Un modello di coltura tridimensionale che supporta lo sviluppo in vitro dei follicoli secondari a antrali umani

Sommario

Questo studio ha stabilito un modello di coltura tridimensionale (3D) che sostiene lo sviluppo dei follicoli umani dalla fase secondaria a quella antrale in vitro. Questo sistema consente la crescita dei follicoli e la formazione di antri preservando le caratteristiche molecolari delle cellule somatiche, fornendo un modello fondamentale per la ricerca sulla follicologenesi umana.

Abstract

La follicogenesi ovarica umana è un processo complesso e strettamente regolato, difficile da studiare direttamente in vivo. Sebbene i modelli in vitro siano essenziali per la ricerca meccanicistica, i sistemi esistenti rimangono subottimali perché non possono riprodurre la dinamica spaziotemporale dello sviluppo dei follicoli. Questo studio presenta un modello di coltura 3D che supporta lo sviluppo dei follicoli umani dalla fase secondaria a quella antrale. Questo modello riproduce con successo eventi morfologici chiave in vivo , inclusa una crescita follicolare sostenuta, una fase di espansione di diametro distinto dal giorno 10 e la formazione della cavità antrale intorno al giorno 20. È importante sottolineare che questa progressione dello sviluppo è culminata nel prelievo riuscito di ovociti vitali allo stadio della vescicola germinale (GV). Inoltre, l'analisi dell'immunofluorescenza ha rivelato distinti modelli di espressione dei recettori delle gonadotropine nelle cellule somatiche, coerenti con l'identità della cellula granulosa e tecica. Le cellule interne simili alla granulosa hanno mostrato un alto recettore ormonale follicolo-stimolante (FSHR), mentre le cellule esterne simili a teca hanno mostrato un'elevata espressione del recettore ormonale luteinizzante (LHR). Questo modello offre una piattaforma preziosa per lo studio della follicogenesi umana e della tossicologia riproduttiva e fornisce un riferimento per ottimizzare i sistemi di coltura follicologica in vitro per lo sviluppo da stadio secondario a antrale.

Introduzione

Il processo fisiologico dello sviluppo dei follicoli ovaricoli, dalla fase primordiale a quella preovulatoria, è fondamentale per la fertilità^{femminile 1}. Questo processo comporta una serie altamente coordinata di eventi, tra cui la crescita/maturazione degli ovociti e la proliferazione/differenziazione delle cellule^{della granulosa 2}. Le interruzioni in questi meccanismi complessi rappresentano una delle principali cause di infertilità e disfunzione ovarica. Una comprensione dettagliata delle reti regolatorie alla base della follicologenesi—che comprendono la segnalazione paracrina, le interazioni ovociti-cellule somatiche e la dinamica della matrice extracellulare—è quindi di importanza patofisiologica critica. Tuttavia, l'indagine diretta sulla follicologenesi umana in vivo rimane vincolata da limitazioni etiche e pratiche, il che spinge alla necessità di modelli in vitro affidabili per chiarire questi meccanismi. Nonostante i progressi, rimane una grave mancanza di un modello di coltura a lungo termine che supporti lo sviluppo dei follicoli umani, in particolare dalla fase secondaria a quella antrale.

Sebbene la coltura folliccolare umana nelle matrici bidimensionali (2D) o tridimensionali (3D) abbia avanzato la comprensione dello sviluppo follicolare^{precoce 3,4}, tali sistemi restano limitati nel supportare la progressione verso stadi successivi. È importante notare che raggiungere la follicologenesi in vitro umana attraverso le fasi successive dello sviluppo rimane particolarmente difficile a causa delle dimensioni follicoli più grandi e della tempistica di maturazione^{prolungata 5}. Anche tra il numero limitato di sistemi di coltura follicologica in vitro umana che hanno prodotto con successo ovociti MII, i tassi di maturazione rimangono bassi (circa il 20% al massimo⁾6,7,8,9. Forse una sfida più fondamentale è la ripresa della transizione da secondario a antrale, una fase critica e strutturalmente complessa che deve ancora essere adeguatamente modellata in vitro.

Questo studio ha stabilito un modello di coltura 3D che supporta lo sviluppo in vitro di follicoli secondari umani in follicoli antrali con strutture cariali distinte. Questo modello fornisce una base fondamentale per ulteriori indagini sui meccanismi regolatori alla base dello sviluppo dei follicoli umani e funge da riferimento per l'ottimizzazione futura dei sistemi di coltura folliccolare che mirano allo sviluppo secondario a antrale.

Protocollo

Questo protocollo di studio è stato esaminato e approvato dal Comitato Etico del Terzo Ospedale dell'Università di Pechino (Approvazione n. M2024151). Tutti i tutori legali dei minori che partecipano allo studio hanno firmato il modulo di consenso informato.

Fonte tissutale
Il tessuto medullare ovarico umano utilizzato in questo protocollo è stato ottenuto da quattro pazienti pediatrici diagnosticati con teratoma ovarico (di 2, 6, 13 e 16 anni) che hanno donato tessuto ovarico a scopo di ricerca (Tabella 1). La corteccia ovarica è stata utilizzata per studi di crioconservazione del tessuto ovarico, mentre il tessuto midollare rimanente è stato impiegato per la coltura follicare in vitro in questo studio. Sono stati isolati in totale 33 follicoli secondari, con 16 follicoli assegnati al gruppo di controllo e 17 al gruppo di coltura 3D.

Preparazione del reagente
Il mezzo di trasporto consisteva nel mezzo L-15 di Leibovitz integrato con un integratore siero sostituto al 10% e conservato a 4 °C. La soluzione digerente completa è stata preparata integrando MEMα con 0,04 mg/mL di Liberasi DH, 10 IU/mL di DNasi I e 100 IU/mL di penicillina-streptomicina e conservata a -20 °C. La soluzione per la pausa digestione era DPBS integrata con un integratore siero sostituto al 10% e conservata a 4 °C. Il mezzo di crescita completo è stato preparato integrando MEMα con un integratore sirico sostitutivo al 10%, insulina transferrina-selenio all'1%, 50 μg/mL di acido L-ascorbico, 2 mM piruvato di sodio e 100 IU/mL di penicillina-streptomicina. Il mezzo veniva conservato a 4 °C. L'ormone follicolo-stimolante umano ricombinante (FSH) è stato aggiunto a una concentrazione finale di 100 mIU/mL all'inizio della coltura, come descritto in uno studio precedente¹⁰. Al momento della rilevazione visiva della formazione precoce dell'antro (intorno al giorno 20), l'ormone luteinizzante umano ricombinante (LH) è stato integrato a una concentrazione finale di 10 mIU/mL durante i cambi di mezzo. La matrice di coltura solida è stata preparata mescolando la matrice della membrana basale al 70% (v/v) con un mezzo di crescita completo al 30% (v/v) freddo e mantenuta in ghiaccio durante tutte le fasi di manipolazione.

Digestione tissutale e isolamento secondario dei follicoli
Il tessuto ovarico veniva inserito nel mezzo di trasporto e trasportato in laboratorio a 4 °C. In condizioni sterili, il midollo ovarico veniva dissezionato con un bisturi. Il tessuto è stato sezionato in pezzi sottili (~3 × 3 × 1 mm) e ulteriormente tritato in piccoli frammenti (~0,5 × 0,5 × 1 mm) con un tritatessuti, mantenendo il tessuto umido per tutta la durata. Il tessuto tritato è stato trasferito in un piatto da 35 mm e una soluzione digerente completa preriscaldata è stata aggiunta a 2 mL per tessuto da 100 mg. L'incubazione è stata effettuata a 37 °C per 45–80 minuti (media: 60 ± 15 minuti), con miscelazione delicata ogni 10 minuti. La digestione è stata interrotta quando l'esame microscopico ha rivelato l'allentamento della matrice stromale e il rilascio di singoli follicoli (Figura 1). I follicoli secondari sani (diametro 100–200 μm, con ≥ 2 strati cellulari di granulosa e un ovocita visibile) sono stati selezionati sotto stereomicroscopio utilizzando una pipetta di vetro a controllo della bocca (diametro interno 200 μm) e lavati due volte con un mezzo di crescita completo preriscaldato.

Incorporazione 3D e cultura a lungo termine
Un inserto per coltura cellulare veniva posto in una piastra da 35 mm umidita con 2 mL di mezzo di crescita completo e pre-bilanciata in un incubatore (37 °C, 5% CO₂) per 2 ore. Alcuni follicoli secondari selezionati sono stati trasferiti nell'inserto e pre-colti durante la notte nelle stesse condizioni. Al termine della pre-coltura, i follicoli del gruppo di controllo sono stati coltivati direttamente all'interno dell'inserto (coltura 2D). Al contrario, i follicoli designati per il gruppo coltura 3D sono stati preparati per l'inserimento in una matrice di membrana basale ridotta da fattore di crescita (proteina totale 8~12 mg/mL). La matrice veniva scongelata sul ghiaccio e mescolata con un mezzo di crescita completo al 30% (v/v) di freddo gelo. Goccioline di 40 μL della miscela venivano inserite in una piastra da 35 mm (massimo sei gocce per piatto), per formare uno strato di gel uniforme di circa 1,5 mm di altezza. Successivamente, un singolo follicolo secondario veniva trasferito in ogni goccia utilizzando una pipetta di vetro a controllo della bocca, posizionata con cura nel terzo centrale e superiore della goccia per impedirne l'affondamento. Il piatto è stato posto in un incubatore (37 °C, 5% CO₂) per 30 minuti per permettere la gelificazione. Dopo la solidificazione, 2 mL di substrato di crescita completo sono stati aggiunti delicatamente al piatto per avviare la coltura a lungo termine.

Mantenimento e monitoraggio della cultura
Ogni 48 ore veniva eseguito un cambiamento del 50% del mezzo con un mezzo di crescita fresco completo (contenente FSH). I follicoli venivano osservati quotidianamente al microscopio stereoscopico e i loro diametri e caratteristiche morfologiche venivano registrati. Alla rilevazione visiva della formazione precoce di antro (intorno al giorno 20), durante i cambiamenti successivi è stato aggiunto LH umano ricombinante al mezzo. La coltura veniva mantenuta fino a 30 giorni o fino a quando i follicoli raggiungevano lo stadio antrale (diametro > 400 μm con una cavità chiaramente definita e piena di liquido).

Dissociazione cellulare post-coltura
Al termine della coltura, i follicoli antrali sono stati trasferiti in una piastra contenente DPBS fresco e dissociati meccanicamente utilizzando una siringa sterile calibro 29. I complessi cumulo-ovocita isolati (COC) sono stati trasferiti in un piatto separato per ulteriori analisi. La restante sospensione di granulosa e cellule tecane è stata trasferita in una nuova piastra da 35 mm contenente 2 mL di mezzo di crescita completo preriscaldato, leggermente roteata per una distribuzione uniforme e incubata per 48 ore (37 °C, 5% CO₂).

Analisi dell'immunofluorescenza
Dopo la coltura, le cellule sono state fissate con paraformaldeide al 4% per 30 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, i campioni sono stati lavati tre volte con PBS, permeabilizzati con 0,5% di Triton X-100 per 20 minuti, e poi bloccati durante la notte a 4 °C usando l'1% di BSA in PBS. Le cellule sono state incubate durante la notte a 4 °C con anticorpi primari. Gli anticorpi principali utilizzati erano anti-FSHR (coniglio, 1:200) e anti-LHR (topo, 1:100). Dopo l'incubazione, le cellule sono state lavate tre volte per 15 minuti ciascuna con PBS contenente l'1% di BSA. Successivamente, sono stati incubati con anticorpi secondari fluorescenti (anti-coniglio e anti-topo, 1:200) per 2 ore a temperatura ambiente al buio. Infine, le celle hanno subito tre lavaggi finali, ciascuno della durata di 20 minuti. I nuclei sono stati colorati con DAPI per 5 minuti a temperatura ambiente. Successivamente i campioni sono stati lavati tre volte per 5 minuti con PBS contenente l'1% di BSA. L'imaging veniva eseguito utilizzando un sistema di imaging ad alto contenuto Operetta CLS in modalità confocale. I segnali di fluorescenza sono stati catturati utilizzando i seguenti canali: DAPI (405 nm), Alexa Fluor 488 (LHR) e Alexa Fluor 647 (FSHR), con impostazioni di esposizione coerenti su tutti i campioni.

Analisi statistica
Sono stati effettuati confronti del diametro dei follicoli tra il gruppo di controllo e il gruppo coltura 3D nei giorni 5, 10 e 15 utilizzando un test t a campioni indipendenti. Un valore p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo. L'analisi statistica del diametro dei follicoli non è stata condotta oltre il giorno 15, poiché quasi tutti i follicoli del gruppo di controllo non sono sopravvissuti dopo il giorno 15. Ciò ha portato a una dimensione del campione inadeguata, impedendo così confronti di gruppo affidabili e significativi. Tutte le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando GraphPad Prism (versione 9.0).

Risultati

Sviluppo di un modello di coltura 3D che supporta la crescita follicoleare umana fino allo stadio antrale
Una delle principali sfide nella ricerca sui follicoli ovarici è sviluppare un sistema di coltura in vitro che supporti lo sviluppo completo dei follicoli, con la formazione della cavità antrale come tappa chiave. Pertanto, questo studio ha stabilito un modello di coltura 3D per follicoli umani in vitro (Figura 2

Discussione

Il mantenimento riuscito dei follicoli ovarici umani in vitro attraverso la transizione da secondario a antrale rappresenta un significativo progresso tecnico. In questo studio, un sistema di coltura 3D che fornisce un adeguato supporto biofisico e segnali ormonali specifici per stadio ha permesso questa progressione. Questi risultati sono in linea con le evidenze recenti che sottolineano la necessità di sistemi di coltura 3D per ricapitolare la fisiologia tissutale. Sebbene i m...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Anti-FSHR	HuaBio	ER1909-08
Anti-LHR	Santa Cruz	sc-293165
Anti-mouse(secondario)	Abcam	AB150113
Anti-rabbit(secondario)	Abcam	AB205718
Basement membrane matrix per coltura organoide	MCE	K6004
BSA	Sigma	A1933
Inserto per coltura cellulare	Millipore	PICMORG50
Piadina di coltura	Corning	430165
DAPI	Beyotime	C1006
DNase I	Thermo	EN0525
DPBS	Gibco	14190144
FSH	Merck	F4021
Incubatrice	Thermo	Heracell 3111
Insulin-Transferrin-Selenium	Gibco	41400045
Acido L-Ascorbico	MCE	HY-B0166
Leibovitz's L-15 medium	Gibco	11415064
LH	Merck	L6420
Liberase DH	Roche	5401054001
McIlwain Tissue chopper	Mickle Laboratory Engineering Co. Ltd.	MP10180-220
MEMα	Gibco	41061029
Paraformaldeide	Solarbio	P1110
PBS	Gibco	10010023
Penicillina-Streptomicina	Gibco	15140122
Sostituto del siero supplemento	FUJiFILM Irvine	90194
Sodium pyruvate	Gibco	11360070
Stereomicroscopio	Nikon	SMZ1270
Il sistema di imaging ad alto contenuto	PerkinElmer	Operetta CLS
Triton X-100	Sigma	X100