Combinare iniezioni di collagenasi con sovraccarico meccanico indotto dall'esercizio fisico: un modello murino che simula sovraccarico lesioni da stress osteoartrite al ginocchio

Sommario

Questo protocollo descrive l'istituzione di un modello murino di osteoartrite al ginocchio indotta da sovraccarico combinando iniezioni intraarticolari di collagenasi con sovrasforzo indotto dall'esercizio, fornendo una piattaforma minimamente invasiva per indagare la patogenesi degenerativa.

Abstract

L'osteoartrite del ginocchio (KOA) è una malattia articolare degenerativa multifattoriale causata dalla complessa interazione tra degradazione biologica dei tessuti e sovraccarico meccanico sostenuto. i modelli chirurgici animali convenzionali spesso inducono la distruzione post-traumatica delle articolazioni trigger, che non riescono a replicare accuratamente la patogenesi graduale e cumulativa della KOA degenerativa umana. Per colmare questo divario traslazionale, il presente studio stabilisce un modello murino nuovo e riproducibile che simula il KOA indotto da sovraccarico e stress sinergizzando una lieve degradazione enzimatica della cartilagine con un carico meccanico sostenuto. In particolare, iniezioni intraarticolari standardizzate di collagenasi di tipo II sono state abbinate a uno sforzo meccanico eccessivo giornaliero tramite un apparato di fatica di tipo rotatore rigorosamente calibrato per un periodo di quattro settimane. L'efficacia di questo intervento a doppio fattore è stata convalidata tramite analisi comportamentali, istologiche e molecolari complete. L'analisi automatica dell'andatura ha rivelato gravi deficit locomotori nel gruppo combinato. Questi erano caratterizzati da significative riduzioni nella lunghezza del passo, nella larghezza del passo e nell'area massima della posizione delle zampe. Le valutazioni istomorfologiche utilizzando la colorazione verde safranin O-fast hanno confermato questi deficit funzionali, mostrando un progressivo danno strutturale cartilagine, difetti superficiali e punteggi significativamente elevati della Osteoarthritis Research Society International (OARSI) che rispecchiano fedelmente i tratti patologici degli KOA umani in fase iniziale-media. Inoltre, valutazioni immunoistochimiche hanno dimostrato una marcata regolazione al rialzo del canale meccanosensibile Transient Receptor Potential Vanilloid 4 (TRPV4) e una riduzione concomitante della proteina della matrice cruciale Collagene Tipo II Alfa 1 (COL2A1) nei condrociti articolari. Integrando l'instabilità articolare localizzata con uno stress meccanico controllato, questa strategia minimamente invasiva evita il trauma acuto associato ai modelli chirurgici. Questo protocollo stabilisce una piattaforma sperimentale clinicamente rilevante per monitorare i meccanismi molecolari dinamici, valutare i fenotipi del dolore cronico e testare interventi terapeutici a lungo termine per l'osteoartrite in fase iniziale.

Introduzione

L'osteoartrite (OA) è una condizione degenerativa multifattoriale caratterizzata da dolore, gonfiore, rigidità e funzione compromessa, derivanti da fattori come obesità, sforzo meccanico e^{traumi 1}. L'osteoartrite al ginocchio (KOA) è altamente diffusa e sempre più comune con l'invecchiamento, tuttavia gli studi clinici sono spesso limitati nel campo a causa della diversità delle manifestazioni cliniche. Pertanto, lo sviluppo di trattamenti efficaci richiede modelli animali^{appropriati 2}. Data l'eterogeneità intrinseca dell'OA, non esiste un modello universalmente accettato come "gold standard", che richieda ai ricercatori di identificare modelli specifici che siano in linea con la loro indagine scientifica.

Attualmente la KOA è caratterizzata nella medicina moderna come una condizione che coinvolge l'interazione di fattori meccanici e biologici sulla cartilagine articolare e sul tessuto pericondrale. La conseguenza di questa intricata interazione è principalmente il progressivo deterioramento della cartilagine articolare e della matrice^{circostante 3}. Lo stress meccanico funge da un segnale di trasduzione cruciale che governa vari processi fisiologici e patologici all'interno delle cellule articolari e dei^{tessuti 4}. Mantenere la cartilagine articolare in uno stato sano richiedeva un carico meccanico appropriato all'interno dell'intervallo fisiologico. Al contrario, un sovraccarico di carico eccessivo spesso porta alla degenerazione della cartilagine e alla successiva insorgenza di KOA⁵. I modelli spontanei sono ostacolati da notevoli investimenti di tempo e^{economici 6}, mentre i modelli indotti chirurgicamente utilizzano un approccio distruttivo che rappresenta principalmente KOA in fase intermedia o avanzata, discostandosi dalla progressione degenerativa^{naturale 7,8}. Al contrario, i modelli indotti chimicamente mirano alla matrice di collagene ma non riescono a catturare i cambiamenti completi dell'OA degenerativa umana quando utilizzati senza stress^{meccanico 9}. Combinando la degradazione enzimatica con lo sforzo eccessivo meccanico, si riempiono queste lacune ricapitolando in modo più fedele la patogenesi graduale della lesione da sovraccarico da stress. L'obiettivo di questo studio è stabilire e convalidare un nuovo modello murino di KOA combinando iniezioni intraarticolari di collagenasi di tipo II con sovrasforzo utilizzando un apparato rotante per la fatica della ruota.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con i protocolli approvati dal Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Shanghai. Gli esperimenti sono stati condotti sotto una licenza di progetto (NO: PZSHUTCM201016022) concessa dal Centro Sperimentale per Animali dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Shanghai, in conformità con il Comitato per l'Aggiornamento della Guida alla Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio del National Research Council (USA).

1. Protocollo di produzione di modelli animali

1. Assegnare casualmente 32 topi C57BL/6 di 10 settimane in quattro gruppi: controllo, collagenase, esercizio fisico eccessivo e collagenasi + esercizio fisico.
   1. Acclimatare tutti i topi per una settimana in condizioni standard di alimentazione e alloggio prima di avviare le procedure di modellazione.
2. Indurre i modelli animali su un periodo di 4 settimane secondo i gruppi sperimentali assegnati.
   1. Somministrare collagenasi di tipo II tramite iniezione intra-articolare ai topi del gruppo collagenasi.
   2. Sottoponi i topi del gruppo di esercizio fisico a un addestramento con un apparato a ruota rotante.
   3. Applica sia l'iniezione intra-articolare di collagenasi sia l'allenamento con ruota rotante sui topi del gruppo collagenasi + esercizio intenso.
   4. Mantieni la stessa frequenza e durata di allenamento in tutti i gruppi di esercizi rilevanti.

2. Protocollo di iniezione intraarticolare di collagenasi di tipo II

1. Anestesia
   1. Indurre l'anestesia utilizzando isoflurano somministrato tramite una macchina calibrata per anestesia gassosa. Eseguire un'induzione rapida a una concentrazione del 2%–3% di isoflurano.
   2. Mantieni l'anestesia all'1,5%–2% di isoflurano. Garantire il corretto funzionamento del sistema di recupero degli anestetici per prevenire l'esposizione sul lavoro.
   3. Monitorare continuamente la frequenza respiratoria e i riflessi del topo durante tutta la procedura.
2. Preparazione della pelle
   1. Applica la crema depilatoria nell'area intorno all'articolazione del ginocchio sinistro. Rimuovi completamente i peli usando un raschietto.
   2. Pulisci accuratamente la pelle esposta. Mantieni condizioni asettiche durante tutta la preparazione.
3. Preparazione della collagenasi di tipo II
   1. Bilanciare la polvere di collagenasi di tipo II a temperatura ambiente per 30 minuti in un armadietto sterile di biosicurezza. Utilizzare soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS, pH 7,2–7,4) come solvente e tampone esclusivo per il processo di dissoluzione.
   2. Pesa con precisione la massa necessaria di polvere di collagenasi utilizzando una bilancia analitica. Aggiungi lentamente il PBS sterile alla polvere per raggiungere una concentrazione finale di lavoro di 0,04 U/μL.
   3. Mescola delicatamente la soluzione pipettando la miscela su e giù finché non è trasparente e priva di particelle visibili. Evitare vortici violenti durante questo passaggio per prevenire la perdita di attività enzimatica.
   4. Centrifugare la soluzione preparata da 0,04 U/μL a 1.000 giri/min per 5 minuti a 4 °C. Questo rimuove le microparticelle non disciolte e previene l'ostruzione dell'ago durante l'iniezione successiva.
   5. Aspirare il soprantantante in tubi sterili e conservarli in un bagno di ghiaccio a 4 °C per un uso immediato. Prepara la soluzione con cura per ogni sessione per garantire la massima attività enzimatica.
4. Iniezione intraarticolare
   1. Afferra la pelle dorsale del topo usando il pollice e l'indice della mano non dominante. Fissa entrambi gli arti inferiori con l'anulare e il mignolo per estendere naturalmente le articolazioni del ginocchio ed esporre completamente l'area dell'iniezione.
   2. Tenere una microsiringa da 10 μL dotata di ago da 30 G. Inserire l'ago parallelo alla superficie cutanea nello strato superficiale della pelle per circa 0,2 cm al punto di ingresso.
   3. Regola lentamente la direzione dell'ago verso una posizione perpendicolare rispetto alla pelle quando la resistenza del tessuto diminuisce.
   4. Continuare ad avanzare l'ago per circa 0,3–0,5 cm finché una perdita di resistenza non indica l'ingresso nella cavità articolare. Ritira lentamente lo sturalavandini della siringa per confermare l'assenza di reflusso sanguigno.
   5. Iniettare 5 μL della soluzione di collagenasi di tipo II (concentrazione: 0,04 U/μL) nella cavità articolare a velocità^{costante 10}.
   6. Mantieni la posizione dell'ago subito dopo l'iniezione. Premere delicatamente la pelle intorno al sito di iniezione per 10–15 secondi.
   7. Ritira lentamente l'ago. Premi leggermente il punto di ingresso con una garza sterile per 30 secondi per evitare perdite di farmaci.
   8. Metti il topo in una gabbia domestica calda e asciutta. Lascia che l'animale si riprenda naturalmente dall'anestesia, che di solito richiede 5–10 minuti.
   9. Riprendere le normali condizioni di alloggio e alimentazione dopo che il topo si è completamente ripreso.
   10. Eseguire queste iniezioni intraarticolari due volte a settimana con un intervallo di 3–4 giorni tra una dose e l'altra, esclusivamente durante il periodo di modellazione di 4 settimane (dopo l'acclimatazione iniziale di 1 settimana).
   11. Smaltire immediatamente tutti gli oggetti pungenti in contenitori approvati per rischi biologici.
       NOTA: Assicurarsi che il personale formato eseguisca tutte le iniezioni per minimizzare le lesioni articolari e la variabilità sperimentale.

3. Protocollo di sovrasforzo indotto dalla ruota rotante

1. Preparazione degli apparecchi e controllo di sicurezza
   1. Imposta la velocità dell'apparato per la fatica di tipo rotatore a 12 giri/min (equivalente a circa 0,063 m/s) e la durata a 2 ore per sessione.
   2. Accendi il modulo di stimolazione elettrica. Conferma che la corrente di uscita sia nell'intervallo di sicurezza preimpostato di 0,1–0,3 mA. Non aumentare manualmente l'intensità della corrente.
      ATTENZIONE: Usa il modulo di stimolazione elettrica esclusivamente per guidare i topi di nuovo alla ruota, non come stimolo punitivo. Controlla i cavi dell'apparecchio per eventuali danni e assicurati un buon contatto con gli elettrodi prima dell'uso per prevenire cortocircuiti e scosse elettriche.
2. Formazione all'acclimatazione
   1. Assicurati che le camere rotanti delle ruote dell'apparato di fatica siano pulite, asciutte e prive di detriti. Disattiva gli elettrodi di stimolazione elettrica all'ingresso della ruota per eliminare qualsiasi potenziale stress legato alla stimolazione.
   2. Maneggia delicatamente ogni topo alla base della coda o raccoglili con tessuto morbido sterile. Posiziona i topi singolarmente nella regione centrale della superficie di marcia della ruota rotante.
   3. Posiziona il topo in una posizione quadrupede naturale in piedi sulla superficie orizzontale di corsa. Orientare il corpo parallelo all'asse centrale di rotazione della ruota con le zampe anteriori in avanti e quelle posteriori leggermente indietro.
   4. Usa una barriera morbida temporanea e non restrittiva per impedire al mouse di entrare nella zona stretta degli elettrodi durante i primi 2 minuti. Rimuovere la barriera dopo questo periodo per permettere al topo di esplorare liberamente l'intera camera.
   5. Lascia i topi nell'apparecchio fisso per 10 minuti al giorno nei primi 3 giorni. Non avviare la rotazione della ruota né avviare alcuna stimolazione elettrica durante questo periodo.
   6. Monitora il topo per segni di stress severo come congelamento persistente o crescita eccessiva. Riposiziona delicatamente il topo nell'area centrale della ruota se presenta comportamenti anomali per ripristinare una postura naturale.
   7. Avvia il volante a una velocità di 5 giri/min per una durata di 30 minuti al giorno 4. Questo passaggio abitua i topi al ritmo di movimento dell'apparecchio senza l'uso di segnali elettrici.
   8. Guida manualmente i mouse verso il centro della ruota se cadono o si fermano durante la fase di adattamento ritmico. Assicurati che la stimolazione elettrica rimanga disattivata per tutto il periodo di acclimatazione di 4 giorni.
      ATTENZIONE: Evita di usare stimolazioni elettriche durante la fase di acclimatazione per prevenire risposte di stress indotte dalla paura e garantire la conformità all'addestramento futuro.
3. Esecuzione formale dell'esercitazione
   1. Svolgere la formazione formale a un orario fisso ogni giorno (ad esempio, dalle 9:00 alle 11:00). Indossa guanti isolati per inserire i topi nell'apparato di affatica di tipo rotatore.
   2. Chiudi la porta degli apparecchi. Avvia i parametri preimpostati a 12 giri/min (~0,063 m/s) per una durata massima di 2 ore per sessione (vedi Figura 1).
      ATTENZIONE: monitorare i topi continuamente durante l'addestramento. Interrompi l'addestramento per 5 minuti se un topo cade continuamente (più di 3 volte in 1 minuto) per prevenire una grave stanchezza e infortuni da stress.
4. Determinazione e stimolazione degli endpoint di fatica
   1. Monitorare i topi continuamente per valutare il loro stato di affaticamento. Interrompi la sessione di addestramento in anticipo, senza costringere a durare tutte le 2 ore, se un topo soddisfa almeno due dei quattro criteri specifici di fatica per evitare sovrastress.
   2. Definisci il Criterio 1 come l'incapacità di rimanere sulla ruota per più di 5 secondi prima di cadere. Definisci il Criterio 2 come una frequenza di caduta significativamente aumentata di 3 o più volte entro un periodo di 1 minuto.
   3. Definisci il Criterio 3 come la mancanza di intenzione volontaria di tornare alla ruota, dove il topo rimane immobile o si muove solo brevemente nonostante la stimolazione elettrica.
   4. Definire il Criterio 4 come la presentazione di posture anomale locomotorie. Cerca segnali evidenti come arti trascinanti o un passo traballante.
   5. Permette all'apparecchio di attivare automaticamente una lieve stimolazione elettrica quando un topo cade all'ingresso del giratoio. Assicurati che la stimolazione elettrica si fermi immediatamente non appena il mouse torna alla ruota¹¹.
      ATTENZIONE: Interrompi immediatamente l'addestramento se il topo presenta condizioni anomale come convulsioni o dispnea. Rimuovi il topo dall'apparecchio e fornisci un trattamento sintomatico se necessario.
5. Elaborazione post-addestramento e frequenza
   1. Spegni l'alimentazione dell'apparecchio dopo la fine dell'addestramento. Indossa guanti isolati per rimuovere i topi e riportarli nelle loro gabbie di casa.
   2. Fornite ai topi acqua potabile adeguata. Osserva gli animali per eventuali attività anomale, stato mentale o problemi agli arti (ad esempio, claudicazione o tremori muscolari).
   3. Annota eventuali anomalie e fornisci un trattamento tempestivo.
   4. Mantieni questa frequenza di allenamento una volta al giorno, 2 ore per seduta, per 4 settimane consecutive. Mantieni i parametri di addestramento e il monitoraggio della sicurezza coerenti durante tutto il periodo.
      NOTA: Verifica che l'apparato per la fatica e il modulo di stimolazione elettrica funzionino correttamente prima di ogni sessione di allenamento quotidiana per garantire un'intensità di stimolazione costante.

4. Analisi dell'andatura

1. Panoramica del sistema
   1. Esegui l'acquisizione e l'analisi dell'andatura utilizzando un sistema automatizzato di imaging dell'andatura.
   2. Eseguire tutte le procedure di camminata su 32 topi C57BL/6 di 10 settimane dopo il periodo di modellazione di 4 settimane.
   3. Posiziona la telecamera ad alta velocità sotto la cinghia trasparente del tapis roulant per catturare immagini ventrali durante la locomozione.
2. Acclimatazione e Preparazione
   1. Acclimatare tutti i topi all'apparecchiatura del tapis roulant prima della raccolta formale dei dati per minimizzare lo stress.
   2. Imposta la velocità del tapis roulant a 20 cm/s per corrispondere al ritmo fisiologico dei topi.
   3. Registra tre prove valide indipendenti per topo, con un intervallo di riposo di 2 minuti tra una prova e l'altra.
3. Registrazione della prova e selezione della mossa
   1. Permette al topo di camminare continuamente per un periodo di acquisizione di 60 secondi durante ogni prova.
   2. Esegui una prova sostitutiva se una registrazione è invalida a causa di "blocco", salto o rotazione.
   3. Avviare la raccolta dati solo dopo che il mouse ha raggiunto una locomozione stabile e costante per almeno 10 secondi.
   4. Seleziona almeno 4 passi completi consecutivi da ogni prova di 60 secondi per l'analisi.
   5. Assicurarsi che due osservatori indipendenti e ciechi effettuino la selezione del passo per eliminare il bias soggettivo.
   6. Verifica che il mouse mantenga una postura quadrupede naturale senza saltare o fluttuazioni improvvise di velocità.
   7. Verifica che la falcata includa sia una fase di posizione portante sia una fase di oscillazione con propulsione in avanti.
   8. Controlla immagini di contatto chiare con le cinture delle zampe senza tracciare perdite, sfocatura o contaminazione.
4. Elaborazione delle immagini ed estrazione dei parametri
   1. Utilizza gli algoritmi integrati del software di sistema per digitalizzare le immagini catturate e rilevare i punti di contatto delle cinture delle zampe.
   2. Calcola il rapporto Swing/stance come il rapporto tra la durata della fase dello swing e la durata della fase della posizione.
   3. Misura la lunghezza del passo (cm) come la distanza lineare percorsa durante un singolo passo completo.
   4. Misurare la larghezza del passo (cm) come la distanza orizzontale tra i bordi mediali delle zampe posteriori controlaterali nella posizione di massima posizione.
   5. Determina l'area della zampa nella posizione massima (cm²), che rappresenta l'area totale di contatto al massimo carico di peso.
   6. Calcola la variabilità dell'area della zampa (cm²) come coefficiente di variazione dell'area di contatto tra passi consecutivi.
   7. Calcola il valore medio delle 3 prove valide per ogni singolo mouse ed esporta i dataset finali.
      NOTA: Escludere dall'analisi i trial con comportamenti irregolari di arresto, salto o rotazione.

5. Istologia

1. Raccolta e fissazione dei tessuti
   1. Eutanasia di tutti i topi in modo umano tramite lussazione cervicale dopo il periodo di induzione di 4 settimane. Disseziona con cura l'articolazione del ginocchio sinistro e rimuovi il tessuto molle circostante.
   2. Immergi immediatamente il campione in un fissativo (w/v) di paraformaldeide (PVA) pre-raffreddato. Assicurarsi che il volume del fissativo sia 10–15 volte superiore al volume del campione per immergere completamente il tessuto.
   3. Fissa il tessuto a temperatura ambiente per 48 ore. Agita delicatamente il contenitore di fissazione ogni 8 ore per garantire un'adeguata penetrazione del fissatore.
2. Decalcificazione tissutale
   1. Sciacquare il campione fissato con acqua che scorre lentamente per 10 minuti. Ripeti questo processo di risciacquo tre volte per rimuovere il residuo di PFA.
   2. Trasferire il campione in una soluzione di decalcificazione con acido etilendediaminetetraacetico (EDTA) da 0,5 mol/L (pH 7,2–7,4). Mantenere il volume della soluzione di decalcificazione a 20 volte il volume del campione e conservarlo a 4 °C.
   3. Decalcifica il tessuto per 14–21 giorni. Sostituisci il liquido vecchio con una nuova soluzione di decalcificazione EDTA ogni 3 giorni.
   4. Testare l'endpoint della decalcificazione perforando delicatamente l'osso sottocondrale con un ago sterile. Concludere il processo di decalcificazione quando l'ago penetra in modo fluido senza resistenza.
   5. Lava il campione completamente decalcificato con acqua corrente per 2 ore per rimuovere l'EDTA residuo. Successivamente lava il campione con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) tre volte per 5 minuti ciascuna.
3. Incorporazione e Sezionamento
   1. Disidratare il campione decalcificato in modo sequenziale utilizzando una serie di etanolo graduato (70%, 80% e 90% per 2 ore ciascuno; 95% per 1 ora; etanolo assoluto due volte per 1 ora ciascuno).
   2. Libera il tessuto disidratato nello xilene due volte per 10 minuti ciascuno. Immergi il tessuto purificato nella paraffina.
   3. Tagliare il tessuto incorporato nella paraffina in sezioni sagittali continue spesse 5 μm utilizzando un microtomo. Montare le sezioni su vetrine di vetro rivestite di poli-L-lisina e cuocerle in una piastra riscaldante a 60 °C per 2 ore.
4. Valutazione istomorfologica
   1. Tingere le sezioni con safranina verde O-fast per valutare l'istomorfologia della cartilagine articolare.
   2. Valutare la degenerazione della cartilagine utilizzando il sistema di punteggio dell'Osteoarthritis Research Society International (OARSI) in condizioni di doppio^{cieco 12}.
5. Flusso di lavoro centrale dell'immunoistochimica (IHC)
   1. Deparaffina le sezioni in xilene due volte per 10 minuti ciascuna. Reidratare le sezioni in sequenza attraverso una serie di etanolo gradato fino ad acqua deionizzata.
   2. Immergere le sezioni in un tampone citrato di 0,01 mol/L (pH 6,0) per il recupero dell'epitopo indotto dal calore a microonde. Riscalda il tampone fino a ebollizione ad alta potenza, poi mantieni una lieve sobbollizione a media potenza per 15 minuti.
   3. Raffredda le sezioni naturalmente a temperatura ambiente. Lava i vetri con PBS tre volte per 5 minuti ciascuno
   4. Incubare le sezioni in una soluzione di metanolo al 3% di perossido di idrogeno (H2O2) per 20 minuti a temperatura ambiente per bloccare l'attività della perossidasi endogena. Lava i vetri con PBS tre volte per 5 minuti ciascuno.
   5. Applica una soluzione bloccante del siero di capra al 5% sulle sezioni. Incubare per 60 minuti a temperatura ambiente per bloccare i siti di legame non specifici.
   6. Scartare la soluzione di blocco senza lavarla. Applicare la soluzione primaria specifica di lavoro per anticorpi (Transient Receptor Potential Vanilloid 4 (TRPV4) a 1:100, Caspasi-3 a 1:200, o Collagen Tipo II Alpha 1 (COL2A1) a diluizione 1:150).
   7. Incubare le sezioni con l'anticorpo primario in una camera umidificata a 4 °C durante la notte per 12–16 ore.
   8. Bilancia le sezioni a temperatura ambiente per 30 minuti il giorno successivo, poi lava con PBS tre volte per 5 minuti ciascuna. Applicare un anticorpo secondario IgG anti-coniglio o anti-topo coniugato con perossidasi di rafano (HRP) (diluizione 1:500).
   9. Incubare le sezioni con l'anticorpo secondario per 60 minuti a temperatura ambiente. Lava i vetri con PBS tre volte per 5 minuti ciascuno.
   10. Applicare una soluzione di cromogeno 3,3'-diaminobenzidina (DAB) e incubare al buio per 3–5 minuti a temperatura ambiente. Fermare immediatamente la reazione con acqua deionizzata quando appare un chiaro segnale marrone sotto osservazione microscopica.
   11. Contrasta le sezioni con una soluzione di ematossilina per 5 minuti. Sciacquare sotto acqua corrente per 10 minuti per permettere alla macchia di diventare blu.
   12. Differenzia le sezioni usando una soluzione acida alcolica all'1% per 30 secondi. Sciacquare i vetri sotto acqua corrente per 5 minuti.
   13. Disidratare rapidamente le sezioni attraverso una serie di etanolo graduato e liberare il tessuto nello xilene due volte per 10 minuti ciascuno.
   14. Montare le guide usando balsamo neutro e coprile con coperture in resina ottica. Lascia asciugare le guide montate a temperatura ambiente.
6. Controlli IHC e Analisi delle Immagini
   1. Stabilire un controllo negativo sostituendo l'anticorpo primario con PBS durante la procedura di colorazione. Includere una sezione cartilaginea nota come test positivo per verificare l'efficacia degli anticorpi.
   2. Acquisisci le immagini delle sezioni colorate usando uno scanner intero di diapositive con ingrandimenti del 40× e 100×.
      NOTA: Eseguire tutte le valutazioni istologiche in modo indipendente da almeno due osservatori accecati per ridurre il bias soggettivo.

6. Analisi statistica

1. Gestione dei dati e test complessivi
   1. Effettuare tutta la raccolta e l'analisi dei dati in condizioni cieche per minimizzare il bias sperimentale.
   2. Analizza le variabili continue tra i quattro gruppi sperimentali utilizzando un'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) per testare le differenze complessive.
   3. Applicare il test H di Kruskal-Wallis a qualsiasi variabile che non soddisfi le assunzioni parametriche necessarie.
2. Test Post Hoc e Soglie di Significatività
   1. Esegui confronti a coppie post hoc utilizzando il test di Tukey per identificare differenze specifiche tra gruppi se l'ANOVA iniziale indica significatività statistica.
   2. Affidati esclusivamente al test di Tukey per controllare il tasso di errore familiare. Non combinare questo con altri metodi di correzione a confronto multiplo.
   3. Definire la significanza statistica in modo uniforme come p < 0,05

Risultati

Analisi dell'andatura
Parametri del ciclo dell'andatura: Il rapporto oscillazione/posizione—definito come il rapporto tra la durata della fase di oscillazione non portante e la fase di posizione portante di un singolo passo—è stato valutato per riflettere l'equilibrio tra carico e propulsione. Rispetto al gruppo di controllo (2,10 ± 0,06), i topi che hanno ricevuto un'iniezione intraarticolare di collagenasi (1,45 ± 0,05) o hanno fatto esercizio fisico eccessivo (1,68...

Discussione

In questo studio, abbiamo sviluppato un nuovo modello murino di KOA che imita gli effetti dello stress eccessivo sull'articolazione combinando l'iniezione intraarticolare di collagenasi con un allenamento fisico che induce fatica su ruota. Questi risultati confermano ancora una volta l'idea che il KOA derivi dall'interazione di fattori biologici e meccanici. Comprendere e identificare questi fattori rappresenta un vantaggio per ideare piani di trattamento personalizzati e strategie preve...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Fissativo al 4% di paraformaldeide	Beyotime	P0099
Acido acetico	Sinopharm	631-61-8
Sistema di imaging DigiGait per topi	Scienze della Vita RWD	MSI-DIG-MS
Soluzione EDTA	Procell	PB180320
Incorporazione della cassetta	Leica	IP C
Etanolo	Sinopharm	64-17-5
Tinta verde veloce	Leyan	1085995
Crema depilatoria	Veet	G20161330
Ematossilina	Adamas	61753A
Centrifuga refrigerata ad alta velocità	Hermle	Z366K
Incubatore	TAITEC	M-210FN
Macchina per anestesia inalatoria	Ranger	RZ-Viking
Isoflurano	Webio	W100
Microtomo	Ted Pella	10180-220
Apparecchio di fatica di tipo rotatore del topo	Tecnologia Biologica Zhishu Duobao di Pechino	YLS-10B
Balsamo neutro	Sinopharm	96949-21-2
Colorazione Safranin O	Bioss	S0062
Centro di incassamento semiautomatico dei tessuti	Thermo Fisher	HistoStar
Piastra riscaldante per asciugatura a slitta	Scienze della microscopia elettronica	XH-2002
Bagno d'acqua a galleggiamento tissutale	BIOBASE	BT-I
Collagenasi di tipo II	Sigma-Aldrich	C4-22-1G
Scanner intero per diapositive	Leica	Aperio VERSA
Xylene	Sinopharm	1330-20-7