Articolo metodologico

Saggio di isolamento a fibra singola per la valutazione del comportamento ossidativo delle miofibre

470 visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/70637

⸱

31 marzo 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Health Promotion Sciences, Graduate School of Human Health Sciences, Tokyo Metropolitan University, 2Department of Immunology, Graduate School of Medicine, Juntendo University

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive l'isolamento delle singole fibre muscolari intate dal soleo ossidativo e l'istituzione di colture mioblastiche altamente purificate derivate da queste fibre. La procedura ottimizzata fornisce in modo affidabile circa 300–500 miofibre intatte per topo, permettendo analisi molecolari e cellulari a valle.

Abstract

Il muscolo scheletrico è composto da miofibre multinucleate la cui integrità e funzione sono essenziali per il movimento e la salute generale. Nei disturbi neuromuscolari, i gruppi muscolari possono essere influenzati in modo differenziale tra tipi e stadi di malattia, rendendo importante isolare singole fibre vitali da muscoli rappresentativi per studi meccanicistici. L'obiettivo di questo protocollo è fornire un metodo affidabile per isolare un alto rendimento di miofibre singole intatte dal muscolo soleo murino (SOL), che è difficile da dissociare a causa della lunghezza e della fragilità della fibra. Ottimizzando la concentrazione di collagenasi e il tempo di digestione, il protocollo minimizza la perdita di fibre e preserva la vitalità durante la dissociazione. Il flusso di lavoro ottimizzato riduce notevolmente l'attacco residuo del tessuto alle fibre isolate, limitando così il trasferimento delle cellule non fibrose e minimizzando la contaminazione tra cellule. Questa tecnica è adatta sia per analisi a singola fibra sia per l'isolamento delle cellule satellitari e la successiva espansione in condizioni di contaminazione minima. Utilizzando questo flusso di lavoro ottimizzato, otteniamo regolarmente ~300–500 miofibre singole intatte derivate da SOL che possono essere immunomarcate con alta efficienza e che producono anche una popolazione cellulare satellitare di alta qualità con una contaminazione minima da fibroblasti. Utilizzando analisi comparative con il muscolo Extensor Digitorum Longus (EDL) sottolineiamo il valore di un approccio personalizzato e specifico per muscolo nella valutazione delle terapie nella ricerca sulle malattie neuromuscolari, consentendo di testare interventi farmaceutici candidati entro finestre sperimentali ridotte e modificabili.

Introduzione

Il muscolo scheletrico è il tessuto più abbondante nel corpo umano, rappresentando circa il 40–50% della massa corporeatotale 1. Il muscolo scheletrico funge da serbatoio di energia sotto forma di glicogeno. Durante l'esposizione al freddo, fornisce calore tramite termogenesi e, cosa importante, favorisce la locomozione. Il muscolo scheletrico è composto da miofibre multinucleate e post-mitotiche. Per sostenere la maturazione e la riparazione muscolare, nuovi mionuclei vengono generati dalla cellula staminale residente del muscolo scheletrico, la cellula satellite (SC). Le SC si trovano alla periferia delle fibre muscolari scheletrichepostnatali 2,3,4. Le SC sono identificate dal fattore di trascrizione Pax7, che si esprime sia negli stati quiescenti che in quelliattivati 3,5. In caso di lesione o stimolazione ipertrofica, le SC attivano e regolano al meglio la MyoD, entrano nel programma miogenico, si proliferano e infine si fondono con miofibre esistenti o appena formate per ripristinare la funzione muscolare 6,7,8. Le CS sono eterogenee nella loro capacità di stallo, origine embriologica (somitica vs non somitica), stadio di crescita postnatale (giovani vs vecchi) e composizione muscolare (fibre veloci vs lente)9,10,11.

A seconda della regione del corpo, il muscolo scheletrico è adattato per soddisfare le esigenze energetiche e funzionali di quella regione. Questa eterogeneità nelle fibre muscolari è possibile grazie alla loro contrattilità e capacità ossidativa. Infatti, le fibre muscolari sono composte da fibre ossidative a contrazione lenta (denominate tipo I e IIa) e fibre glicolitiche a contrazione rapida (chiamate IIx, nei roditori IIb)12,13. Questo bellissimo mosaico funzionale di tipi di fibre ci permette di muoverci liberamente nella vita quotidiana. Ad esempio, i muscoli posturali come il soleo (SOL) e la spina erettrice sono in uno stato di attivazione cronica e a basso livello, e quindi contengono un'alta proporzione di fibre muscolari di tipo I e IIa di tipo lento-ossidativo. Al contrario, muscoli corti ma ad azione rapida come l'extensore del dito lungo (EDL) sono composti principalmente da fibre glicolitiche di tipo IIx e tipo IIb. La composizione della fibra, tuttavia, non è fissa; piuttosto, le fibre muscolari sono strutture dinamiche capaci di passare da veloci a lenti e viceversa a seconda delle esigenze funzionali che vengono loro imposte. La differenza nella contrattibilità del tipo di fibra è possibile a causa del contenuto di proteina miosina. Questa è la proteina principale all'interno del muscolo scheletrico, composta da isoforme di miosina catene leggere e pesanti12,14.

All'interno di un sarcomero (la più piccola unità funzionale del muscolo che genera forza), le teste miosina e l'actina interagiscono per formare una struttura nota come crossbridge. Attraverso l'idrolisi dell'ATP, l'energia viene rilasciata dal ciclo delle interazioni tra miosina eactina 15,16. La catena pesante di miosina (MyHC) è il marcatore più appropriato per l'identificazione del tipo di fibra12,13. A seconda dell'isoforma di MyHC espressa, la velocità di contrattilità muscolare varierà. Come detto, le fibre di tipo I sono fibre ossidative lente, a differenza di quelle di tipo II. I gruppi muscolari dominanti di tipo I contengono una maggiore abbondanza di enzimi ossidativi, sono più ricchi di mitocondri e possiedono una densa rete capillare per perfondere ilmuscolo 17,18 (pensa a un maratoneta). Le fibre di tipo I sono codificate dal gene MYH7 13,19. Le fibre di tipo II sono rapide da affaticare, contengono un'alta proporzione di enzimi glicolitici e hanno una velocità massima di accorciamento maggiore, rendendole ideali per brevi scariche di potenza o movimento (pensa al power lifter). Le fibre di tipo II per i tipi IIa, IIx e IIb (nei roditori) sono codificate dai geni MYH2, MYH1 e MYH4, rispettivamente20,21. Non sorprende che qualsiasi offesa fisiopatologica che comprometta l'integrità muscolare alteri la composizione delle fibre e porti a effetti negativi sulla funzione muscolare, potenzialmente abbassando la qualità della vita. In effetti, molte distrofie muscolari iniziano o nella cellula satellite (opatie cellulari satelliti) o nella fibra muscolare (derivate da neuroni motori o tessuti muscolari), e possono causare uno spostamento nella composizione dei tipi difibre 22,23,24,25. Ad esempio, le lesioni del midollo spinale, gli studi sul riposo a letto e il volo spaziale (microgravità) mostrano che l'inattività a lungo termine può far sì che i muscoli posturali passino da un fenotipo di fibra lento a unorapido 26,27,28,29,30. Al contrario, nella distrofia muscolare di Duchenne, sia nei modelli umani che murini (mdx), le fibre glicolitiche rapide sono colpite in misura maggiore e con maggiore gravità rispetto alle loro controparti più lente 31,32,33,34. Analogamente, nella distrofia muscolare facioscapulo-umerale (FSHD), si osserva una transizione da contrazione rapida a lenta con una maggiore proporzione di fibre di tipo I insieme a una produzione di forza inferiore nelle fibre di tipoII 24,35,36.

Rimane poco chiaro perché certi tipi di fibre muscolari siano selettivamente influenzati o risparmiati da diverse malattie. Il fatto che questi pattern siano non casuali sottolinea l'importanza di analizzare i meccanismi sottostanti, per i quali l'isolamento a singola fibra è emerso come una tecnica potente e ampiamente utilizzata. Infatti, da quando fu introdotto per la prima volta a metà degli anni '80 da Bischoff37, questo strumento indispensabile è stato continuamente perfezionato e adattato, consentendo un'indagine sempre più precisa della biologiamuscolare 38,39,40. È importante sottolineare che l'isolamento a singola fibra mantiene le SC il più vicino possibile alla loro nicchia fisiologica, consentendo un adeguato controllo della loro attività molecolare. Sebbene gruppi muscolari come quelli del flessore della dita breve (FDB) e EDL possano essere estratti con relativafacilità 41,42,43, il muscolo SOL rimane uno dei muscoli più difficili da ottenere una popolazione ricca di fibre intatte. Questo è dovuto alla sua rigidità, alla lunga lunghezza della fibra e alla suscettibilità ai danni. Per affrontare questo problema, nel presente studio è stata ottimizzata una tecnica che produce in modo robusto una popolazione di fibre di alta qualità e vitale dal muscolo SOL, notoriamente difficile da isolare. Quando combinato con l'isolamento delle fibre EDL, questo approccio consente la coltura di fibre e cellule derivate (cellule satelliti, mioblasti e miotubi) da gruppi muscolari distinti. In modo fondamentale, questa piattaforma consente un'indagine sistematica dei fattori molecolari che possono contribuire differenzialmente a diverse patologie muscolari e fornisce un potente mezzo per testare interventi farmaceutici in modo da rivelare risposte specifiche per tipo muscolare e, in ultima analisi, supportare lo sviluppo di trattamenti efficaci per le malattie muscolari scheletrice.

Protocollo

Tutti gli animali erano ospitati nella struttura per animali dell'Università Metropolitana di Tokyo (Numeri di permesso: A4-4, A5-9, A6-7, A7-018). Tutti gli animali sono stati mantenuti in condizioni specifiche di neutralità patogenica (SPF). Le procedure di gestione degli animali e sperimentali impiegate in questo studio hanno seguito rigorosamente le linee guida del Comitato per la Sicurezza e l'Etica dell'Università Metropolitana di Tokyo.

1. Preparazione del reagente

  1. Indossa i guanti per tutto il tempo. In un tubo centrifugo da 25 mL, preparare lo 0,5% di soluzione di Collagenasi di tipo I in un medium Eagle Modificato (DMEM) ad alto livello di glucosio Dulbecco + GlutaMAX con sospensione al 1% di penicillina-estreptomicina-anfotericina B (AB). Dopo che la collagenasi è ben sciolta (tocca leggermente il tubo se necessario), sterilizza la soluzione filtrandola attraverso un filtro a bassa proteina da 0,22 μm.
    NOTA: 2,5 mL di soluzione di collagenasi sono sufficienti per due solei (un topo).
  2. Prepara 10 mL di albumina sirica bovina al 5% (BSA) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Inattivare il calore a 60 °C per 30 minuti, poi filtrare la soluzione attraverso un filtro a basso legame proteico da 0,22 μm.
    NOTA: Il 5% di BSA nella soluzione PBS può essere conservato a 4 °C per un massimo di 10 giorni.

2. Dissezione dei muscoli soleo

  1. Attrezzatura di layout per la dissezione muscolare (Figura 1A).
  2. Anestetizzare i topi C57BL/6 con iniezione intraperitoneale di una miscela anestetica tripla (0,5 mL/g di peso corporeo) contenente 1 mg/mL di medetomidina cloridrato, 5 mg/mL di midazolam e 5 mg/mL di butorphanol tartrato, quindi eutanasiare i topi tramite lussazione cervicale.
  3. Fai incisioni cutanee sequenziali sull'arto posteriore e spegni la pelle. Rimuovi la fascia superficiale.
  4. Separare il tendine plantare (PLA) dai fasci tendini del gastrocnemio (GAS) e del soleo (SOL). Rimuovere delicatamente il PLA tirando dal tendine (Figura 1B).
  5. Taglia i fasci tendini GAS e SOL ed esponi i muscoli. Inserire un perno nello spazio tra il tendine prossimale del GAS e il SOL (Figura 1C).
  6. Sposta con attenzione l'ago verso l'estremità distale per separare il muscolo SOL e il GAS (Figura 1D).
  7. Taglia i fasci tendinosi dal lato GAS (Figura 1E).
  8. Appoggia il tempo libero sul GAS. Regolare con attenzione la posizione del SOL per esporre il tendine prossimale e tagliarlo con un paio di microforbici (Figura 1F).
  9. Posizionare il SOL sul tavolo di dissezione e rimuovere il tendine rimanente (Figura 1G).
    NOTA: Questo passaggio è opzionale; il tendine rimanente non influisce sull'esito.

3. Digestione dei muscoli soleo

  1. Trasferire il soleo intatto in un tubo centrifuga da 25 mL contenente la soluzione preparata allo 0,5% di collagenasi. Incubare a 37 °C per 130 minuti.
    NOTA: Ogni 15–20 minuti si può agitare manualmente il campione per separare leggermente le fibre e sostenere l'attività della collagenasi.

4. Isolamento di singole fibre sotto stereomicroscopio

  1. Taglia due pipette Pasteur per crearne una con un foro ampio e una con apertura stretta (Figura 2A). Sotto fiamme, sterilizza e leviga i fori per evitare danni muscolari durante la triturazione.
  2. Per prevenire l'adesione delle fibre durante l'isolamento, ricoprire le pipette Pasteur e tre piastre di Petri da 50 mm con il 5% di BSA/PBS.
    NOTA: Un microscopio stereoscopico (Figura 2B) è stato utilizzato durante tutte le fasi di isolamento.
  3. Dopo la digestione muscolare, si elimina la soluzione di collagenasi in eccesso e si trasferisce il soleo nel primo piatto contenente DMEM con l'1% AB (Figura 2C).
  4. Utilizzando la pipetta a larga cilindrata Pasteur, risciacqua delicatamente su e giù per dissociare le fibre (Figura 2D).
  5. Con la pipetta Pasteur a canna stretta, trasferire le singole fibre intatte lungo la lunghezza della fibra muscolare al secondo piatto. Approfitta qui per rimuovere detriti e/o fibre rimpicciolite (Figura 2E,F).
  6. Trasferire fibre singole di alta qualità (a lunghezza intera/intatte) in un terzo piatto per garantirne la purezza con la pipetta Pasteur a foro stretto (Figura 2G,H).
  7. Raccogli le fibre in un tubo centrifuga da 25 mL rivestito con BSA. Mescola delicatamente la sospensione, poi lasciala per 5 minuti a temperatura ambiente per permettere alle fibre di precipitare sul fondo del tubo.
  8. Utilizzando la pipetta Pasteur a canna stretta, scartare con cura il surnante, rimuovendo eventuali residui residui. Lasciare circa 500 μL del DMEM con una soluzione AB all'1%. Questo precipitato conterrà una popolazione altamente purificata di singole fibre muscolari (Figura 2G,H).
    NOTA: Questa tecnica può produrre > 300 singole fibre, che possono poi essere utilizzate per l'estrazione di proteine e mRNA e per la successiva analisi.

5. Stabilimento di colture mioblastiche altamente purificate da fibre di soleo

  1. Diluire la matrice Matrigel a 0,1 mg/mL e usarla per rivestire un piatto di coltura da 100 mm. Incubare la piastra a 37 °C per 30–60 minuti finché il rivestimento polimerizza in modo uniforme.
  2. Aggiungi un volume uguale di Accutase alla sospensione delle fibre muscolari e incuba a temperatura ambiente per 10 minuti. Successivamente, aggiungere 10 mL di mezzo di crescita (composto da DMEM senza glucosio contenente 30% di siero fetale bovino, 1% di GlutaMAX, 1% estratto di embrione di pollo, CEE, 1% AB e 0,01 μg/mL fattore di crescita fibroblastico base, bFGF)44.
    NOTA: Una quantità uguale di Accutasi in questo caso corrisponde ai 500 μL descritti nella Sezione 4.8. Accutase facilita la dissociazione delicata delle fibre muscolari e aiuta a rilasciare cellule satelliti, supportando la successiva espansione della coltura mioblastica.
  3. Trasferire i 10 mL di sospensione di fibre muscolari trattate con Accutase in una ciotola rivestita con Matrigel. Circa 4 singole fibre/cm2 vengono aggiunte a un piatto di coltura da 100 mm. Assicurati che le fibre siano distribuite uniformemente in tutto il vaso di coltura.
  4. Dopo 3 giorni nel mezzo di coltura, si possono osservare colonie di mioblasti. Sostituisci il mezzo di crescita ogni giorno finché i mioblasti non raggiungono la popolazione richiesta. Normalmente, entro il sesto giorno, le colture mioblastiche diventano abbastanza confluenti per la fase sperimentale (Figura 3A).
  5. Distogliere i mioblasti dal loro piatto di coltura originale usando tripsina e incubare il campione a 37 °C per 2 minuti. Utilizzando un emocitometro, contare le cellule e i semi in base alla dimensione del pozzo e alla confluenza cellulare necessaria per la progressione miogenica.
    NOTA: Per un piatto da 100 mm, aggiungi 1 mL di tripsina.

Risultati

La nostra tecnica dimostra che le fibre isolate dei muscoli del soleo (SOL) e dell'estensore lungo della dita (EDL) possono essere immunomarcate efficacemente contro Pax7 (Figura 3B). Queste fibre isolate possono essere conservate in un mezzo di coltura galleggiante (composto da DMEM + GlutaMAX con siero di cavallo al 10%, 1% AB, 0,5% CEE) per 3 giorni, seguiti da immunomarcatura (Figura 3B). Non è consigliato mantenere le fibre galleggianti per più di 4 giorni. Nelle condizioni descritte di fibre flottanti, le miofibre tendono ad aggregarsi dopo questo periodo, compromettendo l'analisi successiva di immunomarcatura.

La tecnica presentata può inoltre essere utilizzata per l'immunoblotting in tutto il programma miogenico (Figura 3C). Infatti, mioblasti derivati da SOL ed EDL sono stati placcati in piastre a 24 pozzi con una confluenza di circa il 70%. Le cellule sono state mantenute nel mezzo di crescita per 1 giorno (mioblasti) oppure indotte a differenziarsi per due o quattro giorni (miotube a formazione precoce e differenziazione, rispettivamente). Cinque μg di proteina sono stati caricati per l'analisi immunoblottante.

L'espressione di MyHC I è stata espressa quasi specificamente nelle fibre muscolari derivate da SOL, con espressione minima nei miotubi e trascurabile nei mioblasti (Figura 3C). MyHC II è stato espresso sia nelle fibre muscolari SOL che EDL. Questa espressione riflette il SOL, composto principalmente da tipi I e IIa, mentre l'EDL è composto principalmente da fibre IIx e IIb. I mioblasti non hanno espresso MyHC II, ma la sua espressione è aumentata progressivamente durante la differenziazione. Le proteine ossidative correlate PGC-1α e COXIV hanno dimostrato l'espressione attesa più alta nelle fibre derivate da SOL. Inoltre, è stata rilevata un'espressione più elevata di GLUT4 nelle fibre isolate di SOL rispetto a quelle di EDL. Un problema che i biologi muscolari scheletrici possono affrontare è che le proteine di mantenimento e i controlli di carico ampiamente utilizzati, come α-tubulina, β-actina, GAPDH e colorazioni proteiche totali come Ponceau S, non rimangono stabili su mioblasti, miotubi e fibre muscolari isolate, ognuna mostrano una variabilità distinta. L'intensità del segnale di α-tubulina e β-actina era più alta nei miotubi, mentre la colorazione con Ponceau S era relativamente debole nei mioblasti. Al contrario, il GAPDH ha mostrato una maggiore espressione nelle fibre muscolari EDL. Tuttavia, a seconda dello scopo sperimentale, una di queste proteine di mantenimento potrebbe ancora essere applicabile; in alternativa, si possono esplorare fattori di normalizzazione come la proteina dello shock termico 70 (HSP70).

Figura 1
Figura 1. Dissezione del muscolo soleo. (A) Attrezzatura necessaria per la dissezione. 1: microforbici, 2: pinze sottili, 3: forbici sezionanti e 4: perni di dissezione. (B) Il tendine PLA è stato tagliato dai fasci tendini GAS e SOL (freccia gialla). Il tendine distale del PLA (freccia bianca) è stato sollevato con una pinza. (C) Un perno di dissezione è stato inserito nello spazio tra il tendine prossimale del SOL (freccia rossa) e il GAS (freccia verde). (D) SOL è stato separato dal GAS tramite un perno di dissezione. (E) I fasci tendinosi GAS e SOL sono stati quindi tagliati sul lato GAS. (F) Il tendine prossimale SOL è stato poi tagliato con microforbici. (G) Ulteriori fasci tendini distali sono stati rimossi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2. Isolamento delle fibre del soleo. (A) Attrezzatura necessaria per l'isolamento. 1: pipette a canna stretta e 2: pipette Pasteur a canna larga. (B) Stereomicroscopio usato per l'isolamento. (C) Il soleo digerito dalla collagenasi è stato trasferito al DMEM con AB dell'1%. (D) Le fibre del soleo si sono dissociate dal muscolo dopo le prime 10 sessioni di risciacquo. (E) Fibre singole trasferite al secondo piatto. (F) Immagine che mostra fibre pulite rimosse da detriti e fibre rimpicciolite. (G) Fibre singole senza detriti trasferite al terzo piatto. (H) Fibre singole intatte chiaramente visibili. Barra in scala = 10 mm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Espansione della coltura cellulare e analisi di campioni derivati da EDL e SOL. (R) Dopo 6 giorni dall'isolamento, i campioni coltivati con il mezzo di proliferazione mostrano una coltura mioblastica pura ottenuta da fibre isolate del soleo. Barra di scala = 100 μm. (B) SOL e fibre singole derivate dall'EDL, immediatamente o 3 giorni dopo l'isolamento, mostrano cellule satelliti immunomarcate per Pax7 (verde). L'assenza di MyoD (rosso) conferma che le cellule satelliti non si sono ancora impegnate nell'attivazione miogenica. Le fibre sono state controcolorate con DAPI (blu). Le cellule sono state successivamente osservate tramite un microscopio a fluorescenza. Barra di scala = 20 μm. (C) 5 μg di proteina è stata utilizzata per l'immunoblotting di mioblasti, miotubi e campioni derivati da miofibre. I pannelli immunoblottanti mostrano l'espressione di MyHC I, MyHC II, PGC-1α, COX IV, GLUT4, α-tubulina, β-actina e GAPDH sono stati utilizzati come bersagli di mantenimento/normalizzazione. La colorazione Ponceau S è stata utilizzata come controllo del carico totale di proteine. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

La prima chiave per isolare un gran numero di fibre muscolari dal soleo (SOL) è mantenere l'integrità strutturale del muscolo durante la dissezione. Se l'epimisio del SOL viene strappato o se il muscolo viene tirato con forza, specialmente lungo il suo asse longitudinale, durante la dissezione, la resa dell'isolamento sarà gravemente compromessa. Questi errori di dissezione sono solitamente facili da identificare in seguito. Infatti, dopo la digestione della collagenasi, il muscolo si riduce uniformemente e forma una massa bianca e compatta. In tali condizioni, solo un numero molto piccolo di fibre vitali può essere dissociato.

Il secondo fattore decisivo per il successo dell'isolamento del soleo è l'efficienza della digestione della collagenasi di tipo I. Quando la collagenasi funziona al meglio, si possono ottenere circa 100–200 fibre di soleo durante le prime 10 sessioni di risciacquo. Al contrario, quando la digestione è subottimale, anche dopo i primi 20 risciacqui, possono essere rilasciate meno di 50 fibre. Per ottenere una resa di fibre più elevata, sono necessari un risciacquo più vigoroso e cicli di risciacquo aggiuntivi. Tuttavia, poiché le fibre SOL sono eccezionalmente fragili, questo spesso provoca un restringimento durante il risciacquo.

Per stabilire una coltura primaria di mioblast derivata da SOL pura, la digestione della collagenasi svolge nuovamente un ruolo cruciale. Quando la digestione è efficiente, meno fibre rimangono attaccate al tessuto residuo e il trasferimento delle fibre nel mezzo di coltura comporta una contaminazione minima da fibroblasti. Al contrario, quando il SOL è mal digerito, le fibre dissociate rimangono attaccate ai tessuti residui, contaminando la coltura mioblastica con fibroblasti. I ricercatori dovrebbero cercare i segni tipici di contaminazione da fibroblasti nei campioni cellulari seminati; queste includono dimensioni cellulari molto maggiori e estese protuberanze citoscheletriche, rispetto alle cellule satelliti molto più piccole a forma di fuso nelle piastre aderite a Matrigel. In caso di contaminazione, i ricercatori possono sottoporre le cellule a fasi di pre-placcatura come descritto altrove45. Per un breve periodo, le SC vengono coltivate per 3 giorni dopo l'isolamento, poi tripsinizzate e brevemente pre-impiattate su piastre rivestite di collagene. Durante 15–30 minuti di incubazione, i fibroblasti aderiscono mentre gli SC rimangono sospesi e vengono trasferiti su placche fresche rivestite di Matrigel.

Come già accennato e coerente con la nostra esperienza, le fibre SOL sono più lunghe e fragili rispetto a quelle dell'extensore digitorum longus (EDL) e del flessiore digitorum brevis (FDB). Questo rende difficile il trasferimento delle fibre con le pipette Pasteur. È essenziale aspirare le fibre lungo il loro asse longitudinale piuttosto che ritirarle dal centro; altrimenti, le fibre si piegano e si restringono sotto lo stress. Oltre ai fattori decisivi che determinano direttamente se l'isolamento della fibra abbia successo, alcuni passaggi tecnici aggiuntivi sono essenziali per migliorare la resa della fibra del soleo. Una di queste consiste nel rivestire tutte le pipette, piatti e tubi di raccolta Pasteur con il 5% di BSA. Questo impedisce alle fibre muscolari appena dissociate di aderire alle superfici, prevenendo così la piega delle fibre e il conseguente restringimento. Si raccomanda di preparare nuove pipette Pasteur sterilizzate termicamente e rivestite di BSA ogni volta che vengono isolati campioni muscolari. In alternativa, i ricercatori potrebbero preparare un set di pipette Pasteur per un uso a lungo termine. Se sì, sterilizza a caldo ogni volta e poi ricopri di BSA prima di usarlo.

Il protocollo convenzionale per l'isolamento di fibre muscolari singole era principalmente ottimizzato per i muscoli glicolitici come FDB ed EDL37. Tuttavia, i muscoli ossidativi, come il SOL, sono strutturalmente distinti. Analisi trascrivomiche hanno dimostrato che l'espressione genica correlata alla matrice extracellulare (ECM) differisce tra il SOL edEDL 46, includendo geni come la distrofina, una proteina del collegamento del citoscheletro del muscoloscheletro 44. Di conseguenza, la condizione standard per la digestione muscolare EDL con collagenasi allo 0,2% (2 mg/mL) per 60–90 minuti non è ottimale per i muscoli SOL, causando aggregazioni fibrose compatte o fibre rimpicciolite dopo la digestione. In questo studio, abbiamo ottimizzato diversi passaggi chiave per adattare il protocollo ai muscoli SOL ossidativi. Regolando la concentrazione di collagenasi di tipo I allo 0,5% (5 mg/mL), estendendo il periodo di incubazione a 130 minuti e minimizzando lo stress meccanico durante il risciacquo, si possono ottenere costantemente 300–500 fibre intatte da un singolo topo. Rispetto all'EDL, il numero di fibre e la resa dei campioni SOL rimangono inferiori (l'EDL può produrre > 500 fibre); tuttavia, il numero di fibre e, cosa importante, l'alta qualità delle nostre fibre derivate da SOL sono robuste e adatte ad applicazioni a valle come l'immunomarcatura e l'immunoblotting. Sebbene i nostri risultati di immunoblotting consistessero in campioni di singola fibra aggregati, la tecnica presentata in questo rapporto è in grado di estrarre in modo affidabile singole fibre intate, rendendole adatte ad applicazioni a valle come immunoblotting, proteomica e sequenziamentoRNA-47 a risoluzione singola di fibra. I ricercatori del settore possono utilizzare questa tecnica per studiare le differenze metaboliche e contrattili tra fibre muscolari ossidative e glicolitiche.

Nel complesso, questo protocollo fornisce un metodo riproducibile e accessibile per isolare le fibre ossidative intatte dal muscolo soleo, ampliando il set di strumenti disponibile per indagare la fisiologia e i meccanismi molecolari specifici per tipo di fibra muscolare.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

Questo studio è stato supportato dall'istituzione di borse universitarie per la creazione di innovazione tecnologica scientifica (JST, grant n. JPMJFS2139 a T.H.) e sovvenzioni dalla Società Giapponese per la Promozione della Scienza (KAKENHI 23H00457 assegnato a N.L.F., 20J12849 a Y.Mi., 24K22254 a Y. Ma). Questo studio è stato inoltre finanziato dal Tokyo Metropolitan Government Advanced Research Grant [R2-2] per Y.Ma., N.L.F. e dal fondo strategico di ricerca TMU per un progetto di ricerca innovativo [R3] a N.L.F. Grazie a Yasuro Furuichi per i suoi consigli e commenti utili.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104
Basic fibroblast growth factorPeprotech450-33
Bovine serum albuminSigmaA9418
Butorphanol tartrateMeiji Yakuka Co., Ltd711-12Nome del prodotto: Vetorphale iniezione
Chicken Embryo ExtractUS BiologicalC3999
Collagenase type IWorthingtonM9B2717
DAPISigma-AldrichD9542
Fetal bovine serumGibco10437-028
Glucose-free DMEMGibcoA14430-01
GlutaMAXGibco10569
High-glucose DMEM+GlutaMAXGibco10569-010
Horse serumLife technology16050-130
Low-protein binding filterMilliporeSLGVR33RB
MatrigelCorning354230
Medetomidine hydrochlorideKyoritsu Seiyaku Co., Ltd8816Nome del prodotto: Dorbene Iniezione
MidazolamMaruishi Pharmaceutical Co., Ltd4987211762100Nome del prodotto: Dormicum Iniezione
Penicillin-streptomycin-amphotericin B suspensionWako161-23181
Ponceau S stain solutionSigma-Aldrich24-3875-5
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redGibco25200056
Attrezzature
Centrifuge tubes (25 mL)IWAKI2362-025
Fluorescence microscopeKeyenceBZ-X810
Pasteur pipettesIWAKI5 3/4 IK-PAS-5P
StereomicroscopeLeicaM165C
Sterilin dishes (100-mm)Thermo Scientific3020-100Riferito come piastra Petri nel manoscritto
Anticorpi per immunoetichettatura
Goat anti-mouse (H+L), Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-327231:400
Goat anti-rabbit (H+L), Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificA-110121:400
Mouse Anti-Myosin Heavy ChainR&D SystemsMAB44701:400
Mouse Anti-Pax7DSHBAB-5284281:100
Rabbit Anti-MyoDSanta Cruz Biotechnologysc-7601:100
Anticorpi per immunoblotting
HRP-conjugated Anti-mouse IgGCytivaNA9311:1000/ horseradish peroxidase
HRP-conjugated Anti-Rabbit IgGCytivaNA9341:1000/ horseradish peroxidase
Mouse Anti-MyHC ISigmaM84211:1000/ Myosin Heavy Chain I
Mouse Anti-MyHC IISigmaM42761:1000/ Myosin Heavy Chain II
Mouse Anti-PGC-1αSanta Cruz Biotechnologysc-5173801:1000/ Pparg coactivator 1 alpha
Mouse Anti-α-tubulinCell Signaling Technology#38731:1000/ Alpha tubulin
Rabbit Anti-COXIVCell Signaling Technology#48501:1000/ Cytochrome c oxidase IV
Rabbit Anti-GAPDHCell Signaling Technology#22181:10000/ Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase
Rabbit Anti-GLUT4Cell Signaling Technology#22131:1000/ Glucose Transporter 4
Rabbit Anti-β-actinProteintech20536-1-AP1:2000/ Nonmuscle Beta-actin

Riferimenti

  1. Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z. M., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18–88 yr. J Appl Physiol. 89 (1), 81-88 (2000).
  2. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol. 9 (2), 493-495 (1961).
  3. Zammit, P. S., Partridge, T. A., Yablonka-Reuveni, Z. The skeletal muscle satellite cell: The stem cell that came in from the cold. J Histochem Cytochem. 54 (11), 1177-1191 (2006).
  4. Zammit, P. S., et al. Pax7 and myogenic progression in skeletal muscle satellite cells. J Cell Sci. 119 (9), 1824-1832 (2006).
  5. Seale, P., et al. Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
  6. Günther, S., et al. Myf5-positive satellite cells contribute to Pax7-dependent long-term maintenance of adult muscle stem cells. Cell Stem Cell. 13 (5), 590-601 (2013).
  7. Gnocchi, V. F., White, R. B., Ono, Y., Ellis, J. A., Zammit, P. S. Further characterisation of the molecular signature of quiescent and activated mouse muscle satellite cells. PLoS One. 4 (4), e5205(2009).
  8. Halevy, O., et al. Pattern of Pax7 expression during myogenesis in the posthatch chicken establishes a model for satellite cell differentiation and renewal. Dev Dyn. 231 (3), 489-502 (2004).
  9. Biressi, S., Rando, T. A. Heterogeneity in the muscle satellite cell population. Semin Cell Dev Biol. 21 (8), 845-854 (2010).
  10. Zammit, P. S. All muscle satellite cells are equal, but are some more equal than others. J Cell Sci. 121 (18), 2975-2982 (2008).
  11. Ortuste Quiroga, H. P., Fujimaki, S., Ono, Y. Pax7 reporter mouse models: A pocket guide for satellite cell research. Eur J Transl Myol. 33 (4), (2023).
  12. Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiol Rev. 91 (4), 1447-1531 (2011).
  13. Pette, D., Staron, R. S. Myosin isoforms, muscle fiber types, and transitions. Microsc Res Tech. 50 (6), 500-509 (2000).
  14. Ahmetov, I. I., Vinogradova, O. L., Williams, A. G. Gene polymorphisms and fiber-type composition of human skeletal muscle. Int J Sport Nutr Exerc Metab. 22 (4), 292-303 (2012).
  15. Guth, L., Samaha, F. J. Qualitative differences between actomyosin ATPase of slow and fast mammalian muscle. Exp Neurol. 25 (1), 138-152 (1969).
  16. Aguilera-Alcala, N., Morales-Reyes, Z., Martin-Lopez, B., Moleon, M., Sanchez-Zapata, J. A. Role of scavengers in providing non-material contributions to people. Ecol Indic. 117, 11(2020).
  17. Sullivan, S. M., Pittman, R. N. Relationship between mitochondrial volume density and capillarity in hamster muscles. Am J Physiol. 252 (1), H149-H155 (1987).
  18. Fujita, N., et al. Changes in lipid metabolism and capillary density of the skeletal muscle following low-intensity exercise training in a rat model of obesity with hyperinsulinemia. PLoS One. 13 (5), e0196895(2018).
  19. Narusawa, M., et al. Slow myosin in developing rat skeletal muscle. J Cell Biol. 104 (3), 447-459 (1987).
  20. Faerman, A., Shani, M. The expression of the regulatory myosin light chain 2 gene during mouse embryogenesis. Development. 118 (3), 919-929 (1993).
  21. Denardi, C., et al. Type 2x-myosin heavy chain is coded by a muscle fiber type-specific and developmentally regulated gene. J Cell Biol. 123 (4), 823-835 (1993).
  22. Ciciliot, S., Rossi, A. C., Dyar, K. A., Blaauw, B., Schiaffino, S. Muscle type and fiber type specificity in muscle wasting. Int J Biochem Cell Biol. 45 (10), 2191-2199 (2013).
  23. Talbot, J., Maves, L. Skeletal muscle fiber type: Using insights from muscle developmental biology to dissect targets for susceptibility and resistance to muscle disease. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 5 (4), 518-534 (2016).
  24. Celegato, B., et al. Parallel protein and transcript profiles of FSHD patient muscles correlate to the D4Z4 arrangement and reveal a common impairment of slow to fast fibre differentiation and a general deregulation of MyoD-dependent genes. Proteomics. 6 (19), 5303-5321 (2006).
  25. Ganassi, M., Muntoni, F., Zammit, P. S. Defining and identifying satellite cell-opathies within muscular dystrophies and myopathies. Exp Cell Res. 411 (1), 112906(2022).
  26. Gallagher, P., et al. Effects of 84-days of bedrest and resistance training on single muscle fibre myosin heavy chain distribution in human vastus lateralis and soleus muscles. Acta Physiol Scand. 185 (1), 61-69 (2005).
  27. Grimby, G., Broberg, C., Krotkiewska, I., Krotkiewski, M. Muscle fiber composition in patients with traumatic cord lesion. Scand J Rehabil Med. 8 (1), 37-42 (1976).
  28. Shenkman, B. S. From slow to fast: Hypogravity-induced remodeling of muscle fiber myosin phenotype. Acta Naturae. 8 (4), 47-59 (2016).
  29. Ohira, T., Kawano, F., Goto, K., Ohira, Y. Responses of skeletal muscles to gravitational unloading and/or reloading. J Physiol Sci. 65 (4), 293-310 (2015).
  30. Higashino, K., et al. Early changes in muscle atrophy and muscle fiber type conversion after spinal cord transection and peripheral nerve transection in rats. J Neuroeng Rehabil. 10, 46(2013).
  31. Webster, C., Silberstein, L., Hays, A. P., Blau, H. M. Fast muscle fibers are preferentially affected in Duchenne muscular dystrophy. Cell. 52 (4), 503-513 (1988).
  32. Pedemonte, M., Sandri, C., Schiaffino, S., Minetti, C. Early decrease of IIx myosin heavy chain transcripts in Duchenne muscular dystrophy. Biochem Biophys Res Commun. 255 (2), 466-469 (1999).
  33. Rafael, J. A., et al. Dystrophin and utrophin influence fiber type composition and post-synaptic membrane structure. Hum Mol Genet. 9 (9), 1357-1367 (2000).
  34. Kotelnikova, E., et al. Novel approach to meta-analysis of microarray datasets reveals muscle remodeling-related drug targets and biomarkers in Duchenne muscular dystrophy. PLoS Comput Biol. 8 (2), e1002365(2012).
  35. Banerji, C. R. S., Zammit, P. S. Pathomechanisms and biomarkers in facioscapulohumeral muscular dystrophy: Roles of DUX4 and Pax7. EMBO Mol Med. 13 (8), e13695(2021).
  36. Lassche, S., et al. Sarcomeric dysfunction contributes to muscle weakness in facioscapulohumeral muscular dystrophy. Neurology. 80 (8), 733-737 (2013).
  37. Bischoff, R. Proliferation of muscle satellite cells on intact myofibers in culture. Dev Biol. 115 (1), 129-139 (1986).
  38. Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 31 (10), 773-779 (1995).
  39. Collins, C. A., Zammit, P. S. Isolation and grafting of single muscle fibres. Methods Mol Biol. 482, 319-330 (2009).
  40. Ravenscroft, G., et al. Dissociated flexor digitorum brevis myofiber culture system—a more mature muscle culture system. Cell Motil Cytoskeleton. 64 (10), 727-738 (2007).
  41. Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells. Methods Mol Biol. 946, 431-468 (2013).
  42. Smith, L. R., Meyer, G. A. Skeletal muscle explants: Ex-vivo models to study cellular behavior in a complex tissue environment. Connect Tissue Res. 61 (3-4), 248-261 (2020).
  43. Tarpey, M. D., et al. Characterization and utilization of the flexor digitorum brevis for assessing skeletal muscle function. Skeletal Muscle. 8 (1), 14(2018).
  44. Omairi, S., et al. Regulation of the dystrophin-associated glycoprotein complex composition by the metabolic properties of muscle fibres. Sci Rep. 9 (1), 2770(2019).
  45. Moyle, L. A., Zammit, P. S. Isolation, culture and immunostaining of skeletal muscle fibres to study myogenic progression in satellite cells. Methods Mol Biol. 1210, 63-78 (2014).
  46. Hettige, P., Tahir, U., Nishikawa, K. C., Gage, M. J. Comparative analysis of the transcriptomes of EDL, psoas, and soleus muscles from mice. BMC Genomics. 21 (1), 808(2020).
  47. Blackburn, D. M., Lazure, F., Soleimani, V. D. RNA sequencing of single myofibers from Mus musculus. Bio Protoc. 10 (4), e3525(2020).

Ristampe e permessi

Tag

Muscolo scheletricointegrit delle miofibredigestione con collagenasiisolamento delle cellule satellitemuscolo soleodissociazione muscolaredisturbi neuromuscolariimmunomarcatura
Saggio di isolamento a fibra singola per la valutazione del comportamento ossidativo delle miofibre
Contattaci
Raccomanda alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.