Articolo di revisione

Organoidi cerebrali come piattaforme emergenti per la modellazione delle infezioni del SNC: neuropatogenesi, scoperta terapeutica e somministrazione di farmaci

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DOI:

10.3791/70757

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7 agosto 2026

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1Laboratory of Molecular Virology, George Mason University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questa revisione esamina gli organoidi cerebrali come piattaforme per modellare alcune infezioni virali neurotrope selezionate e ne evidenzia le applicazioni nella patogenesi virale, nella scoperta di antivirali, nelle risposte immunitarie innate e nella somministrazione di farmaci mirata al sistema nervoso centrale (SNC).

Abstract

I virus neurotropi rimangono una sfida sanitaria globale persistente e i meccanismi con cui danneggiano il cervello umano non sono ancora pienamente compresi. I modelli animali sono spesso limitati da aspetti specifici della biologia del SNC per l'uomo, mentre le colture cellulari bidimensionali (2D) non possono riprodurre le complesse interazioni cellulari tridimensionali (3D) che avvengono durante l'infezione virale del cervello. Nell'ultimo decennio, organoidi cerebrali derivati da cellule staminali umane sono emersi come modelli fisiologicamente rilevanti che affrontano queste limitazioni. Queste colture 3D si auto-assemblano in strutture contenenti neuroni, astrociti e cellule progenitrici disposte in schemi che ricordano lo sviluppo cerebrale precoce. Questa revisione esamina l'applicazione degli organoidi cerebrali nello studio delle infezioni causate dal virus Zika (ZIKV), dal coronavirus 2 della sindrome respiratoria acuta grave (SARS-CoV-2), dal virus dell'herpes simplex (HSV) e dal virus dell'immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1). Gli studi sono stati selezionati da PubMed e selezionati in base alla loro rilevanza per la modellazione delle infezioni organoidi basate su SNC, lo screening antivirale, la somministrazione di farmaci mirati al sistema nervoso centrale e la neuroinfiammazione. Lo screening antivirale a base di organoidi ha identificato composti promettenti provenienti da biblioteche contenenti più di 1.000 candidati. Vengono inoltre discusse le strategie di somministrazione dei farmaci, con particolare attenzione a nanoparticelle, portatori a base di polimeri e vescicole extracellulari (EV) valutate in modelli organoidi e sferoidi per la loro capacità di attraversare la barriera emato-encefalica (BBB) e consegnare carichi terapeutici alle cellule neurali. Vengono inoltre esaminati i ruoli dei pattern molecolari associati al danno e ai patogeni (DAMPs e PAMP) nella neuroinfiammazione, nell'evasione del complemento e nei danni cronici post-infezione, incluso il long COVID. Vengono discusse le limitazioni attuali, tra cui la mancanza di vascolarizzazione funzionale, componenti incompleti del BBB e le difficoltà di riproducibilità. Nonostante queste limitazioni, gli organoidi del SNC colmano il divario tra la ricerca di base e l'applicazione clinica, promuovendo lo sviluppo di terapie efficaci per le infezioni virali del cervello.

Introduzione

Il sistema nervoso centrale (SNC) è un sistema complesso che comprende distinte regioni funzionali del cervello e del midollo spinale. Gli organoidi del SNC, spesso chiamati "mini-cervelli", sono strutture multicellulari tridimensionali (3D) che imitano il cervello umano in via di sviluppo. Sono principalmente generati da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC), che possono auto-assemblarsi in tessuti che rappresentano diverse regioni cerebrali. Questi mini-cervelli riproducono i modelli epigenetici, la struttura e i marcatori trascrizionali del cervello invia di sviluppo 1,2,3.

La generazione di organoidi cerebrali utilizzando cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) derivate dal paziente è stata sviluppata per la prima volta nel 2013. Prima di questa scoperta, l'accesso al tessuto cerebrale umano era limitato a causa delle questioni etiche associate alla conduzione di studi sperimentali, in particolare quelli che coinvolgevano tessuto cerebrale fetale o in utero 2. Lo sviluppo degli organoidi cerebrali ha dimostrato la capacità di imitare lo sviluppo neuronaturale umano, inclusa la formazione di regioni cerebrali distinte come la corteccia cerebrale. Lancaster et al. hanno fornito la prima prova sperimentale che le cellule staminali possono formare strutture neurali complesse in vitro, offrendo un modello che riflette con maggiore precisione la fisiologia umana rispetto alle colture cellulari bidimensionali (2D)convenzionali 5. È importante sottolineare che alcune condizioni neuroevolutive umane, come la microcefalia, si sono rivelate difficili da replicare nei modelli di roditori, sottolineando ulteriormente la necessità di sistemi derivati dall'uomo6.

Gli organoidi del SNC contengono molteplici tipi cellulari che differenziano e formano strutture multilivello simili al cervelloin via di sviluppo 7, rendendoli particolarmente adatti a studi ad alto rendimento su neurogenesi, migrazione neuronale e anomalie dellosviluppo 8. La generazione degli organoidi del SNC inizia con cellule staminali pluripotenti (PSC), che includono iPSC e cellule staminali embrionali. Le cellule staminali embrionali sono esposte a fattori di crescita e inibitori della segnalazione per promuovere la differenziazione nelle cellule neurali e imitare lo sviluppo embrionaleprecoce 2. Una volta che le cellule iniziano ad aggregarsi, si auto-organizzano all'interno di un ambiente 3D e spesso sono incorporate in una matrice extracellulare per garantire stabilità strutturale. Gli organoidi vengono quindi tipicamente mantenuti in condizioni di coltura dinamica, come bioreattori rotanti o scuotere orbitali, per migliorare la fornitura di nutrienti e ossigeno e sostenere la crescitacontinua 9. Organoidi specifici per regione del prosencefalo, mesencefalo e retroencefalo possono essere generati utilizzando protocolli guidati in bioreattori rotanti miniaturizzati, con regioni cerebrali distinte che emergono tipicamente nel corso di diverse settimane fino aimesi 9, 10 e 11. Gli organoidi del SNC catturano molte caratteristiche strutturali chiave del cervello umano in sviluppo, incluse le regioni ventricolari contenenti chile radiali che supportano i neuroni migratori e progenitori intermedi che amplificano le popolazionineuronali 12. I primi neuroni formano strati simili a quelli corticali con reti sinaptiche emergenti. Sebbene gli organoidi non replichino completamente la dimensione o l'organizzazione del cervello maturo, sono più rilevanti dal punto di vista fisiologico rispetto alle tradizionali colture monostrato.

Un grande vantaggio degli organoidi del SNC è la loro capacità di modellare il tempismo dello sviluppo. Le colture progrediscono da settimane a mesi e parallelamente lo sviluppo cerebrale fetale umano. Questo permette ai ricercatori di osservare processi neurologici come la neurogenesi, l'estensione degli assoni e la formazione precoce dei circuiti neurali in tempo reale. Gli organoidi possono anche essere programmati per includere microglie, cellule simili a vasi sanguigni o persino componenti della barriera emato-encefalica (BBB), come astrociti, cellule endoteliali e periciti. Questi organoidi possono supportare studi sulle risposte immunitarie e sul trasporto di sostanze13. Inoltre, gli organoidi possono essere combinati per creare assembloidi, che sono sistemi auto-organizzanti che modellano la comunicazione tra diverse regionicerebrali 14. Con queste capacità, gli organoidi del SNC offrono un modo diretto per indagare come i virus neurotropi invadano, si replichino e danneggino il cervello, domande che da tempo sono difficili da affrontare con modelli convenzionali.

Esiste un vasto numero e una grande diversità di virus neurotropi che possono colpire il cervello umano, inclusi i flavivirus, il coronavirus della sindrome respiratoria acuta grave 2 (SARS-CoV-2), il virus dell'herpes simplex (HSV) e il virus dell'immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1). Lo sviluppo di terapie antivirali efficaci è cruciale, ma rimane una sfida a causa della complessità delle interazioni virus-cervello. Il cervello è considerato un organo immunoprivilegiato, supportato dalla BBB, che impedisce a grandi cellule immunitarie e molecole di entrare nel cervello dal flusso sanguigno.

I virus neurotropi hanno sviluppato strategie diverse per superare questa barriera, tra cui la migrazione transcellulare, la rottura delle giunzioni strette e il meccanismo del "cavallo di", attraverso cui le cellule immunitarie infette trasportano il virus attraverso l'endotelio4. Di conseguenza, la sorveglianza immunitaria nel cervello è limitata, rendendo più difficile la eliminazione del virus. Inoltre, i componenti cellulari della BBB, incluse cellule endoteliali, astrociti e periciti, esprimono recettori per il riconoscimento dei pattern che rilevano i pattern molecolari associati ai patogeni virali (PAMP) e alimentano risposte immunitarie innate, anche se la segnalazione pro-infiammatoria può paradossalmente aggravare la perturbazione dellaBBB 15. Inoltre, l'accesso limitato al tessuto cerebrale umano ostacola gli studi sulle interazioni virali con le cellule neurali e la somministrazione di potenti agenti antivirali al SNC. Queste sfide combinate ostacolano la scoperta di nuovi agenti antivirali per trattare le infezioni virali in tutte le fasi dello sviluppo e durante tutta la vita, rendendo essenziale comprendere meglio come i virus interagiscono con il cervello e sviluppare nuove strategie terapeutiche per combattere questeinfezioni 16. Nel complesso, questa revisione sottolinea l'utilità degli organoidi del SNC nello studio delle infezioni virali neurotrope, dei meccanismi della neuroinfiammazione e della scoperta di farmaci antivirali. La Figura 1 offre una panoramica delle principali applicazioni degli organoidi cerebrali nella modellazione delle infezioni virali neurotrope, nell'indagine delle interazioni ospite-patogeno e nell'avanzamento dello sviluppo terapeutico antivirale.

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Figura 1: Organoidi cerebrali come piattaforme rilevanti per l'uomo per modellare infezioni virali neurotrope del sistema nervoso centrale. La figura offre una panoramica dei temi chiave affrontati, con un focus sugli organoidi cerebrali tridimensionali (3D) come modelli sperimentali. I virus neurotropi discussi in questa revisione includono HIV-1, HSV-1/2, SARS-CoV-2 e ZIKV. Diversi modelli di organoidi cerebrali permettono studi sulla patogenesi virale, le interazioni ospite-patogeno, la disfunzione della barriera emato-encefalica (BBB) e le risposte neuroinfiammatorie che coinvolgono neuroni, astrociti, microglie e cellule endoteliali cerebrali. Gli organoidi cerebrali forniscono piattaforme fisiologicamente rilevanti per lo screening e la valutazione delle terapie antivirali. Creato in BioRender. Kashanchi, F. (2026) https://BioRender.com/y7eenju Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Revisione e prospettiva

Scoperta terapeutica negli organoidi cerebrali infettati da virus

Screening antivirale

Mancano terapie approvate per molte infezioni virali neurotrope, limitando le opzioni di trattamento oltre le cure di supporto. Gli organoidi cerebrali sono uno strumento prezioso per scoprire nuovi composti antivirali, consentendo lo screening farmacologico in un ambiente 3D fisiologicamente rilevante che somiglia al tessuto cerebrale umano. In uno studio iniziale, è stato effettuato uno screening chimico ad alto contenuto di 1.120 farmaci e candidati approvati dalla FDA contro lo ZIKV in organoidi cerebrali simili al feto. L'attività antivirale è stata valutata sulla base della proliferazione cellulare e della soppressione dell'infezione da ZIKV. Di tutti i composti testati, nove hanno mostrato potenziale, con due composti—ippeastrina idrobromuro (HH) e amodiaquina diidrocloruro diidrato (AQ)—che si sono distinti per i loro forti effetti antivirali, riducendo significativamente l'infezione sopprimendo la produzione di RNAvirale 17.

Diversi studi successivi hanno esplorato composti che mirano a diverse fasi del ciclo vitale virale. In uno studio di Watanabe et al., il 25-idrossicolesterolo (25HC), un composto che blocca l'ingresso virale inibendo la fusione a membrana, ha ridotto i livelli di mRNA ZIKV negli organoidi corticali del ~74% e diminuito le cellule ZIKV-positive del ~72%. Inoltre, lo stesso studio ha valutato composti antivirali che mirano al recettore AXL espresso sulle cellule progenitrici neurali. Un inibitore a piccola molecola del dominio tirosina chinasi AXL, R428, ha prodotto una modesta riduzione dei livelli di mRNA ZIKV (~41%). Tuttavia, il trattamento con un anticorpo anti-AXL non ha ridotto significativamente i livelli di mRNAZIKV 18. Infine, tre farmaci anti-flavivirali, duramicina, ivermectina e azitromicina, sono stati testati sugli organoidi. Duramicina e ivermectina ridussero significativamente i livelli di mRNA ZIKV, mentre azitromicina non mostrò alcun effetto protettivo contro ZIKV, come determinato da RT-qPCR eimmunocolorazione 18.

In uno studio separato, Xu et al. hanno analizzato 173 composti come soppressori dell'attività della caspasi-3 indotta da ZIKV e hanno identificato l'emricasan come il candidato neuroprotettivo più potente senza compromettere la proliferazione cellulare negli organoidi cerebrali. Due composti aggiuntivi, niclosamide e PHA-690509, hanno dimostrato una significativa attività anti-ZIKV inibendo la replicazione virale nella fase post-ingresso in modo dipendente dalla dose. Inoltre, il co-trattamento con emricasan e PHA-690509 ha prodotto un effetto additivo e ha preservato la vitalità degli astrociti dopo l'infezione daZIKV 19. In un altro studio, l'enoxacina, un potenziatore di interferenza RNA (RNAi), ha dimostrato un'attività antivirale diretta nelle cellule competenti per RNAi e ha completamente prevenuto i fenotipi microcefalici indotti da ZIKV negli organoidi cerebrali, suggerendo che il potenziamento delle vie antivirali intrinseche nelle cellule progenitrici neurali possa rappresentare una strategia terapeuticavalida 20.

Pettke et al. hanno successivamente analizzato 110 analoghi strutturali di TH3289 a dosi multiple negli organoidi infettati daZIKV 21. Due composti, TH3289 e TH6744, hanno mostrato la più forte attività antivirale, e i successi più attivi hanno condiviso un nucleo di benzimidazolone. Questo studio è stato significativo perché il sistema organoide ha permesso non solo uno screening rapido dei composti, ma anche un follow-up meccanicistico. Ad esempio, TH6744 è stato riscontrato che interferisce con le fasi avanzate del ciclo di vita21 dello ZIKV.

Gli organoidi cerebrali sono stati inoltre utilizzati per identificare candidati terapeutici per l'infezione da SARS-CoV-2. Un farmaco anti-epatite C approvato dalla FDA, il sofosbuvir, ha migliorato la sopravvivenza neuronale e salvato la sinaptogenesi compromessa negli organoidi cerebrali infettati da SARS-CoV-222. Gli organoidi cerebrali hanno inoltre contribuito alla comprensione dell'infezione nervosa centrale mediata da HSV-1; tuttavia, lo screening antivirale per HSV-1 nei modelli organoidi rimane limitato rispetto agli studi su ZIKV e SARS-CoV-2. Uno studio fondamentale che ha utilizzato neuroni derivati da iPSC ha dimostrato che la carenza di TLR3 rende i neuroni umani suscettibili all'infezione da HSV-1, rivelando un fenomeno specifico umano che i modelli di roditori non erano riusciti acatturare 23. Più recentemente, Bellizzi et al. hanno dimostrato che il targeting a ripetizioni palindromiche brevi regolarmente interspaziate (CRISPR)-Cas9 di sequenze genomiche di HSV-1 soppresse sia l'infezione primaria sia la riattivazione virale nelle colture organoidi 3D, stabilendo l'editing genico come una strategia antivirale praticabile per l'infezione da herpesvirus dalSNC 24. Dato che la resistenza all'aciclovir è un problema clinico emergente e non esiste una terapia curativa per l'encefalite25 dell'HSV, l'assenza di screening su larga scala di composti antivirali contro l'HSV-1 negli organoidi cerebrali rappresenta una significativa lacuna di conoscenza.

Oltre alle piccole molecole, gli oligonucleotidi antisenso (ASO), che mirano all'RNA e modificano l'espressione genica, sono strumenti terapeutici emergenti per il trattamento di varie malattie, e gli organoidi cerebrali possono essere impiegati per valutare nuove terapieASO 26. Data l'utilità degli organoidi per gli studi ASO, caratteristiche importanti come biodistribuzione, tossicità ed efficacia terapeutica potrebbero essere indagate negli organoidi cerebrali infettati da virus.

Una delle applicazioni più importanti degli organoidi cerebrali è la valutazione della neurotossicità dei farmaci antivirali esistenti. Questo è particolarmente importante perché si è dimostrato che i trattamenti per l'HIV comunemente usati sono tossici per le cellule cerebrali sia in vitro che invivo. Akay et al. hanno dimostrato la neurotossicità dei farmaci antivirali in colture corticali primarie contenenti microglia, astrociti e neuroni. I neuroni positivi a MAP2 hanno mostrato una diminuzione dipendente dalla dose dopo l'esposizione a ritonavir e saquinavir. Il trattamento con combinazioni di farmaci antiretrovirali (cART) ha portato a una neurotossicità acuta, e le colture trattate con zidovudina (AZT) hanno mostrato un aumento della produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS)28. Sebbene questi risultati siano stati ottenuti tramite colture 2D, gli organoidi cerebrali potrebbero ampliare questa ricerca fornendo una piattaforma fisiologicamente più rilevante per lo screening di neurotossicità ad alto rendimento di terapie antiretrovirali individuali o combinate. Per indagare i meccanismi alla base della neurotossicità indotta da antivirali in questi modelli 3D, si possono impiegare tecniche come l'analisi morfologica, i saghi funzionali e il profilingtrascrittomico.

Oltre allo screening della neurotossicità, sono stati sviluppati organoidi cerebrali per studiare il disturbo neurocognitivo associato all'HIV (HAND), che continua a colpire dal 30%% al 50% delle persone che vivono con l'HIV nonostante l'efficace terapia antiretrovirale (ART). Le cellule microgliali sono il serbatoio principale di HIV-1 nel SNC, e i modelli organoidi sono stati determinanti nel chiarire come l'infezione microgliale causi danni neuronali. Kong et al. hanno utilizzato organoidi cerebrali derivati da iPSC contenenti microglia e hanno osservato un marcato aumento nell'espressione genica delle chemochine CCL2 e CXCL10, insieme all'attivazione di molteplici geni stimolati dall'interferone di tipo I (MX1, ISG15, ISG20, IFI27, IFITM3 e altri) dopo l'infezione daHIV-1 30. Il profilo di espressione genica infiammatoria è stato propagato alle cellule spettatorie, inclusi i neuroni non contaminati. Questi neuroni hanno mostrato un marcato calo nell'espressione del trasportatore di neurotrasmettitori insieme a un aumento dell'espressione di geni associati alla senescenza cellulare e alla morte cellulare. L'uso degli organoidi cerebrali per la ricerca sull'HIV è stato introdotto da Dos Reis et al., che hanno incorporato la microglia infetta da HIV negli organoidi cerebraliumani 31. Questo modello riproduceva la replicazione virale a basso livello tipicamente osservata nel cervello umano. L'incorporazione della microglia infetta da HIV ha scatenato una risposta neuroinfiammatoria associata a astrogliosi, patologie neurodegenerative e degenerazione e perdita dei processi sinaptici neuronali. Donadoni et al. successivamente hanno utilizzato organoidi cerebrali derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) contenenti microglie e astrociti per modellare NeuroHIV e valutare gli effetti della terapia antiretrovirale combinata (cART) in un sistema organoide3D 32. Collettivamente, questi studi basati su organoidi forniscono importanti intuizioni meccanicistiche sulla HAND e stabiliscono un prezioso sistema modello per l'indagine delle terapie neuroprotettive.

In conclusione, gli organoidi cerebrali forniscono un sistema modello unificato per lo screening dei composti antivirali, valutando contemporaneamente gli effetti neurotossici nelle prime fasi del processo di sviluppo del farmaco. L'identificazione di composti antivirali efficaci è solo il primo passo verso la traduzione clinica (Tabella 1). Altrettanto importante è lo sviluppo di strategie di somministrazione di farmaci in grado di somministrare agenti terapeutici alle cellule infette all'interno del sistema nervoso centrale.

VirusModello organoideTipi di celluleRisultati chiaveLimitazioniRiferimento
ZIKVOrganoidi fetali derivati da hPSCProgenitori neurali, neuroniHH e AQ hanno ridotto l'RNA virale dallo screening a 1120 compostiNessuna cellula immunitaria; Stadio fetale17
Organoidi corticaliProgenitori neurali25HC ridusse l'infezione del ~74%; R428 ha ridotto l'mRNA ZIKV del ~41%Nessuna vascolarizzazione18
Organoidi cerebraliNeuroni, astrocitiEmricasan, neuroprotettivo; niclosamide e PHA-690509 inibiscono la replicazioneNessuna microglia19
Organoidi cerebraliProgenitori neuraliL'enoxacina ha prevenuto la microcefalia indotta da ZIKV tramite RNAiNessuna cellula immunitaria20
Organoidi cerebraliNeuroniTH3289 e TH6744 (nucleo di benzimidazolone) interferiscono con il ciclo vitale tardivo dello ZIKVNessuna cellula immunitaria21
SARS-CoV-2Organoidi cerebraliNeuroniIl Sofosbuvir ha salvato la sinaptogenesi e la sopravvivenza neuronaleNiente BBB22
HSV-1Neuroni derivati da iPSCNeuroniLa carenza di TLR3 rende i neuroni umani suscettibili; Fenomeno specifico umanoSolo neuroni 2D23*
Colture organoidi 3DNeuroniCRISPR-Cas9 ha soppresso l'infezione primaria e la riattivazioneMaturazione limitata24
HIV-1Organoidi cerebrali iPSCNeuroni, microgliaRegolazione all'alza CCL2, CXCL10; attivazione del gene interferone di tipo I; Senescenza neuronaleNessuna vascolarizzazione30
Orgoidi del Cervello Umano con microgliaNeuroni, microgliaNeuroinfiammazione, astrogliosi, degenerazione sinapticaNessuna vascolarizzazione31
Organoidi cerebrali hiPSCNeuroni, microglia, astrocitiEffetti cART valutati nel modello 3D NeuroHIVModello in fase iniziale32

Tabella 1: Modelli organoidi cerebrali utilizzati per studiare infezioni virali neurotrope. Questa tabella riassume il virus studiato, il modello organoide, i tipi cellulari inclusi, i principali risultati, i limiti e il riferimento per studi rappresentativi basati su organoidi cerebrali su ZIKV, SARS-CoV-2, HSV-1 e infezioni da HIV-1.

Piattaforme di somministrazione di farmaci

Trovare i composti antivirali più efficaci per trattare le infezioni dal SNC è essenziale, ma senza una somministrazione efficiente al cervello, questi composti potrebbero non ottenere un beneficio terapeutico. Gli organoidi cerebrali possono essere utilizzati per valutare i sistemi di somministrazione dei farmaci per la loro capacità di penetrare i tessuti neurali e somministrare carichi antivirali.

Le nanoparticelle a base di lipidi (LNP) sono ampiamente utilizzate come portatori di farmaci. Questi portatori di farmaci hanno dimostrato di aumentare la biodisponibilità e consentire una somministrazione mirata al sito della malattia, specialmente in tutto ilBBB 33. Le formulazioni di mRNA basate su LNP sono state utilizzate con successo nella vaccinazione contro ilCOVID-19 34,35. Gli organoidi cerebrali possono essere utilizzati per valutare l'efficacia e la sicurezza delle nuove formulazioni a base di LNP. Le LNP possono anche essere vettorizzate verso il CNS tramite modifiche superficiali con liganti di puntamento. Ad esempio, transferrina o lattoferrina sono state coniugate con LNP per facilitare la transcitosi mediata dai recettori e migliorare il trasporto attraverso ilBBB 36,37. Collettivamente, la potenziale efficacia nella somministrazione dei farmaci, la neurotossicità e i cambiamenti nella stabilità delle nanoformulazioni dopo la penetrazione della BBB possono essere studiati negli organoidicerebrali 38.

Oltre alle LNP, sono stati studiati anche nanoportatori polipeptidici a doppio target come sistema di somministrazione di farmaci negli organoidi cerebrali umani. Le nanoparticelle (NP) di poli(L-glutammico) mirate hanno mostrato eccellente citocompatibilità e la capacità di entrare negli organoidi simili al mesencefalo. È stato dimostrato che alanina e glutatione potevano indirizzare efficacemente le NP verso le cellule endoteliali cerebrali e penetrare gli organoidi cerebrali, portando alla somministrazione di farmaci alcervello 39. La permeabilità delle nanoparticelle a base di polimeri è stata studiata negli organoidi microvascolarizzati 3D umani, concentrandosi sugli effetti delle loro dimensioni e della chimica delle superfici. Gli organoidi generati erano costituiti da cellule endoteliali umane derivate da iPSC, astrociti e periciti cerebrali primari. Le immagini confocali hanno rivelato che la coniugazione delle NP con il ligando holo-transferrina (Tf) associata al cervello ne ha aumentato significativamentela permeabilità 40.

Successivamente, sono stati studiati l'assorbimento, la penetrazione e la distribuzione delle nanoparticelle d'oro (AuNP) negli sferoidi cerebrali BBB. Questi sferoidi sono composti da sei tipi di cellule cerebrali: neuroni, astrociti, periciti, cellule endoteliali, microglie e oligodendrociti. Gli autori hanno riferito che l'ipossia transitoria ha portato all'apertura del BBB e a un aumento del trasporto degli AuNP nell'interno degli sferoidi. Le nanoparticelle riuscivano a entrare facilmente in cellule enuclei 41. In uno studio simile che utilizzava lo stesso sistema modello sferoide, il tracciamento concorrente della cinetica di penetrazione dei nanoportatori e del loro rilascio del carico utile terapeutico è stato valutato tramite microscopia a scansione laserconfocale 42. In un altro studio, Park et al. hanno dimostrato che gli AuNP coniugati con fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF) sono entrati con successo negli organoidi cerebrali senza causare tossicitàsignificativa 43.

Oltre al targeting delle moietà, la forma e la dimensione delle nanoparticelle possono anche svolgere un ruolo significativo nella capacità di una nanoformulazione di fornire il suo carico terapeutico alcervello 44. Le sfere di polistirene da 200 nm vettorizzate con anticorpi contro il VCAM-1 hanno accumulato da 1,2 a 1,5 volte più rispetto alle NP non vettorizzate di controllo. Curiosamente, le particelle a forma di bastoncello hanno mostrato un accumulo ancora maggiore di 2,1-2,5 volte rispetto ai controlli corrispondenti, suggerendo che le particelle a forma di bacchettona offrono un vantaggio rispetto alle sfere in termini di legame cellulare. Gli organoidi cerebrali possono fornire approfondimenti dettagliati su come la geometria delle particelle possa influenzare la penetrazione cerebrale. Inoltre, gli effetti dell'ipossia e di altri composti biologicamente attivi sulla permeabilità BBB potrebbero essere ulteriormente studiati negli organoidi neurovascolaridel cervello 45,46.

Le vescicole extracellulari (EV) derivate dalle cellule staminali rappresentano un'alternativa biologica ai portatori sintetici di farmaci come le LNP. Branscome et al. hanno esplorato il potenziale riparativo delle EV contro l'infezione da HIV-1 nelle neurosfereumane 47. In questo studio è stato dimostrato che gli EV prodotti da cellule staminali mesenchimali (MSC) e iPSC possono penetrare naturalmente nelle neurosfere, salvare la vitalità cellulare e ridurre l'espressione di citochine infiammatorie nelle neurosfere infettate da HIV-1, evidenziando le proprietà neuroprotettive e antinfiammatorie delle cellule staminaliEV 47. In un altro studio di Kim et al., piccole vescicole extracellulari (sEV) sono state progettate per la somministrazione di antivirali nel trattamento dell'infezione da SARS-CoV-248. I nanoportatori sono stati caricati con ACE2 solubile (sACE2) tramite modifica genetica delle cellule donatrici con un plasmide che codifica eGFP-CD9ΔTM4-sACE2(WT), portando all'espressione di sACE2 sulla superficie del sEV. È stato dimostrato che le sEV vettorizzate in sACE2 proteggevano contro WT e il virus mutante Spseudotipizzato 48. Il meccanismo di protezione potrebbe essere testato su organoidi cerebrali infettati da SARS-CoV-2. Inoltre, un altro studio ha mostrato che i veicoli elettrici rilasciati dalle cellule infette da HSV-1 portano componenti immunitari innati come la STING, che può attivare risposte immunitarie innate nelle cellule riceventi, con conseguente inibizione potente della replicazione dell'HSV-1. Una separazione cruciale degli EV dalle particelle virali infettive è stata raggiunta tramite centrifugazione a gradientedi densità 49.

Gli organoidi cerebrali possono anche essere utilizzati per testare la potenziale neurotossicità delle nanoformulazioni di nuovi farmaci. Ad esempio, quando gli AuNP pegilati venivano iniettati in organoidi cerebrali, si osservava un'infiammazione significativa, mediata dalla produzione di ROS. Al contrario, le NP polilattiche polimeriche hanno mostrato una somministrazione efficiente del farmaco e una bassa citotossicità grazie alla loro lenta assorbimento e degradabilità, permettendo la penetrazione nell'organoide cerebrale senza provocare una rispostaimmunitaria 50. La neurotossicità di AuNP, grafene e punti di carbonio è stata valutata anche negli organoidi neurovascolari 3D. Questi organoidi erano costituiti da cellule neurali, microglie e una superficie cellulare endoteliale. Questi studi hanno rivelato che la microglia potrebbe svolgere un ruolo fondamentale nella permeabilità e tossicità di questeformulazioni 51. Inoltre, è stata dimostrata che alte concentrazioni di NP di ZnO causano anche una morte neuronale significativa. Il meccanismo di tossicità è stato collegato all'accumulo intracellulare di ioni Zn, che ha ridotto i livelli di proteine LC3B, suggerendo un difettodell'autofagia 52. Nel complesso, questi studi dimostrano che gli organoidi cerebrali 3D possono catturare come le nanoformulazioni interagiscono con il tessuto neurale, dall'assorbimento e penetrazione all'attivazione immunitaria e alla tossicità. Il successo delle strategie di somministrazione dei farmaci mirati al sistema nervoso centrale dipende in ultima analisi non solo dal raggiungimento delle cellule bersaglio, ma anche dalla modulazione delle vie infiammatorie attivate durante l'infezione, molte delle quali sono innate dalla segnalazione di DAMPs e PAMPs.

DAMPs e PAMPs nelle infezioni virali

Gli organoidi cerebrali possono essere utilizzati per studiare DAMPs e PAMPs rilasciati da cellule stressate, lesionate o morenti nel SNC. I DAMP includono proteine da shock termico, ATP e acido urico, mentre i PAMP includono macromolecole batteriche, virali, fungine e parassite. Pertanto, questi pattern molecolari allertano il sistema immunitario innato e attivano diverse vie di trasduzione del segnale in risposta ad antigeni estranei o a qualsiasi segno comunemente associato all'infezione. I meccanismi alla base dei loro effetti protettivi in risposta alle infezioni virali non sono completamente compresi, e indagini dettagliate su questi processi possono essere condotte negli organoidicerebrali 53. I DAMP e PAMP rilasciati si legano a un ampio gruppo di recettori, inclusi recettori simili a Toll (TLR), recettori simili a NOD (NLR), recettori simili a AIM2, recettori simili a RIG-I (RLR) e recettori lectine di tipo C (CLR), che sono espressi sulla membrana plasmatica o intracellularmente54. Questi recettori sono fondamentali per la produzione di citochine e interferoni in risposta alle infezioni virali neurotrope, tra cui EV-71, HIV-1, HSV-1, flavivirus, virus del Nilo Occidentale (WNV) e altri54.

Slowikowski et al. hanno indagato come i DAMP, le chemochine e le molecole di adesione rilasciate dalle cellule neurali danneggiate coordinino l'ingresso dei leucociti nel SNC durante l'encefalite55 del flavivirus. In particolare, è stato rivelato che il WNV aumenta l'espressione di marcatori di morte cellulare altamente infiammatorie di necroptosi e piroptosi che favoriscono il rilascio di DAMPs nel cervello infetto. Quando tali molecole, ad esempio la proteina box 1 del gruppo ad alta mobilità (HMGB1), vengono rilasciate, inducono molteplici vie di segnalazione, portando alla migrazione dipendente da CXCR4 di monociti attivati, macrofagi e cellule dendritiche verso i tessutiinfetti 56,57. Inoltre, è stato dimostrato che i DAMP possono essere rilasciati in risposta a un'infezione, seguiti da una regolazione all'alza dei TLR e dall'esacerbazione dell'infiammazione e danni tissutali delSNC 58. Nel complesso, questi studi indicano che le infezioni virali sembrano innescare le vie di segnalazione sovrapposte tra DAMP e PAMP, portando a neuroinfiammazione e danni ai tessuti. Collettivamente, organoidi cerebrali contenenti microglia e astrociti potrebbero fungere da modello per tracciare le risposte a cascata immunitaria nei tessuti neurali umani, in particolare l'interazione tra il rilascio DAMP e la neuroinfiammazione mediata da TLR.

Il sistema del complemento è un elemento fondamentale dell'immunità innata che risponde rapidamente all'infezione. Tuttavia, molti virus hanno sviluppato meccanismi per superare questo sistemadi difesa 59. Alcuni virus sfuggono al sistema del complemento producendo proteine che si legano ai componenti del complemento e li inibiscono, o sequestrandoli. Questo è stato dimostrato in una varietà di virus, tra cui il virus T-linfotropo umano-1 (HTLV-1), il citomegalovirus umano (HCMV), l'HIV-1, il virus scimmieno 5 (SV5) e il virus della parotite (MuV), che incorporano proteine del complemento dell'ospite nei loro virioni (cioè CD55/DAF, CD59, CD64 e MCP). Queste proteine inibiscono la risposta immunitaria innata, favorendo la replicazione virale e la persistenza60. Pertanto, gli organoidi cerebrali possono essere utilizzati per identificare i meccanismi specifici attraverso cui i virus sfuggono al sistema del complemento. Crescenti evidenze suggeriscono che i DAMP e i PAMP non solo influenzano la risposta antivirale iniziale, ma fungono anche da mediatori chiave dell'infiammazione persistente che sta alla base delle condizioni post-virali croniche.

Ruolo delle DAMP/PAMP nell'infiammazione persistente causata da infezione virale

Oltre alla fase infiammatoria acuta, le infezioni virali possono causare esposizione cronica a DAMPs/PAMPs, con conseguenze infiammatorie a lungo termine, in particolare nel cervello. Gli organoidi cerebrali possono diventare uno strumento potente per studiare i meccanismi sottostanti delle sindromi legate alla fase post-acuta dell'infezione.

La maggior parte dei virus umani non persistenti attualmente conosciuti attiva le risposte immunitarie durante la fase acuta dell'infezione, seguita dall'eliminazione del patogeno. Tuttavia, in alcuni casi, i pazienti sperimentano sintomi persistenti che possono differire da quelli osservati durante la fase acuta e persistere per mesi o addirittura anni. In particolare, i pazienti con COVID-19 lungo riferiscono affaticamento cronico, "nebbia mentale", febbre, dolore e altre complicanzeneurologiche 61. Inoltre, l'infiammazione cronica può aumentare mortalità e morbilità, così come il rischio di aterotrombosi, cancro e compromissionecognitiva 62,63.

Inoltre, la persistenza di proteine virali e RNA può portare a livelli elevati di citochine pro-infiammatorie, come TNF-α, IL-1α, IL-1β, IFN-γ e IL-6, causando così danni ai tessuti, invecchiamento precoce e esaurimento del sistemaimmunitario 64. La replicazione lenta o tracce di componenti virali potrebbero innescare il rilascio di DAMPs/PAMPs che interagiscono con i loro recettori specifici, causando infiammazione persistente di basso grado65. In alcuni casi, l'infezione cerebrale da HSV-1 può causare danni neuronali seguiti da encefalite e può infine contribuire allo sviluppo di disturbi neurodegenerativi come la malattiadi Alzheimer 66. I meccanismi di autofagia alterati possono essere un fattore scatenante importante dell'infiammazione cronica nei pazienti con HSV-2, in cui meccanismi protettivi difettosi portano a replicazione virale persistente, alla presenza continua di componenti virali nel cervello e allaneurodegenerazione 67. Questi componenti virali attivano sensori immunitari innati tramite PAMP e possono manipolare le vie di segnalazione per bypassare gli effetti antivirali dell'attivazione immunitaria innata. È importante sottolineare che HCMV e virus di Epstein-Barr (EBV) hanno dimostrato di sviluppare infezioni virali croniche che favoriscono la disfunzioneimmunitaria 68,69. La senescenza prolungata indotta dall'infezione può anche contribuire all'infiammazione a lungo termine associata a varie infezioni virali. Gli organoidi cerebrali 3D con componenti immunitarie integrate forniscono piattaforme rilevanti per comprendere i meccanismi complessi alla base dell'esposizione cronica a DAMPs/PAMPs e il loro ruolo nelle complicazioni a lungo termine delle infezioni virali nel SNC.

Limitazioni e prospettiva:

Nonostante i loro vantaggi rispetto ai modelli in vitro tradizionali, gli organoidi cerebrali presentano limitazioni significative che devono essere affrontate per supportarne l'applicazione più ampia. In particolare, la maggior parte degli organoidi manca di cellule immunitarie residenti, che sono contributori principali alla modellazione delle malattie virali e alla comprensione delle risposte immunitarie innate e adattative durante l'infezionevirale 70. In particolare, i protocolli organoidi standard non includono microglie incorporate, le cellule immunitarie primarie del SNC e serbatoio dell'HIV-1, il che limita la modellizzazione della neuroinfiammazione e della persistenzavirale 71. Un'altra carenza è la complessità tissutale incompleta, inclusa l'assenza di vascolatura, che gioca un ruolo importante nell'erogazione di nutrienti e ossigeno, nonché nella diffusionevirale 72. Pertanto, la crescita degli organoidi è limitata perché le cellule al centro non possono ricevere nutrienti adeguati. Inoltre, l'escrezione dei rifiuti metabolici è compromessa, spesso portando a nuclei ipossici o necrotici in organoidi di grandi dimensioni. Inoltre, gli organoidi non riproducono completamente le interazioni tra neuroni, cellule endoteliali e cellule stromali che possono influenzare l'infezione virale e la patogenesi. Inoltre, in questa fase di sviluppo, gli organoidi non possono ripetere infezioni sistemiche, diffusione interorganica e risposte immunitarie a tutto il corpo. Un'altra limitazione è che molti organoidi epiteliali hanno un'accessibilità limitata all'inoculazione virale a causa della loro superficieapicale rivolta verso l'interno 74. Di conseguenza, l'inoculazione virale richiede microiniezione, portando a variabilità e a basso rendimento. Pertanto, l'inoculazione di organoidi con diametri diversi rende difficile controllare la molteplicità delle infezioni. Inoltre, molti organoidi assomigliano a tessuti fetali piuttosto che a organi adulti, il che può influenzare il tropismo virale, la cinetica di replicazione e le rispostedell'ospite. Ciò è particolarmente evidente nel caso dell'HSV-1, poiché la maturazione neuronale influisce sull'istituzione della latenza e sui processi di riattivazione che gli organoidi dello stadio fetale potrebbero non riprodurrecompletamente 23. Inoltre, gli organoidi possono variare notevolmente in composizione e funzione, portando a risultati vari, bassa riproducibilità e necessità di numerose repliche sperimentali. Ad esempio, gli organoidi possono differire per dimensioni, composizione cellulare, architettura e stato di maturazione. Questo rende la standardizzazione difficile, se non impossibile, neilaboratori 7,75. Infine, l'elevato costo e la scalabilità limitata della generazione e manutenzione degli organoidi restano ostacoli significativi. Di conseguenza, una delle principali sfide è lo sviluppo di piattaforme ad alta capacità compatibili con la tecnologiaorganoide 74.

Nonostante queste carenze e limitazioni, gli organoidi hanno un potenziale significativo per modellare infezioni virali, tossicologia e scoperta di farmaci. Superare queste limitazioni potrebbe ridurre significativamente la dipendenza dai modelli animali e facilitare studi meccanicisticifondamentali 76. Una delle carenze più rilevanti dei modelli organoidi esistenti è la loro limitata complessità fisiologica e la mancanza di composizioni cellulari diversificate. Gli sviluppi futuri dovranno concentrarsi sull'incorporazione di componenti immunitari, neuronali, vascolari e stromali nei modelli organoidi. Questo potrebbe essere ottenuto utilizzando modelli di co-coltura che integrano organoidi con i tipi cellularimenzionati 77,78. In particolare, l'incorporazione delle cellule immunitarie permetterà la modellizzazione delle risposte immunitarie sistemiche e dell'infiammazione durante le infezioni virali. Inoltre, gli organoidi vascolarizzati possono essere ulteriormente sviluppati per migliorare la complessità fisiologica e ricapitolare meglio le condizioni in vivo 79,80. Pertanto, organoidi cerebrali che incorporano tessuti endoteliali supporteranno le indagini sulla funzione della barriera emato-encefalica e sulla somministrazione di farmaci durante infezionivirali 13,81. Inoltre, gli organoidi cerebrali 3D possono replicare diversi aspetti chiave dell'infezione virale nel cervello. Infatti, diversi modelli di organoidi con strutture intricate che rappresentano da vicino varie regioni cerebrali sono attualmente oggetto diindagine. Infine, l'inclusione di componenti neuronali e stromali aumenterebbe ulteriormente la fedeltà degli organoidi ai sistemi organici nativi. La riproducibilità rimane un altro serio ostacolo all'applicazione più ampia delle tecnologie organoidi. Pertanto, generare organoidi robusti e altamente riproducibili è cruciale per la ulteriore traduzione delle applicazioni degli organoidi. Vari metodi per l'isolamento e la semina delle celle, così come la selezione di matrici e fattori solubili, dovrebbero essere standardizzati in tutto il campo83. Da notare che la composizione del mezzo di coltura, la densità cellulare e il tempo di coltura possono influenzare i risultati di questi modelli. Pertanto, strategie per ridurre la variabilità della matrice, inclusi idrogel sintetici composti da reti polimeriche completamente definite con caratteristiche chimiche e meccaniche controllate con precisione, sono state introdotte come alternativapromettente 84. Questi organoidi mostrano una variabilità minima da batch a lotto, permettendo studi controllati. Inoltre, la creazione di biobanche organoidi che rappresentino popolazioni di pazienti diverse diventerebbe una risorsa preziosa per la scoperta di farmaci e l'identificazione dei biomarcatori. Le tecnologie emergenti di intelligenza artificiale (IA) stanno diventando strumenti importanti nella ricerca sugliorganoidi 85. Ulteriori applicazioni di queste tecnologie potrebbero accelerare le analisi e ridurre i bias nell'interpretazione dei dati. Tuttavia, le applicazioni di IA in questo campo sono ancora nelle loro fasi iniziali. L'integrazione di approcci IA nello sviluppo organoide, come l'analisi delle immagini guidata dall'IA86 o l'ottimizzazione predittiva delle condizioni di cultura87, faciliterebbe significativamente la ricerca sugli organoidi.

Conclusioni

Questa revisione ha esaminato come gli organoidi cerebrali, colture neurali 3D che imitano da vicino l'unità neurovascolare umana, vengano utilizzati per studiare l'invasione, la replicazione e i danni al sistema nervoso centrale causati dai virus neurotropi. Sebbene ogni virus abbia caratteristiche genetiche e strutturali uniche, molti dei processi patologici innescati dai virus nel cervello sono condivisi, e i modelli organoidi si sono dimostrati molto adatti a analizzare questi meccanismi comuni e diversi. Un'infiammazione eccessiva può peggiorare i danni delle cellule nervose; Tuttavia, quando il sistema immunitario innato viene correttamente controllato, può limitare la diffusione virale e proteggere il tessuto cerebrale.

Gli organoidi 3D permettono lo studio di entrambi gli effetti in un contesto più rilevante dal punto di vista fisiologico, dove modelli animali e colture cellulari 2D non sono riusciti a catturare queste dinamiche. Queste informazioni sono fondamentali per combattere la patogenesi virale nel cervello e per identificare trattamenti che mirano alle vie corrette senza aumentare l'infiammazione. Gli organoidi cerebrali hanno una comprensione avanzata delle infezioni virali neurotrope, ma alcune lacune tecniche restano da colmare. Ad esempio, la maturazione lenta, la vascolarizzazione limitata e l'assenza di componenti BBB restano sfide comuni. La variabilità nelle tecniche di differenziazione degli organoidi e le incongruenze da batch a batch ostacolano anche la ricerca sugli organoidi cerebrali. Inoltre, la quantificazione dell'ingresso virale, della replicazione, del tropismo cellulare e delle risposte dell'ospite in un contesto 3D controllato può essere migliorata. Il lavoro esaminato nel manoscritto ha dimostrato che gli organoidi cerebrali sono tra i sistemi più rilevanti disponibili per studiare come i virus neurotropi interagiscono con il cervello umano, testare candidati antivirali e valutare la somministrazione di farmaci al sistema nervoso centrale. Con il maturare della tecnologia grazie al miglioramento della vascolarizzazione, all'integrazione delle cellule immunitarie e all'adozione di protocolli standardizzati, gli studi basati su organoidi saranno meglio posizionati per identificare composti e strategie con reale potenziale di traduzione clinica.

Abbreviazioni: ASO, oligonucleotidi antisenso; BBB, barriera emato-encefalica; CLR, recettori di lectina di tipo C; SNC, sistema nervoso centrale; CRISPR, raggruppati regolarmente con brevi ripetizioni palindromiche interspaziate; CXCL10, ligando chemoquina C-X-C motivato 10; DAMPs, pattern molecolari associati al danno; EV, vescicole extracellulari; hPSC, cellule staminali pluripotenti umane; HSV-1/2, virus herpes simplex tipo 1/2; HIV-1, virus dell'immunodeficienza umana tipo 1; IFN, interferoni; IL-6, interleucina-6; ISG, geni stimolati dall'interferone; LNP, nanoparticelle lipidiche; NLR, recettori simili a NOD; PAMP, pattern molecolari associati ai patogeni; PRR, recettori per il riconoscimento dei pattern; RNAi, interferenza RNA; RT-PCR, reazione a catena della polimerasi per trascrizione inversa; sACE2-EV, vescicole extracellulari solubili decorate con ACE2; SARS-CoV-2, coronavirus 2 da sindrome respiratoria acuta grave; scRNA-seq, sequenziamento di RNA a singola cellula; TLR, recettori simili a Toll; TNF-α, fattore di necrosi tumorale alfa; ZIKV, virus Zika; 3D, tridimensionale. ZIKV, Zikavirus; hPSC, cellule staminali pluripotenti umane; HH, hippeastrina idrobromuro; AQ, amodiaquina diidrocloruro diidrato; 25HC, 25-idrossicolesterolo, BBB, barriera emato-encefalica; cART, terapia antiretrovirale combinata; CRISPR, raggruppati regolarmente con brevi ripetizioni palindromiche interspaziate; hiPSC, cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo; HIV-1, virus dell'immunodeficienza umana tipo 1; hPSC, cellula staminale pluripotente umana; HSV-1, virus dell'herpes simplex tipo 1; RNAi, interferenza RNA; SARS-CoV-2, coronavirus 2 da sindrome respiratoria acuta grave; TLR3, studio dei neuroni 2D derivati da iPSC tramite recettore Toll-like 3.* è incluso per confronto.

Dichiarazioni

ChatGPT (OpenAI; GPT-5.5) è stato utilizzato in modo limitato per assistere nello screening della letteratura e nel perfezionamento del linguaggio. Tutta la selezione della letteratura, il fact-checking, la verifica delle fonti e l'interpretazione scientifica sono stati eseguiti indipendentemente dagli autori.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano con gratitudine tutti i membri del Laboratorio Kashachi, con un apprezzamento speciale a Gwen Cox per il suo prezioso supporto. Questo studio è stato inoltre supportato dai finanziamenti dei National Institutes of Health (NIH) R01MH134389, AI078859 e AI074410 R21DA057887 e dal Dipartimento della Difesa HT9425-24-1-0876 a F.K.

Riferimenti

  1. Lancaster MA, Knoblich JA. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 2014;9(10):2329-40.
  2. Chhibber T et al. CNS organoids: an innovative tool for neurological disease modeling and drug neurotoxicity screening. Drug Discovery Today. 2020;25(2):456-65.
  3. Eichmüller OL, Knoblich JA. Human cerebral organoids — a new tool for clinical neurology research. Nature Reviews Neurology. 2022;18(11):661-80.
  4. Al-Obaidi MMJ et al. Disruption of the blood brain barrier is vital property of neurotropic viral infection of the central nervous system. Acta Virologica. 2018;62(1):16-27.
  5. Lancaster MA et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 2013;501(7467):373-9.
  6. Kelava I, Lancaster MA. Dishing out mini-brains: Current progress and future prospects in brain organoid research. Developmental Biology. 2016;420(2):199-209.
  7. Velasco S et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 2019;570(7762):523-7.
  8. Giandomenico SL et al. Cerebral organoids at the air–liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output. Nature Neuroscience. 2019;22(4):669-79.
  9. Lancaster MA, Knoblich JA. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 2014;345(6194):1247125.
  10. Elvira R, Tan EK, Zhou ZD. Three-dimensional midbrain organoids: a next-generation tool for Parkinson’s disease modelling and drug discovery. Stem Cell Research & Therapy. 2025;16(1):502.
  11. Kim S, Chang MY. Application of Human Brain Organoids—Opportunities and Challenges in Modeling Human Brain Development and Neurodevelopmental Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 2023;24(15):12528.
  12. Noctor SC et al. Dividing Precursor Cells of the Embryonic Cortical Ventricular Zone Have Morphological and Molecular Characteristics of Radial Glia. The Journal of Neuroscience. 2002;22(8):3161-73.
  13. Sun XY et al. Generation of vascularized brain organoids to study neurovascular interactions. eLife. 2022;11:e76707.
  14. Onesto MM, Kim J, Pasca SP. Assembloid models of cell-cell interaction to study tissue and disease biology. Cell Stem Cell. 2024;31(11):1563-73.
  15. Liu D et al. Innate Immune Effectors Play Essential Roles in Acute Respiratory Infection Caused by Klebsiella pneumoniae. Journal of Immunology Research. 2020;2020:5291714.
  16. Louveau A, Harris TH, Kipnis J. Revisiting the Mechanisms of CNS Immune Privilege. Trends in Immunology. 2015;36(10):569-77.
  17. Zhou T et al. High-Content Screening in hPSC-Neural Progenitors Identifies Drug Candidates that Inhibit Zika Virus Infection in Fetal-like Organoids and Adult Brain. Cell Stem Cell. 2017;21(2):274-283.e5.
  18. Watanabe M et al. Self-Organized Cerebral Organoids with Human-Specific Features Predict Effective Drugs to Combat Zika Virus Infection. Cell Reports. 2017;21(2):517-32.
  19. Xu M et al. Identification of small-molecule inhibitors of Zika virus infection and induced neural cell death via a drug repurposing screen. Nature Medicine. 2016;22(10):1101-7.
  20. Xu YP et al. Zika virus infection induces RNAi-mediated antiviral immunity in human neural progenitors and brain organoids. Cell Research. 2019;29(4):265-73.
  21. Pettke A et al. Broadly Active Antiviral Compounds Disturb Zika Virus Progeny Release Rescuing Virus-Induced Toxicity in Brain Organoids. Viruses. 2020;13(1):37.
  22. Mesci P et al. SARS-CoV-2 infects human brain organoids causing cell death and loss of synapses that can be rescued by treatment with Sofosbuvir. PLOS Biology. 2022;20(11):e3001845.
  23. Lafaille FG et al. Impaired intrinsic immunity to HSV-1 in human iPSC-derived TLR3-deficient CNS cells. Nature. 2012;491(7426):769-73.
  24. Bellizzi A et al. Suppression of HSV-1 infection and viral reactivation by CRISPR-Cas9 gene editing in 2D and 3D culture models. Molecular Therapy. Nucleic Acids. 2024;35(3):102282.
  25. Karrasch M et al. Rapid acquisition of acyclovir resistance in an immunodeficient patient with herpes simplex encephalitis. Journal of the Neurological Sciences. 2017;384:89-90.
  26. Collotta D, Bertocchi I, Chiapello E, Collino M. Antisense oligonucleotides: a novel Frontier in pharmacological strategy. Frontiers in Pharmacology. 2023;14:1304342.
  27. Robertson K, Liner J, Meeker RB. Antiretroviral neurotoxicity. Journal of NeuroVirology. 2012;18(5):388-99.
  28. Akay C et al. Antiretroviral drugs induce oxidative stress and neuronal damage in the central nervous system. Journal of NeuroVirology. 2014;20(1):39-53.
  29. Fan P et al. The Application of Brain Organoids in Assessing Neural Toxicity. Frontiers in Molecular Neuroscience. 2022;15:799397.
  30. Kong W et al. Neuroinflammation generated by HIV-infected microglia promotes dysfunction and death of neurons in human brain organoids. PNAS Nexus. 2024;3(5):pgae179.
  31. dos Reis RS et al. Modeling HIV-1 neuropathogenesis using three-dimensional human brain organoids (hBORGs) with HIV-1 infected microglia. Scientific Reports. 2020;10(1):15209.
  32. Donadoni M et al. Modeling HIV-1 infection and NeuroHIV in hiPSCs-derived cerebral organoid cultures. Journal of Neurovirology. 2024;30(4):362-79.
  33. Mehta M et al. Lipid-Based Nanoparticles for Drug/Gene Delivery: An Overview of the Production Techniques and Difficulties Encountered in Their Industrial Development. ACS Materials Au. 2023;3(6):600-19.
  34. Liu J et al. BNT162b2-elicited neutralization of Delta plus, Lambda, Mu, B.1.1.519, and Theta SARS-CoV-2 variants. npj Vaccines. 2022;7(1):41.
  35. Wilson B, Geetha KM. Lipid nanoparticles in the development of mRNA vaccines for COVID-19. Journal of Drug Delivery Science and Technology. 2022;74:103553.
  36. Khare P et al. Lipid nanoparticle-mediated drug delivery to the brain. Advanced Drug Delivery Reviews. 2023;197:114861.
  37. Zhao Z et al. Red Blood Cell Anchoring Enables Targeted Transduction and Re-Administration of AAV-Mediated Gene Therapy. Advanced Science. 2022;9(24):2201293.
  38. Bergmann S et al. Blood–brain-barrier organoids for investigating the permeability of CNS therapeutics. Nature Protocols. 2018;13(12):2827-43.
  39. Mészáros M et al. Targeting Human Endothelial Cells with Glutathione and Alanine Increases the Crossing of a Polypeptide Nanocarrier through a Blood–Brain Barrier Model and Entry to Human Brain Organoids. Cells. 2023;12(3):503.
  40. Lee SWL et al. Modeling Nanocarrier Transport across a 3D In Vitro Human Blood-Brain-Barrier Microvasculature. Advanced Healthcare Materials. 2020;9(7):e1901486.
  41. Sokolova V et al. Transport of ultrasmall gold nanoparticles (2 nm) across the blood–brain barrier in a six-cell brain spheroid model. Scientific Reports. 2020;10(1):18033.
  42. Kostka K et al. The Application of Ultrasmall Gold Nanoparticles (2 nm) Functionalized with Doxorubicin in Three-Dimensional Normal and Glioblastoma Organoid Models of the Blood–Brain Barrier. Molecules. 2024;29(11):2469.
  43. Park SB et al. Gold nanoparticle-assisted delivery of brain-derived neurotrophic factor to cerebral organoids. Nano Research. 2022;15(4):3099-105.
  44. Da Silva-Candal A et al. Shape effect in active targeting of nanoparticles to inflamed cerebral endothelium under static and flow conditions. Journal of Controlled Release. 2019;309:94-105.
  45. Park TE et al. Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies. Nature Communications. 2019;10(1):2621.
  46. Mantle JL, Lee KH. Immunoglobulin G transport increases in an in vitro blood–brain barrier model with amyloid-β and with neuroinflammatory cytokines. Biotechnology and Bioengineering. 2019;116(7):1752-61.
  47. Branscome H et al. Retroviral infection of human neurospheres and use of stem Cell EVs to repair cellular damage. Scientific Reports. 2022;12(1):2019.
  48. Kim HK et al. Engineered small extracellular vesicles displaying ACE2 variants on the surface protect against SARS-CoV-2 infection. Journal of Extracellular Vesicles. 2022;11(1):e12179.
  49. Deschamps T, Kalamvoki M. Extracellular Vesicles Released by Herpes Simplex Virus 1-Infected Cells Block Virus Replication in Recipient Cells in a STING-Dependent Manner. Journal of Virology. 2018;92(18):e01102-18.
  50. Leite PEC et al. Suitability of 3D human brain spheroid models to distinguish toxic effects of gold and poly-lactic acid nanoparticles to assess biocompatibility for brain drug delivery. Particle and Fiber Toxicology. 2019;16(1):22.
  51. Kumarasamy M, Sosnik A. Heterocellular spheroids of the neurovascular blood-brain barrier as a platform for personalized nanoneuromedicine. iScience. 2021;24(3):102183.
  52. Liu L et al. The cytotoxicity of zinc oxide nanoparticles to 3D brain organoids results from excessive intracellular zinc ions and defective autophagy. Cell Biology and Toxicology. 2023;39(1):259-75.
  53. Venegas C, Heneka MT. Danger-associated molecular patterns in Alzheimer’s disease. Journal of Leukocyte Biology. 2017;101(1):87-98.
  54. Lester SN, Li K. Toll-Like Receptors in Antiviral Innate Immunity. Journal of Molecular Biology. 2014;426(6):1246-64.
  55. Slowikowski E, Willems C, Marques PE. Leukocyte recruitment in flavivirus-induced encephalitis. Frontiers in Immunology. 2025;16:1650903.
  56. Rendon-Mitchell B et al. IFN-γ Induces High Mobility Group Box 1 Protein Release Partly Through a TNF-Dependent Mechanism. The Journal of Immunology. 2003;170(7):3890-7.
  57. Schiraldi M et al. HMGB1 promotes recruitment of inflammatory cells to damaged tissues by forming a complex with CXCL12 and signaling via CXCR4. Journal of Experimental Medicine. 2012;209(3):551-63.
  58. Soong L et al. Type 1-skewed neuroinflammation and vascular damage associated with Orientia tsutsugamushi infection in mice. PLOS Neglected Tropical Diseases. 2017;11(7):e0005765.
  59. Shastri A, Bonifati DM, Kishore U. Innate Immunity and Neuroinflammation. Mediators of Inflammation. 2013;2013:1-19.
  60. Saifuddin M et al. Role of virion-associated glycosylphosphatidylinositol-linked proteins CD55 and CD59 in complement resistance of cell line-derived and primary isolates of HIV-1. The Journal of Experimental Medicine. 1995;182(2):501-9.
  61. Bennett JM, Reeves G, Billman GE, Sturmberg JP. Inflammation–Nature’s Way to Efficiently Respond to All Types of Challenges: Implications for Understanding and Managing “the Epidemic” of Chronic Diseases. Frontiers in Medicine. 2018;5:316.
  62. Deeks SG, Tracy R, Douek DC. Systemic Effects of Inflammation on Health during Chronic HIV Infection. Immunity. 2013;39(4):633-45.
  63. Zapata HJ, Shaw AC. Aging of the human innate immune system in HIV infection. Current Opinion in Immunology. 2014;29:127-36.
  64. Peluso MJ et al. Markers of Immune Activation and Inflammation in Individuals With Postacute Sequelae of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 Infection. The Journal of Infectious Diseases. 224(11):1839-48.
  65. Brodin P. Immune determinants of COVID-19 disease presentation and severity. Nature Medicine. 2021;27(1):28-33.
  66. Marcocci ME et al. Herpes Simplex Virus-1 in the Brain: The Dark Side of a Sneaky Infection. Trends in Microbiology. 2020;28(10):808-20.
  67. Hait AS et al. Defects in LC3B2 and ATG4A underlie HSV2 meningitis and reveal a critical role for autophagy in antiviral defense in humans. Science Immunology. 2020;5(54):eabc2691.
  68. Collins-McMillen D, Buehler J, Peppenelli M, Goodrum F. Molecular Determinants and the Regulation of Human Cytomegalovirus Latency and Reactivation. Viruses. 2018;10(8):444.
  69. Pizzigallo E, Racciatti D, Gorgoretti V. EBV CHRONIC INFECTIONS. Mediterranean Journal of Hematology and Infectious Diseases. 2010;2(1):e2010022.
  70. Piazzidan K et al. Immune and Immune-Integrated Organoids as NextGeneration Platforms for Disease Modeling. MedComm. 2025;6(12):e70531.
  71. Ormel PR et al. Microglia innately develop within cerebral organoids. Nature Communications. 2018;9(1):4167.
  72. Huang Y et al. Research Progress, Challenges, and Breakthroughs of Organoids as Disease Models. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 2021;9:740574.
  73. Chu JTS, Lamers MM. Organoids in virology. npj Viruses. 2024;2(1):5.
  74. Aguilar C et al. Organoids as host models for infection biology – a review of methods. Experimental & Molecular Medicine. 2021;53(10):1471-82.
  75. Volpato V et al. Reproducibility of Molecular Phenotypes after Long-Term Differentiation to Human iPSC-Derived Neurons: A Multi-Site Omics Study. Stem Cell Reports. 2018;11(4):897-911.
  76. Kim J, Koo BK, Knoblich JA. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2020;21(10):571-84.
  77. Sabate-Soler S, Kurniawan H, Schwamborn JC. Advanced brain organoids for neuroinflammation disease modeling. Neural Regeneration Research. 2023;19(1):154-5.
  78. Buonfiglioli A et al. A microglia-containing cerebral organoid model to study early life immune challenges. Brain, Behavior, and Immunity. 2025;123:1127-46.
  79. Zhu Z et al. Advances in the Development and Application of Human Organoids: Techniques, Applications, and Future Perspectives. Cell Transplantation. 2025;34:09636897241303271.
  80. Kistemaker L, Bodegraven EJ, Vries HE, Hol EM. Vascularized human brain organoids: current possibilities and prospects. Trends in Biotechnology. 2025;43(6):1275-85.
  81. Zhang S, Wan Z, Kamm RD. Vascularized organoids on a chip: strategies for engineering organoids with functional vasculature. Lab on a Chip. 2021;21(3):473-88.
  82. Kshirsagar et al. Multi-Region Brain Organoids Integrating Cerebral, Mid-Hindbrain, and Endothelial Systems. Advanced Science. 2025. Available from: https://advanced.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202503768.
  83. Zhao HH, Haddad G. Brain organoid protocols and limitations. Frontiers in Cellular Neuroscience. 2024;18.
  84. Gan Z et al. Recent advances in defined hydrogels in organoid research. Bioactive Materials. 2023;28:386-401.
  85. Shi H et al. Organoid intelligence: Integration of organoid technology and artificial intelligence in the new era of in vitro models. Medicine in Novel Technology and Devices. 2024;21:100276.
  86. Okamoto T et al. Integration of human inspection and artificial intelligence-based morphological typing of patient-derived organoids reveals interpatient heterogeneity of colorectal cancer. Cancer Science. 2022;113(8):2693-703.
  87. Kowalczewski A et al. Design optimization of geometrically confined cardiac organoids enabled by machine learning techniques. Cell Reports Methods. 2024;4(6):100798.

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