Modulazione farmacologica dell'asse di stress endoplasmatico del reticolo ALDH2-SIRT1 nella degenerazione retinica indotta da MNU nei topi C57BL/6: uno studio in vivo

Sommario

Lo studio prevedeva la somministrazione di metil-nitrosora a topi C57BL/6 per indurre danni retinici, seguita dal trattamento con attivatori e inibitori ALDH2 insieme a SIRT1 e modulatori di stress endoplasmatico del reticolo (ERS). Il protocollo mirava a indagare gli effetti protettivi di questi trattamenti sulla degenerazione retinica e la loro influenza sul metabolismo degli aldeidi.

Abstract

Questo studio ha indagato gli effetti protettivi dell'attivazione dell'aldeide deidrogenasi 2 (ALDH2) (tramite Alda-1), dell'inibizione di ALDH2 (tramite Daidzin) e della modulazione della sirtuina 1 (SIRT1) e dello stress del reticolo endoplasmatico (ERS) sul danno retinico indotto dalla metil-nitrosourea (MNU) nei topi C57BL/6. Settantadue topi sono stati assegnati casualmente in otto gruppi, inclusi un gruppo di controllo, un gruppo con solo MNU e vari gruppi combinati di trattamento. I topi sono stati somministrati con iniezioni intraperitoneali di agonisti e inibitori rivolti rispettivamente all'asse ALDH2-SIRT1-ERS. Il peso corporeo, lo spessore dello strato retinico e i biomarcatori del metabolismo delle aldeidi sono stati valutati al secondo e quarto giorno dopo il trattamento. La somministrazione di MNU ha indotto una degenerazione retinica, con conseguente perdita di peso corporea significativa in tutti i gruppi tranne che nel gruppo di controllo. Il trattamento con Alda-1 attenuava i danni retinici, mentre Daidzin li aggravava. L'inibizione farmacologica di SIRT1 (tramite EX-527) ha ridotto gli effetti protettivi di Alda-1, e l'induzione da ERS (tramite TUN) ha quasi abolito i suoi benefici. Al contrario, l'attivazione di SIRT1 (tramite SRT1720) mitigò gli effetti avversi di Daidzin, mentre l'inibizione ERS (tramite 4-PBA) attenuò parzialmente l'impatto di Daidzin. Inoltre, la MNU ha aumentato i livelli di marcatori del metabolismo dell'aldeide (malondialdeide [MDA] e 4-idrossi-2-nonenale [4-HNE]), con Alda-1 che riduce e Daidzin che eleva questi livelli. Inoltre, la modulazione farmacologica delle vie SIRT1/ERS intervenne negli effetti regolatori di Alda-1 e Daidzin sul metabolismo delle aldeide. Nel complesso, l'attivazione di ALDH2 ha protetto la struttura retinica e regolato il metabolismo degli aldeidi, evidenziando il ruolo critico dell'asse di segnalazione ALDH2-SIRT1/ERS nella mitigazione della degenerazione retinica.

Introduzione

La degenerazione retinica, una delle principali cause di cecità a livello mondiale, include condizioni come la retinite pigmentare (RP), la degenerazione maculare legata all'età (AMD) e la retinopatia diabetica (DR), che collettivamente colpiscono milioni di persone e impongono ingenti oneri ^{socioeconomici 1,2,3}. Tuttavia, attualmente mancano terapie farmacologiche altamente efficaci per fermare la progressione di queste malattie retiniche accecanti nella pratica clinica. La patogenesi della degenerazione retinica è multifattoriale, coinvolgendo stress ossidativo, infiammazione cronica e stress del reticolo endoplasmatico (ERS), che compromette l'omeostasi delle cellule retiniche. Questi fattori di stress sono spesso innescati da una disregolazione metabolica interna (ad esempio, disfunzione mitocondriale), portando infine ad apoptosi e danni retinici^{irreversibili 4}. La metil-nitrosourea (MNU), un potente agente alchilante del DNA, è emersa come un induttore chimico ampiamente utilizzato per modellare la degenerazione^{retinica 5}. Il modello della malattia retinica indotta dalla MNU rappresenta uno strumento prezioso per indagare i meccanismi della malattia e valutare potenziali interventi terapeutici. Meccanicamente, la MNU induce stress ossidativo generando specie reattive di ossigeno (ROS) e alterando l'equilibrio redox, danneggiando così membrane fotorecettrici e organelli. Questo potrebbe anche influenzare il metabolismo degli aldeide, compromettendo la disintossicazione della perossidazione lipidica. L'accumulo successivo di aldeidi tossici potrebbe aggravare il danno ossidativo, amplificando l'apoptosi dei^{fotorecettori 6}.

L'aldeide deidrogenasi 2 (ALDH2), un enzima mitocondriale dipendente da ^NAD+, svolge un ruolo fondamentale nella disintossicazione di aldeidi tossiche come la 4-idrossi-2-nonenale (4-HNE) e la malondialdeide (MDA) convertendoli in acidi carbossilici meno reattivi, prevenendo così danni^{ossidanti 7}. Un'attività robusta di ALDH2 è cruciale per mantenere l'omeostasi redox, e la funzione compromessa di ALDH2 è stata collegata a un invecchiamento accelerato e a patologie^{neurodegenerative 8}. L'attivazione farmacologica di ALDH2, in particolare tramite l'agonista a piccole molecole Alda-1, ha dimostrato di esercitare effetti citoprotettivi in vari^{modelli 9,10}. La Sirtuina 1 (SIRT1), una deacetilasi dinucleotide di adenina dinucleotide + (NAD+)dipendente dalla nicotinamide, regola le risposte allo stress e il metabolismo energetico modulando fattori di trascrizione, inclusi p53 e il fattore nucleare kappa B (NF-κB⁾¹¹. L'attivazione di SIRT1 ha mostrato potenzialità nel promuovere la funzione mitocondriale e la sopravvivenza cellulare, con studi che collegano la sua regolazione al rialzo a una riduzione del danno ossidativo e dell'infiammazione nella degenerazione^{retinica 12}. Lo stress del reticolo endoplasmatico (ERS), innescato dall'accumulo di proteine mal ripiegate, attiva la risposta proteica non ripiegata (UPR), che può diventare una cascata pro-apoptotica sotto stress cronico. L'ERS è stata implicata nella degenerazione retinica, contribuendo all'apoptosi dei^{fotorecettori 13}. Nonostante questi risultati, l'interazione specifica tra ALDH2, SIRT1 ed ERS nel contesto del modello di degenerazione retinica indotta da MNU rimane poco compresa. Inoltre, i ruoli coordinati di questi percorsi interconnessi richiedono ulteriori indagini sistematiche.

Pertanto, lo studio attuale mira a indagare gli effetti di componenti chiave dell'asse ALDH2-SIRT1-ERS—ALDH2 (tramite Alda-1 o Daidzin), SIRT1 (tramite SRT1720 o EX527) e ERS (tramite 4-PBA o TUN)—sul danno retinico indotto da MNU nei topi C57BL/6. Utilizzando analisi istopatologiche e biochimiche, abbiamo esaminato come il targeting di questo asse influenzasse la sopravvivenza dei fotorecettori e il metabolismo degli aldeidi. Abbiamo ipotizzato che l'attivazione coordinata di ALDH2, il potenziamento di SIRT1 e la soppressione della ERS mitigassero sinergicamente la degenerazione retinica indotta da MNU, fornendo così una giustificazione per colpire questo asse nelle malattie degenerative retiniche.

Protocollo

Dichiarazione etica
Tutti i protocolli sperimentali sono stati esaminati e approvati dal Comitato per la Cura e l'Uso Sperimentale degli Animali del Fuzong Clinical Medical College della Fujian Medical University e condotti in rigorosa conformità con la Dichiarazione dell'Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research.

Animali e assegnazione dei gruppi
Un totale di 72 maschi C57BL/6 topi (8–10 settimane, peso corporeo 20–25 g) sono stati ottenuti dal fornitore certificato, in conformità agli standard nazionali per l'allevamento di animali da laboratorio. I topi venivano ospitati in gabbie ventilate individualmente in condizioni ambientali standardizzate, inclusi un ciclo luce/buio di 12 ore, temperatura controllata (22 ± 2 °C) e umidità relativa (50% ± 10%), con accesso ad libitum a cibo e acqua. Per indagare gli effetti modulatori delle vie ALDH2, SIRT1 ed ERS sul danno retinico indotto dalla MNU, i topi sono stati distribuiti casualmente in otto gruppi sperimentali (n = 9 per gruppo; n = 5 per il secondo giorno; n = 4 per il quarto giorno) utilizzando una sequenza di randomizzazione generata al computer per minimizzare il bias di selezione. L'abstract grafico dello studio è stato mostrato nella Figura 1.

Preparazione e regimi di trattamento dei reagenti
I reagenti sperimentali utilizzati in questo studio sono elencati nella Tabella dei Materiali, con informazioni dettagliate sulla preparazione e sul dosaggio come segue. (1) MNU (50 mg/kg): 100 mg di MNU sono stati disciolti in 2 mL di soluzione salina normale per preparare una soluzione da 50 mg/mL. Successivamente, 1,4 mL di questa soluzione è stato diluito con 5,6 mL di soluzione fisiologica normale fino a una concentrazione finale di 10 mg/mL per la somministrazione animale. (2) Alda-1 (10 mg/kg): 50 mg di polvere di Alda-1 sono stati disciolti in 1 mL di dimetilsolfosido (DMSO) per preparare una soluzione da 50 mg/mL, diluita con 24 mL di soluzione salina normale fino a una concentrazione finale di 2 mg/mL. (3) Daidzin (10 mg/kg): 50 mg di polvere di Daidzin sono stati disciolti in 1 mL di DMSO per preparare una soluzione da 50 mg/mL, poi diluita con 24 mL di soluzione salina normale fino a una concentrazione finale di 2 mg/mL. (4) EX-527 (10 mg/kg): 5 mg di polvere di EX-527 sono stati disciolti in 0,1 mL di DMSO per preparare una soluzione da 50 mg/mL, diluita con 2,4 mL di soluzione salina normale fino a una concentrazione finale di 2 mg/mL. (5) SRT1720 (10 mg/kg): 5 mg di polvere di SRT1720 sono stati disciolti in 0,1 mL di DMSO e ben mescolati. Successivamente, sono stati aggiunti 400 μL di PEG300, 50 μL di Tween-80 e 450 μL di soluzione salina normale per preparare una soluzione di lavoro di 2 mg/mL. (6) TUN (10 mg/kg): 5 mg di polvere di TUN sono stati disciolti in 0,1 mL di DMSO per preparare una soluzione da 50 mg/mL, poi diluita con 2,4 mL di soluzione salina normale fino a una concentrazione finale di 2 mg/mL. (7) 4-Fenilbutirato (4-PBA; 10 mg/kg): 2 mg di polvere di 4-PBA sono stati disciolti in 1 mL di soluzione salina normale per preparare una soluzione da 2 mg/mL. Tutti i volumi di somministrazione sopra indicati erano di 5 × M millilitri (dove M = peso corporeo animale in kg). Successivamente, i topi sono stati divisi in otto gruppi con i seguenti protocolli di trattamento:

Gruppo di controllo: Un'unica iniezione intraperitoneale di soluzione fisiologica normale.
Gruppo MNU: Un'iniezione intraperitoneale singola di MNU.
Gruppo MNU + Alda-1: iniezione intraperitoneale di Alda-1, seguita da una somministrazione di MNU 2 ore dopo. Alda-1 veniva poi somministrato intraperitonealmente una volta al giorno.
Gruppo MNU + Daidzin: iniezione intraperitoneale di Daidzin, seguita da un'iniezione singola di MNU somministrata 2 ore dopo. Il Daidzin veniva quindi somministrato intraperitonealmente una volta al giorno.
Gruppo MNU + Alda-1 + EX-527: iniezione intraperitoneale di Alda-1, seguita da iniezione di EX-527 un'ora dopo e iniezione di MNU un'ora dopo (somministrazione singola). Alda-1 veniva poi somministrato intraperitonealmente una volta al giorno.
MNU + Alda-1 + gruppo TUN: iniezione intraperitoneale di Alda-1, seguita da iniezione TUN un'ora dopo e iniezione MNU un'ora dopo. Alda-1 veniva poi somministrato intraperitonealmente una volta al giorno.
MNU + Daidzin + gruppo SRT1720: iniezione intraperitoneale di Daidzin, seguita da SRT1720 iniezione un'ora dopo e iniezione MNU un'ora dopo. Il Daidzin veniva quindi somministrato intraperitonealmente una volta al giorno.
Gruppo MNU + Daidzin + 4-PBA: iniezione intraperitoneale di Daidzin, seguita da iniezione 4-PBA un'ora dopo e iniezione MNU un'ora dopo. Il Daidzin veniva quindi somministrato intraperitonealmente una volta al giorno.

Monitoraggio del peso corporeo
La tossicità sistemica e gli effetti fisiologici correlati al trattamento sono stati monitorati registrando il peso corporeo di ciascun topo ogni giorno per quattro giorni consecutivi dopo la somministrazione di MNU. I pesi sono stati misurati utilizzando una bilancia digitale di precisione con una precisione di ±0,1 g, e i dati sono stati documentati per monitorare le tendenze nella perdita o nell'aumento di peso tra i gruppi, che fungevano da indicatori indiretti della tolleranza al trattamento e dello stress sistemico.

Esame di istopatologia retinica
Nei momenti del secondo e quarto giorno dopo l'esperimento, i topi sono stati soppressi da lussazione cervicale dopo anestesia con iniezione intraperitoneale (i.p.) di pentobarbital sodio a una dose di 50–60 mg/kg di peso corporeo, rispettando rigorosamente le linee guida istituzionali sull'eutanasia. Gli occhi, in particolare quello sinistro, sono stati immediatamente enucleati. Prima dell'enucleazione, è stata effettuata una piccola incisione nel limbo nasale per segnare l'orientamento. I globi sono poi stati immersi nel 4% di paraformaldeide (PFA) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, pH 7,4) per 24 ore a 4 °C per la fissazione. Gli occhi fissi sono stati poi disidratati tramite una serie di etanolo gradato (70%, 80%, 95% e 100%), eliminati nello xilene e incorporati in blocchi di paraffina per l'elaborazione istologica. Durante l'immersione, l'orientamento veniva standardizzato posizionando il lato nasale marcato verso il basso.

Le sezioni seriali (spesse 5 μm) sono state preparate utilizzando un microtomo rotativo attraverso la testa del nervo ottico (ONH) per garantire un campionamento rappresentativo della regione retinica centrale. In particolare, le sezioni sono state tagliate dall'aspetto superiore verso il punto nasale segnato, assicurando che tutte le sezioni passassero attraverso l'ONH. Le sezioni venivano poi montate su vetrine in vetro caricate positivamente. La colorazione di ematossilina ed eosina (HE) è stata eseguita secondo protocolli standard. La morfologia retinica è stata valutata tramite microscopia ottica a un ingrandimento del 400×. Le misurazioni sono state effettuate sistematicamente dalla retina temporale a distanze predeterminate dall'ONH: 200, 400, 600, 800, 1000 e 1200 μm. In ogni posizione sono stati misurati lo spessore totale della retina, la lunghezza dei segmenti interni ed esterni (IS/OS), lo spessore dello strato nucleare esterno (ONL), lo spessore dello strato plexiforme esterno (OPL) e lo strato nucleare interno (INL).

Per garantire l'obiettività e minimizzare il bias di misura, è stato implementato un rigoroso protocollo di controllo qualità. In particolare, ciascuno degli otto gruppi sperimentali è stato suddiviso in cinque o quattro sottogruppi (ad esempio, sottogruppi 1, 2, 3, 4, 5). Cinque o quattro osservatori indipendenti, accechi alle assegnazioni di gruppo, sono stati assegnati a misurare lo stesso sottogruppo corrispondente in tutti i gruppi sperimentali (ad esempio, l'Osservatore A ha sempre misurato il Sottogruppo 1 da ogni gruppo). Ad ogni punto di misura, venivano effettuate tre letture entro un intervallo di ~5 μm (ad esempio, a 200 μm, 195 μm e 205 μm) e fatte una media per minimizzare l'errore tecnico. Le misurazioni quantitative sono state effettuate utilizzando il software ImageJ (versione 1.54g) e il valore medio dello spessore per ogni punto è stato calcolato per garantire la riproducibilità.

Marcatori del metabolismo degli aldeidi
Per valutare lo stress ossidativo e il metabolismo delle aldeide, sono stati analizzati campioni sierici per i livelli di MDA e 4-HNE, che sono biomarcatori chiave della perossidazione lipidica e dello stress aldeideico. In particolare, tutti i topi sono stati anestetizzati tramite iniezione intraperitoneale (i.p.) di pentobarbital sodio a una dose di 50–60 mg/kg di peso corporeo. Dopo che i topi sono stati profondamente anestetizzati, è stata eseguita l'eutanasia tramite lussazione cervicale. Immediatamente dopo l'eutanasia, i bulbi oculari venivano enucleati e il sangue retrobulbare veniva rapidamente raccolto. I campioni sono stati lasciati coagulare a temperatura ambiente per 30 minuti, seguiti da centrifugazione a 3.000 × g per 10 minuti. La frazione sierica veniva accuratamente trasferita in tubi microcentrifughe privi di enzimi e conservata a -80 °C fino a un'analisi successiva. I livelli di MDA sierici sono stati misurati utilizzando kit di immunosorbimento enzimatico (ELISA) disponibili in commercio seguendo i protocolli del produttore. In breve, sono stati aggiunti standard e campioni alle micropiastre pre-rivestite, incubati con specifici anticorpi primari, lavati per rimuovere materiali non legati e reagiti con anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rapano picante (HRP). È stato poi aggiunto substrato di tetrametilbenzidina (TMB) e la reazione è stata terminata con acido solforico. I valori di densità ottica (OD) sono stati letti a 450 nm tramite un lettore di microplacche, e le concentrazioni di MDA/4-HNE sono state determinate confrontando i valori OD con curve standard generate utilizzando concentrazioni note degli analites.

Analisi statistica
Tutti i dati sono stati presentati come media ± errore standard (SE). Data la piccola dimensione del campione (n = 5 per il gruppo del secondo giorno; n = 4 per il gruppo del quarto giorno), sono stati impiegati i metodi statistici del test Bootstrap. In particolare, il metodo di ricampionamento Bootstrap (1.000 iterazioni con sostituzione) è stato utilizzato per stimare intervalli di confidenza (IC) del 95% per le medie dei gruppi e per confrontare le differenze tra i gruppi. Per ogni esito (ad esempio, peso, spessore retinico, livelli di MDA/4-HNE), sono stati prelevati campioni Bootstrap dal dataset originale e la media è stata calcolata per ogni nuovo campionamento. L'IC del 95% è stato derivato dal 2,5^° e 97,5^° percentile della distribuzione bootstrap. La rilevanza è stata valutata indirettamente attraverso il seguente approccio, esaminando l'intervallo di confidenza. Se l'IC dei risultati di Bootstrap non includeva zero, ciò indicava tipicamente che la differenza era significativa (assumendo un confronto delle medie tra due o più gruppi). Le figure venivano generate utilizzando il software Graphpad (versione 5.01).

Risultati

Variazioni del peso corporeo
Prima dell'esperimento, non c'erano differenze significative nel peso corporeo tra i gruppi. Il secondo giorno dopo l'esperimento, ad eccezione del gruppo di controllo, che mostrò un aumento del peso corporeo da 17,0 ± 0,5 g a 17,4 ± 0,4 g, il peso corporeo dei topi in tutti gli altri gruppi diminuì significativamente. In particolare, il gruppo MNU è diminuito da 17,4 ± 0,3 g a 16,2 ± 0,2 g, il gruppo MNU + Alda-1 da 17,3 ± 0,3 g a 16,7 ± ...

Discussione

Studi precedenti suggerivano che gli agonisti di ALDH2 potrebbero offrire effetti protettivi contro la degenerazione^{retinica indotta da MNU.} Tuttavia, gli effetti di intervento del suo inibitore, insieme a potenziali vie a valle come SIRT1 ed ERS, non erano stati esplorati in dettaglio. Sono stati condotti studi che indicano il coinvolgimento di SIRT1 ed ERS in modelli di degenerazione retinica, inclusa la degenerazione retinica indotta dalla luce e topi geneticam...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
4HNE Kit	Elabscience,China	E-EL-0128	Per la misurazione dei livelli di 4HNE nel siero
4-Fenilbutirrico acido (4-PBA)	MCE, US	HY-A0281	Reagente per l'inibizione dell'ERS
Alda-1	MCE, US	HY-18936	ALDH2 attivo per la ricerca
Daidzina	MCE, US	HY-N0018	Inibitore ALDH2 per la ricerca
Fluoresceina sodica	Guangzhou	N/A	Usata per l'acquisizione tramite un sistema di angiografia alla fluoresceina. Le immagini angiografiche sono state analizzate per la presenza di perdite, aree non perfusi o cambiamenti nella morfologia dei vasi retiniani.
Software ImageJ	National Institutes of Health, USA	Versione 1.53t
Kit MDA	Beyotime, China	S0131S	Per la misurazione dei livelli di MDA nel siero
N-Nitroso-N-metilurea (MNU)	MCE, US	HY-34758	Agente alchilante del DNA per indurre la degenerazione retinica
Paraformaldeide	Sigma-Aldrich, US	30525-89-4	Usata per le sezioni di tessuto retinico
Bilancia digitale di precisione	Bilancia elettronica, China	SF-400	CAPACITÀ: 5000 g ± 1 g/177ozX0.10z, usata per la registrazione del peso corporeo di ciascun topo
Prism	GraphPad	Versione 5.01	Software di analisi statistica
Microtomo rotatorio	LEICA, Germania	RM2016	Usato per la preparazione di sezioni retiniche
Selisistat (EX-527)	MCE, US	HY-15452	Inibitore SIRT1 per la ricerca
Pentobarbital sodico	Sigma-Aldrich, US	1.93248	Usato per l'anestesia per ulteriori ricerche tramite iniezione intraperitoneale (IP)
SRT1720	MCE, US	HY-10532	Attivatore SIRT1 per la ricerca
Sumianxin	Jilin Shengda Animal Pharmaceutical Co	N/A	Usata per l'anestesia per ulteriori ricerche tramite iniezione intraperitoneale (IP)
Tunicamycina (TUN)	MCE, US	HY-A0098	Reagente per l'induzione dell'ERS