al bordo superiore del vaso seguendo gli stessi passaggi.
   3. Installa il tubo di irrigazione inserendo un breve tratto di tubo di silicio attraverso l'apertura da 1/4 di pollice.
   4. Fissa il tubo infilando la fascetta attraverso le due fessure da 1/8 di pollice (Figura 1B). Inserire il luer maschio del raccordo 1 nel tubo di silicone che si estende all'esterno del potenziometro (Figura 1C).
      NOTA: La spina del tubo del raccordo 1 dovrebbe essere esposta.
   5. Preparare le botti delle siringhe riempiendo una canna vuota con lana di vetro e chiudendo l'estremità con un piccolo pezzo di carta stagnola (Figura 1C).
   6. Fissa un breve pezzo di tubo di silicone all'estremità del blocco luer della canna della siringa (Figura 1C).
   7. Prepara due barili identici per siringhe. Fissare una delle botti di siringhe preparate alla spina del tubo esposta del tubo 1 sul tubo che si estende fuori dal vaso (Figura 1D).
   8. Pausa: I vasi assemblati possono essere conservati per un uso sperimentale successivo.

Figura 1: Assemblaggio del vaso. A) Fondo del vaso chiuso con rete metallica e fascetta per tubi. (B) Porta di irrigazione sul bordo superiore del vaso. (C) La linea di irrigazione termina con la punta del tubo esposta del Fitting 1 con canna di siringa preparata. (D) Vaso assemblato con linea di irrigazione chiusa Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Preparazione del vaso per l'esperimento (eseguire prima di ogni nuovo esperimento)
   1. Fodere il fondo del vaso con due cerchi pre-tagliati per tubi in fibra di vetro (Figura 2A).
   2. Prepara il substrato del terreno mescolando due parti di argilla con una parte di sabbia. Aggiungi 840 mL di substrato al vaso.
   3. Copri le pentole con un tappo di plastica e fissa con del nastro adesivo (Figura 2B).
   4. Vasi pieni in autoclave in ciclo asciutto a 121 °C per 30 minuti. Lascia raffreddare tutta la notte con tappi di plastica sui vasi. Ri-autoclave in ciclo secco a 121 °C per 30 minuti. Lascia raffreddare completamente. Tieni i vasi coperti con il tappo di plastica.
      NOTA: Possono essere utilizzati altri substrati di terreno, ma la quantità necessaria per vaso dovrebbe essere ottimizzata in anticipo. GNOVA è stato inoltre testato con 800 mL di argilla al 100% e 1 L di sabbia al 100%. Altri substrati del terreno potrebbero richiedere più cicli di autoclave o impostazioni diverse per una sterilizzazione completa.
      ATTENZIONE: Bisogna fare attenzione quando si rimuovono i vasi dall'autoclave, poiché il materiale sarà caldo e le fascette potrebbero allentarsi. Assicurati che le fasce per tubo siano ben strette una volta raffreddate prima di sollevare le pentole.
   5. Inserisci potenziometri raffreddati nella base stampata in 3D. Metti il vaso pieno di terra all'interno della base stampata in 3D. Tieni il vaso per la base, non per i pilastri di apertura, perché sono la parte più fragile.
   6. Fai passare il tubo di irrigazione attraverso una delle aperture inferiori della base stampata in 3D (Figura 2C).
      NOTA: Non autoclave la base di supporto stampata in 3D, perché potrebbe sciogliere il pezzo. Gli esperimenti che richiedono temperature superiori a 60 °C potrebbero necessitare di un filamento alternativo resistente al calore (vedi Tabella dei materiali).
   7. Tieni le pentole a temperatura ambiente dopo l'autoclaving e non rimuovere il tappo di plastica né la siringa preparata fino al montaggio finale dell'esperimento.

Figura 2: Illustrazione del vaso preparato. (A) Fondo del vaso foderato con un involucro in fibra di vetro per pipi. (B) La parte superiore della pentola chiusa con un tappo di plastica. (C) Vaso vuoto inserito nel design finale della base stampato in 3D. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Preparazione del cilindro di vetro (eseguita prima di ogni nuovo esperimento)
   1. Copri un'estremità del cilindro di vetro con un filtro DW4 pre-tagliato e fissalo usando il nastro in vinile (Figura 3A).
   2. Gira il cilindro di vetro per farlo rivolto all'altra estremità aperta e fissa un anello di cotone all'interno del tubo a 14 cm dal bordo. Fissa l'anello di cotone usando nastro chirurgico (Figura 3B).
   3. Chiudi l'estremità inferiore del cilindro con una pellicola di sterilizzazione usando due elastici (Figura 3B).
   4. Autoclave i cilindri di vetro preparati in un ciclo di asciugatura a 121 °C per 30 minuti prima dell'uso. Una volta autoclavato, conserva i cilindri di vetro sterili a temperatura ambiente fino a quando non è necessario senza rimuovere la pellicola.

Figura 3: Assemblaggio cilindro di vetro. (A) Estremità superiore del cilindro di vetro chiusa con materiale filtrante DW4 e nastro in vinile. (B) Estremità inferiore del cilindro di vetro dotata di anello di cotone e chiusa con pellicola sterilizzante e elastici. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Preparazione del filtro di irrigazione (eseguita prima di ogni evento di irrigazione, ad eccezione dei passaggi 1.4.4–1.4.6, che dovrebbero essere eseguiti solo una volta)
   1. Assemblare il portafiltro posizionando la membrana del filtro PES (Figura 4A.4) tra il portafiltro (Figura 4A.5) e il disco del filtro (Figura 4A.3).
   2. Orientare il lato liscio della membrana del filtro verso la direzione di uscita, assicurandosi che sia rivolto verso la parte superiore del portafiltro (Figura 4A.1).
   3. Inserisci l'anello O (Figura 4A.2) nella parte superiore del portafiltro (Figura 4A.1). Attacca la parte superiore del filtro al portafiltro. Stringi solo a mano.
   4. Collega i connettori. Inserisci il patino maschio del raccordo 2 nella porta superiore del portafiltro.
   5. Attacca un pezzo corto di tubo di silicone all'estremità del tubo del filtro (Figura 4B). Inserire il lurante maschio di un raccordo 1 all'estremità dell'altra canna della siringa preparata dal passo 1.1.6 (Figura 4B).
   6. Collega il filtro al raccordo del tubo sulla canna della siringa preparata.
   7. Autoclave i filtri assemblati in ciclo di asciugatura a 121 °C per 30 minuti. Stringi i filtri una volta raffreddati e prima dell'uso.
      NOTA: Si raccomanda di preparare tutti i filtri necessari e autoclavarli in una scatola chiusa di polipropilene. Una volta autoclavate, i filtri di irrigazione possono essere mantenuti sterili a temperatura ambiente fino all'uso, purché la siringa preparata non venga rimossa.

Figura 4: Assemblaggio del supporto filtro. (A) Parte del portafiltro smontato: 1. Parte superiore del portafiltro, 2. O-ring, 3. Disco del filtro, 4. Membrana del filtro e 5. Portafiltri. (B) Portafiltro assemblato con una relativa canna di siringa preparata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Impostazione dell'esperimento

1. Prepara e sterilizza soluzioni e materiali almeno un giorno prima di allestire l'esperimento.
   1. Prepara un mezzo di crescita vegetale Murashige e Skoog 0,5X seguendo le istruzioni del produttore. Mezzo autoclave in ciclo liquido a 121 °C per 30 minuti.
   2. Autoclave il distributore smontato con il tappo della bottiglia in ciclo secco a 121 °C per 30 minuti. Autoclave 1 L di acqua deionizzata in ciclo liquido a 121 °C per 30 minuti.
   3. Piastra di vetro autoclave, becher da 500 mL, filtri per tè e pinzette a secco a 121 °C per 30 minuti al giorno di anticipo.
      NOTA: Salvo diversa indicazione, i seguenti passaggi devono essere eseguiti in una cappa a flusso laminare utilizzando la tecnica asettica.
2. Sterilizza i semi in superficie.
   NOTA: Il protocollo di sterilizzazione superficiale dei semi dipenderà dalla specie vegetale da utilizzare. Il sistema gnotobiotico è stato testato sia con grano che con mais utilizzando i seguenti protocolli di sterilizzazione dei semi.
   ATTENZIONE: Indossa camice da laboratorio, guanti e occhiali protettivi quando maneggi candeggina e ipoclorito di sodio, poiché queste sostanze possono essere irritanti o corrosive per pelle e occhi. L'etanolo è infiammabile; Non usare la fiamma vicino alla fiamma aperta.
   1. Sterilizzazione dei semi di^{grano 25}
      1. Riempire due becher con 150 mL di etanolo al 95% v/v, un becher con 150 mL di candeggina domestica non diluita e due becher con 150 mL d'acqua.
      2. Metti i semi di grano nel colino del tè. Agita delicatamente il colino del tè con i semi in uno dei becher con etanolo al 95% V/V per un minuto.
      3. Trasferisci i semi in un nuovo colino per tè. Agita delicatamente i colini con i semi nella candeggina per 10 minuti.
      4. Trasferisci i semi in un nuovo colino per tè. Agita delicatamente i filtri del tè con i semi nell'altro becher con etanolo al 95% v/v.
      5. Agita delicatamente i filtri del tè con i semi in acqua sterile deionizzata per 30 secondi. Agita delicatamente i filtri del tè con i semi nell'altro becher con acqua sterile deionizzata per 2 minuti. Metti i semi sterili in una piastra di Petri sterile vuota.
   2. Sterilizzazione dei semi di mais²⁶
      1. Metti i semi di mais in un tubo conico da 50 mL. Riempi il tubo conico con etanolo al 70% v/v. Inverti delicatamente il tubo conico per 3 minuti.
      2. Fai un decano al 70% di etanolo e riempi il tubo conico con semi con ipoclorito di sodio al 2% v/v. Inverti delicatamente il tubo conico per 3 minuti.
      3. Scartare ipoclorito di sodio al 2% e sciacquare i semi con acqua sterile deionizzata. Svuota l'acqua e risciacqua i semi con l'acqua quattro volte. Metti i semi di mais in una piastra di Petri sterile.
3. Aggiungi l'inoculo microbico al mezzo quando applicabile.
   NOTA: Non è stato applicato alcun inoculo microbico durante l'ottimizzazione e i test di sterilità del sistema gnotobiotico.
4. Assembla i distributori con tappo delle bottiglie e attaccali alle bottiglie di supporto.
   NOTA: Poiché si tratta di un sistema aperto, consigliamo di avere un contenitore per raccogliere il mezzo di passaggio. Abbiamo scoperto che usare una teglia da forno funziona bene e permette un movimento facile, ma richiede svuotamenti frequenti.
5. Rimuovi il tappo di plastica dalla pentola e smalti 378 mL di medium nella pentola.
   NOTA: Questo corrisponde a circa il 70% dello spazio poroso riempito d'acqua (WFPS), che dovrebbe essere regolato quando si utilizzano altri substrati del suolo. Usa 360 mL per l'argilla e 358 mL per la sabbia.
   1. Semina il seme sterilizzato alla profondità appropriata usando una pinzetta sterile.
   2. Semina grano a una profondità di mezzo pollice e mais a una profondità di 1 pollice. In alternativa, semina piantine pre-germinate sterili nella GNOVA. Usa semi pre-germinati per i test di crescita del mais.
   3. Rimetti il tappo di plastica sopra la pentola.

3. Assemblaggio finale e funzionamento sperimentale

1. Trasferisci il vaso e il cilindro di vetro in una camera di crescita. Tieni il cilindro di vetro con il fondo rivolto verso il basso vicino alla pentola.
2. Rimuovi rapidamente il tappo di plastica dalla pentola e la pellicola di sterilizzazione dal cilindro di vetro. Abbassa il cilindro di vetro sulla parte superiore, posizionandolo sul bordo della base stampata in 3D.
   NOTA: Una fiamma (ad esempio, un bruciatore portatile Bunsen) può essere posta accanto alla pentola durante l'assemblaggio finale del sistema di crescita per ridurre ulteriormente il rischio di contaminazione.
   ATTENZIONE: Assicurati che, lavorando con fiamme libere, non ci siano altri materiali infiammabili nelle vicinanze. Fai attenzione alla posizione della fiamma rispetto al corpo per evitare ustioni.
3. Coltiva le piante tra le 4 e le 17 settimane, a seconda della specie vegetale, utilizzando condizioni di crescita specifiche per specie.
4. Coltivare grano a temperature giorno/notte di 22 °C/16 °C e mais a 27 °C/23 °C. Il fotoperiodo per entrambe le piante è di 12 ore solo sotto luci fluorescenti.

4. Irrigazione

1. Attacca un lungo tubo di silicone al dispenser con il tappo.
2. Mantieni la sterilità durante l'annaffiatura usando una fiamma portatile. Se una fiamma portatile non è un'opzione, esegui l'irrigazione con candeggina per mantenere la sterilità.
3. Irrigazione con una fiamma portatile.
   ATTENZIONE: Lavora con attenzione intorno alle fiamme libere per prevenire lesioni fisiche e danni alle strutture.
   1. Metti la fiamma vicino alla linea di irrigazione. Rimuovi la canna della siringa dalla linea di irrigazione e dal portafiltro. Tieni tutte le estremità dei tubi all'interno della zona di fiamma.
   2. Attacca il portafiltro alla linea di irrigazione. Collega le due canne delle siringhe tra loro. Collega l'altro lungo pezzo di tubo in silicone sul dispenser con la parte superiore della bottiglia alla porta inferiore del portafiltro.
   3. Erogare 150 mL di mezzo Murashige e Skoog 0,5X. Separati le due canne delle siringhe.
   4. Stacca il tubo di silicone dal portafiltro e sostituiscilo con un solo barile per siringa.
4. Irrigazione con candeggina al 10%
   NOTA: Raccomandiamo di utilizzare questa strategia di irrigazione in grandi esperimenti (n > 50) per aumentare la produzione durante l'irrigazione.
   ATTENZIONE: Indossa camice da laboratorio, guanti e occhiali protettivi quando maneggi la candeggina.
   1. Distribuisci una soluzione di candeggina al 10% in V/V in due piccoli becher di plastica e posizionali vicino alla linea di irrigazione. Rimuovi la canna della siringa dalla linea di irrigazione e dal portafiltro.
   2. Immergi tutte le estremità dei tubi nella soluzione di candeggina al 10% fino a quando non è necessario. Scuoti via la soluzione di candeggina in eccesso. Attacca il portafiltro alla linea di irrigazione del vaso.
   3. Collega l'altro lungo tubo di silicone del dispenser con il tappo alla porta inferiore del portafiltro.
   4. Erogare 150 mL di mezzo Murashige e Skoog 0,5X. Stacca il tubo di silicio dal portafiltro.
      NOTA: Il volume di irrigazione è di 120 mL per la sabbia e 360 mL per l'argilla.
   5. Sostituisci il filtro nella linea di irrigazione con una candegga per siringa dopo aver scosso via l'eccesso di candeggina.
      NOTA: Se il volume di irrigazione cambia, si prevede circa 20 mL di substrato per preparare la linea di irrigazione.
5. Irriga i vasi una volta a settimana. Regolare il volume e la frequenza dell'irrigazione in base all'obiettivo dell'esperimento e al substrato del terreno utilizzato. Se si utilizza sabbia al 100%, aumentare la frequenza dell'irrigazione a due volte a settimana.

5. Raccolto

NOTA: Questo protocollo di raccolta è stato seguito durante i test e l'ottimizzazione del sistema gnotobiotico. Il protocollo di raccolta dovrebbe essere modificato per adattarsi a obiettivi di ricerca specifici e al volume di campioni in lavorazione.

1. Prepara e sterilizza tutte le soluzioni e i materiali almeno un giorno prima del raccolto.
   1. Autoclave 4 L di acqua deionizzata e 500 mL di 0,145 M NaCl, in un ciclo liquido a 121 °C per 30 minuti al giorno in anticipo.
   2. Forbici e pinzette autoclave in ciclo asciutto a 121 °C per 30 minuti al giorno in anticipo.
      NOTA: Salvo diversa indicazione, i seguenti passaggi devono essere eseguiti in una cappa a flusso laminare utilizzando la tecnica asettica. Se la sterilità non è necessaria per la raccolta del campione, tutti questi passaggi possono essere eseguiti al di fuori di una cappa a flusso laminare.
2. Trasferire i sistemi gnotobiotici dalla camera di crescita al laboratorio e posizionarli vicino alla cappa a flusso laminare.
3. Rimuovi il cilindro di vetro dal vaso e posizionalo rapidamente nella cappa a flusso laminare. Togli il potenziometro dalla base stampata in 3D.
4. Tieni la pianta alla base e versa il substrato in un contenitore. Scuoti delicatamente grandi grumi di substrato dalle radici.
   NOTA: I campioni di substrato del terreno possono essere raccolti e processati secondo l'obiettivo specifico della ricerca in questa fase del raccolto. Il protocollo brevemente descritto qui veniva utilizzato per testare la sterilità dei suoli.
5. Raccolta del suolo per il conteggio batterico^{del suolo 27} usando diluizione seriale a piastra singola,^{spotting 28}.
   1. Riempire i pozzi di una piastra da 96 pozzi con 270 μL di 0,145 M NaCl. Lascia la prima fila vuota. Aggiungi 1 g di substrato del terreno a un tubo conico da 15 mL con 9 mL di 0,145 M NaCl.
   2. Vortice alla velocità massima per 5 minuti. Trasferire 30 μL del campione in un pozzo vuoto della piastra a 96 pozzi.
   3. Preparare sette diluizioni seriali di ciascun campione pipettando 30 μL di ciascun campione nel pozzo sottostante contenente 270 μL di soluzione di NaCl.
   4. Mescola bene pipettando su e giù tra un trasferimento e l'altro.
   5. Preparare la spotting di diluizione seriale a singola piastra di ciascun campione impiacciando 10 μL di ogni diluizione seriale su una singola piastra R2A.
   6. Inclina le piastre per distribuire le gocce. Incubare le piastre a temperatura ambiente.
   7. Contare le unità formative di colonie (CFU) e calcolare CFU/g del suolo.
6. Separare i germogli dalle radici usando forbici sterili. Registra il peso di scatto fresco.
7. Pulisci le radici scuotendole delicatamente in un becher con acqua deionizzata. Asciuga le radici con un asciugamento e registra il peso fresco.
   NOTA: Il materiale sopra e sottosuolo può essere raccolto in questo punto e processato secondo la metodologia più appropriata all'analisi a valle di interesse.

Risultati

Abbiamo sviluppato GNOVA, un nuovo sistema gnotobiotico per piante, che consente l'ambiente sterile e controllato necessario per esaminare le interazioni pianta-microrganismo. Questo nuovo sistema offre 24,4 pollici (62 cm) di spazio verticale per i germogli e un vaso da 1,3 L compatibile con diversi substrati di suolo. Il sistema completamente assemblato è alto circa 3 piedi (92,4 cm) e largo 4,57 pollici (11,6 cm) (Figura 5A–C). Rispetto ad altri sistemi, ha la maggiore capacità verticale per la crescita dei germogli e la seconda camera radicale più grande (Tabella Supplementare 1). GNOVA richiede solo 0,0135^m2 di superficie nella camera di crescita, rendendo così questo sistema compatto e manovrabile. Questo sistema può essere utilizzato in camere di crescita a portata di mano con un spazio verticale di 1,22 m. Tutti i componenti di questo sistema, ad eccezione della base stampata in 3D, sono autoclavabili e compatibili con autoclavi con dimensioni di 24 pollici × 24 pollici × 36 pollici (larghezza × lunghezza × altezza; 61 cm × 61 cm × 91 cm). Questo semplifica l'impianto sperimentale evitando la sterilizzazione manuale delle singole parti. Inoltre, la maggior parte dei componenti di questo sistema è riutilizzabile, il che mantiene il costo d'uso per esperimento a circa 6 USD dopo il costo iniziale di installazione di 54 USD per unità (Tabella Supplementare 2). Le condizioni ambientali all'interno di GNOVA sono state determinate monitorando la temperatura e l'umidità relativa del sistema con una pianta di mais vecchia di una settimana per tre giorni. La temperatura all'interno della GNOVA era, in media, di +1,3 °C superiore rispetto alla camera di crescita (Figura Supplementare 1). Le differenze di temperatura all'interno del sistema e della camera erano maggiori durante il ciclo di luce (media +2,5 °C) rispetto al ciclo oscuro (media +0,4 °C). L'umidità relativa all'interno di GNOVA era in media del 63%, a contrasto con il 34% nella camera di crescita.

Figura 5: Rendering del sistema GNOVA. (A) Modello 3D del design finale della base di supporto (B) Sezione trasversale del modello 3D della base di supporto (C) Sezione trasversale del modello 3D di GNOVA completamente assemblato Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per garantire la sterilità all'interno del sistema, abbiamo condotto una prova di quattro settimane sia di sistemi non irrigati che senza impianti di irrigazione. La contaminazione sul cilindro di vetro è stata determinata campionando sopra e sotto l'anello di cotone tramite placcatura diretta con tampone. Non è stata osservata alcuna crescita microbica rilevabile sopra tre colonie (cioè una singola colonia per terzo della superficie campionata) sopra l'anello del cotone sia per campioni non irrigati (n=4) sia per quelli irrigati (n=6) (Figura Supplementare 2A). Sotto l'anello del cotone, è stata osservata una crescita in una replica non irrigata, mentre nessuna crescita è stata rilevata nei sistemi irrigati (Figura Supplementare 2B). Ciò suggerisce un basso potenziale di contaminazione dal cilindro di vetro, poiché la crescita microbica era presente solo in repliche limitate sotto l'anello del cotone, che non è a contatto con la pianta. La contaminazione del suolo è stata valutata individuando diluizioni seriali sulle lastre R2A (Figura Supplementare 2C). Non è stata rilevata alcuna crescita microbica sostanziale in nessuna delle due condizioni, a parte una singola replica irrigata con un conteggio di unità formative di colonie non scorificabile da diluizioni seriali (cioè < 30 colonie). Oltre ai test di sterilità, abbiamo effettuato un confronto delle prestazioni tra grano e mais coltivati all'interno di GNOVA rispetto al nostro protocollo standard di crescita gnotobiotica di due settimane in un sistema^{di sacchi 19}. Per comprendere l'effetto delle dimensioni ridotte e della mancanza di irrigazione sulle prestazioni delle piante, abbiamo esteso i periodi di crescita nel sacco per corrispondere a quelli presenti in GNOVA. Anche se il contenuto iniziale di acqua del terreno utilizzato durante la configurazione di entrambi i sistemi era stato corrispondente, GNOVA ricevette fertigazione settimanale, mentre i sacchi no. Per tutti i confronti, usiamo il sistema delle sacche come riferimento, dato che era la configurazione iniziale gnotobiotica del nostro laboratorio. Sia il grano che il mais hanno raggiunto la germinazione del 100% all'interno della GNOVA, mentre nel sistema a sacchi il grano ha raggiunto solo il 67% (n = 3) e il mais il 75% (n = 8) (Figura 6).

Figura 6: Germinazione del grano (n = 3) e del mais (n = 8) all'interno del sistema GNOVA (viola) e del sistema a sacchi (verde). L'esito germinativo di ogni replica è rappresentato da punti sull'asse y, sia come Nessuna germinazione sia come Germinato per ciascun sistema gnotobiotico. Le barre rappresentano il tasso di germinazione (%) di ogni specie vegetale all'interno di diversi sistemi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

È stato inoltre eseguito un test di crescita per grano e mais per determinare il periodo massimo di crescita vitale e le prestazioni delle piante all'interno della GNOVA. Anche se il nostro protocollo standard richiede solo due settimane di crescita, abbiamo esteso il periodo di crescita all'interno delle borse oltre due settimane per un confronto migliore tra i due sistemi. Dopo due settimane, il grano coltivato all'interno di GNOVA (n=3) aveva già raggiunto lo stadio di crescita di Zadock (GS) 13 (Figura 7A), mentre nel sacchetto rimaneva a GS11. Alla quinta settimana, le piante avevano raggiunto GS21 nei sistemi GNOVA, come indicato dalla comparsa dei motomotocoltivatori (Figura 7B). Al contrario, i motomotocoltivatori erano assenti nei sistemi di sacco e gli impianti rimasero in GS13. Questo rallentamento della crescita e la mancanza di cambiamenti fenologici all'interno del sistema delle sacche portarono alla cessazione delle piante in questo sistema alla sesta settimana. Le piante di grano continuarono a crescere per altre cinque settimane all'interno di GNOVA, dove fu osservato un aumento del numero di foglie e della biomassa (Figura 7C). Anche se la biomassa di grano è aumentata visivamente dopo 12 settimane di crescita all'interno della GNOVA, le piante hanno anche iniziato a mostrare foglie più clorotiche e il volume del cilindro di vetro è stato riempito dalla biomassa vegetale (Figura 7D). Il grano è stato coltivato per altre due settimane successive (Figura 7E,F). Tuttavia, non c'è stato alcun aumento visivo della biomassa, quindi il test di crescita è stato interrotto a 17 settimane di crescita. La crescita del mais è stata inoltre valutata all'interno di GNOVA per quattro settimane e confrontata con il mais coltivato in sacchi (Figura 8A,B). In questo esperimento, i semi di mais sono stati sterilizzati e pre-germinati prima di essere seminati all'interno del sistema GNOVA o del sacco. Il peso del germoglio fresco e delle radici del mais era significativamente diverso tra i due sistemi (test t a due campioni, valore p < 0,05, Tabella supplementare 3). Il mais coltivato in GNOVA presentava germogli e radici freschi che pesavano in media rispettivamente 11,2 g e 5,7 g (Figura 8C,D). Al contrario, i germogli e le radici del mais coltivati all'interno del sacco avevano pesi freschi rispettivamente di 1,29 g e 1,15 g. Nel complesso, la biomassa fresca di mais coltivata all'interno del GNOVA è aumentata del 593% rispetto al mais coltivato nel sistema di sacchi. Inoltre, la lunghezza del germoglio e della radice era significativamente maggiore all'interno di GNOVA rispetto alle sacche rispetto alle sacche rispettivamente dell'89% e del 57% (Figura 8E,F).

Figura 7: Crescita del grano all'interno del prototipo GNOVA. (A) Grano a due settimane nello stadio di crescita di Zadock (GS) 13. (B) Confronto tra grano dopo cinque settimane di crescita in un sacco e GNOVA. I motomotocicli sono presenti all'interno di GNOVA (GS21) e assenti nel sacco (GS13). (C) Aumento della biomassa di grano a 10 settimane di crescita. (D) Aumento della biomassa di grano a 13 settimane di crescita con la comparsa di foglie clorotiche. (E) Ulteriore aumento della biomassa di grano a 15 settimane di crescita. F) La biomassa di grano occupa la maggior parte del volume di crescita disponibile a 17 settimane di crescita. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Crescita del mais all'interno del prototipo GNOVA (viola) rispetto al sistema a sacchi (verde). Le barre indicano valori medi ± errore standard (n=4) (A) Mais coltivato per quattro settimane nel sistema GNOVA e saccheggiatore. (B) Confronto delle dimensioni delle piante raccolte coltivate in GNOVA e sistema a sacchi. (C) Peso del germoglio fresco (Medio±SE). (D) Peso radicale fresco (Medio±SE). (E) Lunghezza del tiro (Media±SE). F) Lunghezza della radice (Media±SE). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1: Dinamiche temporali dell'umidità relativa e della temperatura misurate all'interno di GNOVA (viola) e nella camera di crescita (arancione). I dati venivano registrati a intervalli di cinque minuti per tre giorni. I dati all'interno di GNOVA sono stati registrati con una pianta di mais di sette settimane. Le aree ombreggiate di azzurro chiaro corrispondono a periodi notturni. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 2: Crescita microbica risultante dal test di sterilità della GNOVA senza che le piante non ricevano irrigazione (Control) e con irrigazione (Irrigata). (A) Campioni di cilindro di vetro sopra l'anello di cotone. (B) Campioni di cilindro di vetro sotto l'anello di cotone. (C) Placcatura seriale a lamina singola per diluizione dei campioni di suolo. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 1: Confronto delle caratteristiche di GNOVA con altri gnotobiotici vegetali esistenti (EcoFAB, scatole magenta, sacchi, FlowPot, GnotoPot ed EcoFAB 3.0). I sistemi vengono confrontati tra parametri chiave rilevanti per la progettazione sperimentale, come la capacità di altezza delle piante, la capacità del volume radicale e il controllo dell'irrigazione. Le informazioni venivano raccolte dalla letteratura pubblicata e dalle descrizioni dei sistemi disponibili; quando i dati non sono stati esplicitamente riportati, sono indicate le stime. † Migliore approssimazione quando non specificata nella letteratura; ‡ Il sistema non deve essere smontato o spostato su una cappa a flusso laminare per svolgere il compito; * Possibile con modifiche al sistema; Le categorie di costo sono definite come: basso (< USD 30 per unità), medio (30-100 USD per unità), alto (> USD 100 per unità) Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella Supplementare 2: Lista dei materiali (BOM) e costi stimati per l'assemblaggio e il funzionamento di un'unica unità GNOVA. I materiali sono classificati come componenti riutilizzabili o monouso, con corrispondente costo unitario, quantità richieste per sistema e costo totale per sistema. I componenti riutilizzabili contribuiscono al costo iniziale di installazione, mentre i materiali monouso rappresentano il costo consumabile per esperimento. * calcolato a partire da prezzi all'ingrosso negoziati per tariffe economicamente efficienti; ** la quantità necessaria varia in base alla durata dell'esperimento, al substrato utilizzato e all'obiettivo della ricerca. Vale la pena un esperimento di quattro settimane con un programma settimanale di irrigazione utilizzando la miscela di argilla e sabbia; † Costo approssimativo della quantità di materiale necessario per sistema; ‡ Non include il prezzo della soluzione nutritiva né del substrato del suolo, poiché questo varia a seconda dell'obiettivosperimentale. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 3: I valori p risultanti del test t a due campioni per la crescita del mais misuravano variabili coltivate all'interno di GNOVA e del sistema di sacchi. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Il sistema gnotobiotico vegetale presentato qui, GNOVA, fornisce uno strumento accessibile e versatile per studiare le interazioni pianta-microrganismo nelle colture cerealicole. Le sue caratteristiche principali includono una maggiore capacità di crescita e l'irrigazione integrata, che estende la crescita dei cereali oltre la fase di piantina in condizioni sterili. Le prestazioni di questo sistema sono paragonabili a quelle dell'EcoFAB 3.0 e offrono un sistema gnotobiottico alternativo vegetale accessibile. Il sistema è costruito con componenti commercialmente disponibili selezionati per costo, semplicità e compatibilità con autoclave di medie dimensioni, facilitando l'adozione in diversi laboratori. L'assemblaggio e l'uso sono semplici e non richiedono attrezzature specializzate, riducendo così le barriere all'implementazione. GNOVA può essere adattato per raggiungere diversi obiettivi di ricerca grazie alla sua compatibilità con un'ampia gamma di substrati del suolo, protocolli di sterilizzazione dei semi, inoculanti microbici (senza germi, SynCom o comunità naturale) e diverse analisi a valle.

Una contaminazione minima è essenziale negli esperimenti gnotobiotici delle piante per garantire che gli effetti osservati possano essere attribuiti a microbi di interesse e non a contaminanti. Il funzionamento semplice di GNOVA riduce il rischio di contaminazione. Una rigorosa aderenza alla tecnica asettica e le seguenti raccomandazioni chiave garantiranno il mantenimento della sterilità. Durante l'installazione dell'esperimento, raccomandiamo la disinfezione della cappa a flusso laminare tra gli inoculanti microbici per minimizzare la contaminazione incrociata dei trattamenti. L'ordine in cui vengono applicati i trattamenti può anche ridurre la contaminazione incrociata. L'applicazione di trattamenti privi di germi prima di qualsiasi trattamento con microbi vivi è l'ideale. Microbi estranei possono essere introdotti anche tramite semi. I protocolli di sterilizzazione superficiale dei semi dovrebbero quindi essere ottimizzati per ogni specie vegetale o fonte di semi, per bilanciare sterilità e^{germinazione 26}. I protocolli di sterilizzazione per cereali non modello, come^{sorgo 24},^{orzo 29}, herba switchgrass e^{avena 23} , possono essere facilmente implementati in GNOVA. Se la sterilizzazione influisce negativamente sulla germinazione, si possono utilizzare semi pre-germinati. L'irrigazione rappresenta una delle principali fonti di contaminazione nei sistemi gnotobiotici. Il punto più critico durante questo processo è l'attacco dei filtri alle linee di irrigazione. Le estremità dei tubi delle linee di irrigazione e dei filtri devono rimanere sterili durante questo processo. La sterilizzazione a fiamma richiede destrezza e può richiedere molta fatiga, soprattutto in grandi esperimenti (n >50). Pertanto, il metodo alternativo a base di candeggina è raccomandato per grandi esperimenti o quando la sterilizzazione a fiamma non è pratica. Si raccomanda anche di mantenere filtri sterili aggiuntivi e di avere candeggina o etanolo disponibili durante l'irrigazione in caso di contaminazione durante la gestione dei materiali del sistema. Inoltre, è fortemente raccomandata l'inclusione di unità di controllo della contaminazione (cioè nessuna pianta, nessun trattamento microbico e irrigazione ricevente) per monitorare la sterilità e identificare i contaminanti.

Per superare il rischio di contaminazione da irrigazione, i primi sistemi gnotobiotici delle piante erano completamente chiusi e privi di capacità di irrigazione, limitando la durata degli esperimenti. Il mais è stato coltivato gnotobioticamente in^{sacchi 19,30}, tubi di vetro e^{piastre di Petri 15} tra due e quattro settimane. Per rifornire acqua e nutrienti durante la crescita delle piante, sistemi alternativi come EcoFAB²³, FlowPot e^{GnotoPot 21} hanno permesso l'irrigazione tramite smontaggio parziale all'interno delle cappe a flusso laminare. Questo limitava la loro dimensione e la compatibilità con le piante più grandi. Poiché le linee di irrigazione sono facilmente accessibili al di fuori del GNOVA, non è necessario smontare e il sistema non è vincolato alle dimensioni delle cappe a flusso laminare. Questo non solo consente un apporto continuo di nutrienti e acqua, ma aumenta anche lo spazio di crescita disponibile. Lo spazio ridotto dei germogli può diminuire la capacità fotosintetica e contribuire allo stenting²⁴, mentre la restrizione del volume radicale può portare al lego radicale e ridurre l'assorbimento di acqua e^{nutrienti 31}. La combinazione di spazio di crescita ridotto e mancanza di irrigazione nel sistema a sacchi potrebbe spiegare la diminuzione della biomassa e la mancanza di progressione fenologica di mais e grano rispetto al sistema GNOVA. Questo nuovo sistema ha permesso la crescita gnotobiotica del mais per una durata paragonabile a quella del sorgo nell'EcoFAB 3.0²⁴. Inoltre, supera la crescita gnotobiotica del grano per quattro settimane in un sistema idroponico (20) in un sistema suolico più rappresentativo. Oltre ai vincoli fisici, i sistemi gnotobiotici spesso si basano su un flusso d'aria limitato per mantenere la sterilità. Un flusso d'aria limitato può portare a un aumento della temperatura e dell'umidità, oltre a tassi di scambio gassesi più bassi, che potrebbero influire sulla fisiologia^{delle piante 32}. È stata segnalata una crescita migliorata in sistemi con maggiore flusso d'aria, come le scatole magenta dotate di filtri^{HEPA 33} che funzionano in modo simile al filtro DW4 usato in GNOVA. Allo stesso modo, EcoFAB 3.0 ha mostrato aumento di temperatura e umidità relativa ma è stato comunque considerato una piattaforma robusta per la crescita gnotobiotica del^{sorgo 24}. Ciò suggerisce che, sebbene persistano vincoli fisici e ambientali all'interno dei sistemi gnotobiotici, i progressi nella progettazione dei sistemi presentati qui forniscono comunque condizioni migliorate che supportano in modo più efficace la crescita gnotobiotica dei cereali.

La facilità di modifica è un'altra caratteristica chiave di GNOVA. La modularità del suo design permette agli utenti di apportare modifiche a singole parti per adattarle meglio alle proprie esigenze di ricerca e al budget. Questo sistema è compatibile con qualsiasi substrato del suolo, compresi i terreni naturali. Le modifiche al volume di installazione, alla concentrazione della soluzione nutritiva e al volume e alla frequenza dell'irrigazione dovrebbero basarsi sulle proprietà fisico-chimiche del suolo, poiché influenzano direttamente la disponibilità e la distribuzione di nutrienti e acqua³⁴. La siccità può essere indotta monitorando il peso dell'intero sistema GNOVA e determinando gravimetricamente il contenuto idrico del^{suolo 35}. Gli essudati radicali possono essere raccolti in modo distruttivo incubando piante raccolte in acqua^{ultrapura 36} o risciaccando il sistema per ottenere lassati non^{sterili 37}. Se sono necessari essudati sterili, il potenciolo e la base di supporto stampati in 3D di GNOVA possono essere modificati per incorporare una funzione integrata di raccolta essudati simile a quella del design di EcoFAB 3.0²⁴. Gli scienziati interessati a comprendere gli effetti^{prioritari 38} sull'assemblaggio delle comunità microbiche possono installare ulteriori linee di irrigazione intorno al vaso. Ciò consente applicazioni successive di inoculanti microbici mantenendo la sterilità della linea principale di irrigazione. Le condizioni ambientali potrebbero essere monitorate installando sensori wireless disinfettati di temperatura e umidità relativa all'interno di GNOVA. In alternativa, sostituire il cilindro di vetro con una camera in policarbonato e perforare le porte^{di campionamento 24} permetterebbe di misurare l'ambiente e di campionare i gas. Ciò potrebbe permettere la quantificazione di gas e composti volatili, come_CO2,_O2 ed etilene, con il potenziale di influenzare le prestazioni dell'impianto³³. Il flusso d'aria verso il sistema può anche essere aumentato rimuovendo l'anello di cotone nel cilindro di vetro. Tuttavia, una qualsiasi di queste modifiche potrebbe aumentare il rischio di contaminazione e non è ancora stata validata o ottimizzata all'interno di GNOVA.

Nonostante i vantaggi e la versatilità di GNOVA, alcune limitazioni dovrebbero essere considerate. Va notato che questo sistema è più adatto all'uso in camere di crescita controllata, poiché condizioni non controllate in serra o in campo potrebbero influire sulle sue prestazioni. Sebbene il grano sia riuscito a crescere all'interno del sistema per 17 settimane, sono stati osservati segni di stress intorno alle 12 settimane di crescita. Pertanto, il grano non dovrebbe essere coltivato oltre le 12 settimane. Inoltre, il mantenimento della sterilità è stato confermato solo attraverso quattro eventi di irrigazione settimanali in un periodo di crescita di quattro settimane; Esperimenti più lunghi comportano un rischio aumentato di contaminazione. Anche se la GNOVA ha aumentato la capacità di volume radicale, la restrizione radicale è ancora possibile, e una valutazione temporale della morfologia radicale può aiutare a determinare durate ottimali di crescita che minimizzino il legame radicale. Inoltre, alcune modifiche al sistema, come la sostituzione del cilindro di vetro con uno in policarbonato, possono aumentare il costo di installazione a oltre 100 USD per unità. Attualmente, GNOVA consente solo il campionamento distruttivo degli endpoint, aumentando i requisiti di lavoro e replicazione per studi temporali di dinamica microbica, modelli di essudazione o monitoraggio della sterilità. Infine, mantenere la sterilità durante l'installazione, l'irrigazione e la raccolta richiede molto tempo, e anche sistemi semplificati come GNOVA richiedono uno sforzo dedicato, il che aumenta i costi operativi complessivi. Collettivamente, queste limitazioni dovrebbero essere considerate nell'adozione di questo sistema. Inoltre, i vincoli ambientali causati dalla crescita gnotobiotica devono essere considerati nella pianificazione degli esperimenti e nell'interpretazione dei risultati, poiché possono influenzare la fisiologia delle piante e, di conseguenza, il microbioma associato.

GNOVA offre una piattaforma gnotobiotica versatile compatibile con le colture cerealicole. Il sistema consente il recupero di sistemi radicali quasi intatti adatti a strumenti di analisi dell'architettura radicale come RhizoVision explorer³⁹ e ARIA⁴⁰, consentendo la caratterizzazione della morfologia radicale in risposta a diversi inoculanti microbici e condizioni ambientali. Quando combinato con SynCom e analisi multi-omiche, GNOVA facilita l'identificazione dei legami meccanicistici tra gli effettori microbici e le risposte delle piante. SynCom più grandi (>100 membri) abbinati all'analisi metagenomica^41,42,43 possono essere utilizzati per esaminare i modelli di co-occorrenza e identificare microbi di rilevanza ecologica in condizioni diverse ^5,44. Al contrario, SynCom più piccoli (<50 ceppi) in combinazione con metatrascritomica^45,46, metaproteomica 19,47,48 e metabolomica 49,50,51 permettono una caratterizzazione dettagliata della risposta funzionale sia nelle piante che nei microbi ⁴⁴. Insieme, queste capacità posizionano GNOVA come uno strumento prezioso per l'identificazione di caratteristiche microbiche chiave che possono accelerare lo sviluppo di nuovi bioinoculanti che migliorano la sostenibilità dei sistemi agricoli.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Powerconnect cordless drill & 100-Piece Kit	Black+Decker	BDC120VA100	1/4" and 1/8" drill bits needed.
Vinyl tape, yellow, 1" wide x 36 yards	3M	471	Consumable material
Sterling Rubber bands size #32  (2 rubber bands per system)	Amazon	B001I1QO00	Consumable material.
Wheat seed			Cultivar used in this experiment: Catawba
Fiberglass pipe wrap insulation, 3 " widex 1/2 " thick  (2 pre-cut circles per system)	Lowe's	28930	Cut into 2 7/8 " (7.3 cm) diam circles. Consumable material. For high throughput production of circles roll out the wrap insulation and use the open edge of the pot to cut the circle by placing the pot on top of the insulation wrap and applying pressure and twisting.
DW4 Filter media, Pre-cut to 15" x 75 yards  (1 cut circle per system)	Class Biological Clean, Ltd	NA	Cut into 6.3 " (16.02 cm) diam circles. CBC has other pre-cut or standard roll sizes that can be purchased instead if desired.  Consumable material. cut a template of the circle in cardboard and use it to draw circles throughout the area of the DW4 media and cut with scissors.
Silicon tubing, Versilon SPX-50 High-strength, 1/8" ID x 1/4" OD x 1/16" wall thickness	Saint-Gobain	ABX00007	Cut into two long pieces ( 16" // 40.64 cm) and three short pieces (2.5" // 6.35 cm)
Sodium hypoclorite 5% available chlorine in aqueous solution	VWR	JT9416-1	Dilute to 2% v/v and use for maize sterilization protocol
Murashige & Skoog medium, micro and macro elements. 25 L	Research Products International	M10200-25.0	Diluted to 0.5x strength
Ethanol, 100%, Deacon Labs	Fisher scientific	04-355-451	Diluted to 95% v/v
Syringe 3 mL, luer lock unsterile  (2 per system)	Fisher scientific	14-817-117	Discard plunger and only keep the barrel, fill with glass wool and cap with foil.
Glass beakers, 250 mL	VWR	470191-150	Five are needed for wheat seed sterilization
Maize seed			Genotype used in this experiment: Mexico 21–22 B73XMo17
Aluminum baking tray 18" x 26"	Amazon	B01FIK54LQ	Make sure it fits the dimensions of your flow hood
Sodium Chloride	Fisher scientific	BP358-1	Prepare 0.145 M solution.
3D printed base, polylactic acid (PLA) filament used (1 per system)	Protolabs	NA	Printing and editable files can be found in supplemental materials. Files available at Dryad.org DOI https://doi.org/10.5061/dryad.f7m0cfzbc. DO NOT AUTOCLAVE if PLA was used as filament to produce the base. PLA will melt above 150 °C and can get deformed above 60 °C. It is recommended that the integrity of the PLA 3D printed base is tested if it is to be used at temperatures above 40 °C. For higher heat resistance materials such as PETG (Polyethylene Terephthalate Glycol) or PC (polycarbonate) can be used instead; this will increase the cost of the part and might still not be autoclaveable. 3D printing of the base prototypes were accomplished in a personal printer with build volumes of of 256 × 256 × 256 mm (length × width × height). For speed and cost efficiency we recommend printing in bulk at local commercial 3D-printing service providers.
Male luer to hose barb fitting 1/8 " ID, animal derivative-free polypropelene  (2 per system)	Cole-Parmer	EW-50114-69	Refered as fitting 1 in the protocol
Male slip luer to hose barb fitting 1/8 " ID, animal derivative-free polyproylene  (1 per system)	Cole-Parmer	EW-50114-63	Refered as fitting 2 in the protocol
201 Stainless steel worm gear hose clamps, 1 1/2" -3 1/2" clamping diameter (1 per system)	Grainger	5CZF2	Refered as hose clamps in protocol
Airstream Gen 3 Laminar flow cabinet with simple switch, dimensions 24 1/4" x 47 " x 28 1/4 "	ESCO Lifesciences	2120707	Refered as laminar flow hood in protocol. Any laminar flow hood with similar dimensions works. Modifications might be needed in smaller flow hoods.
Play sand, Quikrete Premium. 50 lb	The Home Depot	1001709466	Refered as sand in protocol
304 Stainless steel woven wire, 120 mesh (1 per system)	Amazon	B09KRS5F7T	Refered as stainless steel wire mesh in article. Cut into 4.7" (11.9 cm) diameter circles. For high troughput or circle production, cut a template of the circle in cardboard and use it to draw circles throughout the area woven mesh of the woven mesh and cut with scissors.
Clay (Montmorillonite), OIL-DRI Loose Sorbent, 50 lb Wt, not scented	Grainger	44Z111	Refered in protocol as clay. Consumable material.
Clear hurricane candle shade chimney tube without a bottom 4" OD x 30" length (1 per system)	WCG International	HST0430	Refered in protocol as glass cylinder
Clear plastic cap, 3" (7.6 cm) diam  (1 per system)	ClearTec Packaging	PCC3.000	Refered in protocol as plastic cap
Clear Polycarbonate tubing, 3" OD x 2 7/8" ID x 1/16' wall thickness x 12" length  (1 per system)	ePlastics	PCTUB3.000X2.875	Refered in protocol as pot. Can request company to cut to other desired lengths.
Cleanroom sterlization wrap, 6" x 6" (1 per system)	Fisher scientific	17-101-102	Refered in protocol as sterilization wrap. Consumable material.
Dissecting forceps, Medium serrated tip 4 1/2" length	VWR	82027-398	Refered in protocol as tweezers.
Tea strainers	Amazon	B0FRMRZWZY	Three are needed for wheat seed sterilization
Clorox bleach with 5.7%