Un caso clinico di ascesso frontale causato da Nocardia concava in un paziente con AIDS

Sommario

Qui presentiamo un protocollo per le infezioni da Nocardia in pazienti immunocompromissi che integra la coltura di pus e la MALDI-TOF MS. Questo approccio combinato consente un'identificazione rapida e accurata delle specie, facilita la terapia antimicrobica mirata e, in definitiva, migliora gli esiti clinici in questa popolazione di pazienti ad alto rischio.

Abstract

Le specie di Nocardia sono actinomiceti aerobici obbligati. La nocardiosi umana si verifica tipicamente negli ospiti immunodepressi e si manifesta più comunemente come infezione polmonare suppurativa primaria. La disseminazione ematogena può portare a un coinvolgimento extrapolmonare, con il sistema nervoso centrale come sito secondario più frequente, seguito dalla pelle e dai tessuti molli sottocutaneo; pericardio, linfonodi e articolazioni sono colpiti solo raramente. Un uomo di 50 anni sieropositivo è stato ricoverato con una storia di 1 mese di vesciche orali di sangue ed ecchimosi agli arti. Un ascesso della fronte destra sviluppatosi durante il ricovero ha prodotto pus identificato come Nocardia concava tramite desorbezione laser assistita da matrice/spettrometria di massa a tempo di volo di ionizzazione (MALDI-TOF MS) e confermato dal sequenziamento del gene 16S rRNA. La gestione iniziale includeva terapia antiretrovirale, glucocorticoidi sistemici e immunoglobuline endovenose; Successivamente una terapia antimicrobica mirata con linezolide più trimetoprim-sulfametoxazolo, istituita su conferma microbiologica, portò a miglioramenti clinici e dimissioni. Per quanto ne sappiamo, questo è il primo caso segnalato di infezione da ascesso frontale causata da N. concava in un paziente con sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS). Le infezioni umane dovute a questo organismo rimangono estremamente rare. Inoltre, il sito dell'infezione in questo caso non era il polmone o il sistema nervoso centrale comunemente colpiti, tipicamente coinvolti nella nocardiosi, il che ha portato a manifestazioni cliniche atipiche soggette a diagnosi mancate o errate. In questo caso, un'identificazione eziologica precisa ha permesso una diagnosi definitiva precoce e risultati clinici favorevoli. Questo caso sottolinea l'importanza di una maggiore vigilanza per le rare infezioni da Nocardia nei pazienti gravemente immunodepressi. Per gli ascessi cutanei e dei tessuti molli inspiegabili, l'esame eziologico precoce è fondamentale, e una terapia antimicrobica mirata basata sulla suscettibilità ai farmaci può migliorare significativamente la prognosi.

Introduzione

Le specie di Nocardia sono actinomiceti aerobici ampiamente distribuiti nell'ambiente naturale, abitando comunemente il suolo e la materia organica in decomposizione. Sebbene siano ubiquitari in natura, sono tipicamente assenti nel corpo umano e funzionano come patogeni opportunisti. La maggior parte delle infezioni avviene tramite^{inalazione 1}. La nocardiosi colpisce prevalentemente individui immunocompromessi, in particolare coloro con immunità cellulare compromessa, come pazienti con neoplasie maligne, diabete mellito, HIV/AIDS, malattie autoimmuni, riceventi di trapianto di organi solidi e individui sottoposti a terapia prolungata con^{corticosteroidi 2}. Tuttavia, le infezioni possono verificarsi anche in individui privi di apparente^{immunodeficienza 3}. La nocardia invade principalmente attraverso le vie respiratorie, causando malattie polmonari, e può successivamente diffondersi ematogenamente causando il coinvolgimento degli organi extrapolmonari. Il cervello è il sito di disseminazione più comune, seguito dalla pelle e dai tessuti molli sottocutaneo; Meno comunemente, può coinvolgere il pericardio, i linfonodi e le articolazioni. Clinicamente, Nocardia può causare infiammazione granulomatosa supurativa acuta o cronica, localizzata o disseminata che coinvolge polmoni, pelle e sistema nervoso^{centrale 4}.

Ad oggi, le infezioni umane causate da N. concava sono state raramente segnalate. Qui presentiamo il primo caso documentato di ascesso frontale in un paziente sieropositivo attribuito a N. concava, offrendo preziose informazioni per la diagnosi e la gestione della nocardiosi.

Presentazione del caso:
Un paziente maschio di 50 anni è stato ricoverato nel nostro ospedale con una storia di un mese di vesciche orali di sangue e lesioni purpuriche agli estremi. Gli era stata diagnosticata un'infezione da HIV oltre dieci anni prima, ma non aveva seguito costantemente la terapia antiretrovirale. Circa un mese prima del ricovero, ha sviluppato ematomi orali e purpura degli arti senza un fattore scatenante identificabile ed è stato inizialmente curato in un ospedale locale con Biktarvy (bictegravir/emtricitabina/tenofovir alafenamide) per la terapia antiretrovirale. Sulla base di ulteriori indagini, si sospettò una trombocitopenia immunitaria (ITP) e ricevette una terapia con polso con metilprednisolone e immunoglobulina endovenosa (IVIG), insieme a protezione gastrica e integrazione di calcio.

A causa di trombocitopenia persistente, il paziente è stato indirizzato al nostro istituto per una gestione ulteriore. Al momento dell'ammissione, la sua temperatura corporea era di 37,9 °C; Era vigile, orientato e in condizioni generali discrete. Non è stato osservato ictero nella pelle o nella sclera. Sono state osservate petecchie ed echimosi diffuse su tutto il corpo, e una massa palpabile era presente sulla regione frontale destra. La TAC toracica senza contrasto ha rivelato cambiamenti interstiziali bilateralmente nei lobi inferiori e emfisema parasettale nei lobi superiori. L'ecografia addominale non ha mostrato anomalie significative.

Gli esami di laboratorio effettuati il giorno successivo hanno rivelato un conteggio piastrinico di 12 × 10⁹/L (83–303 × 10⁹/L), un livello di procalcitonina di 0,11 ng/mL (<0,50 ng/mL) e una proteina C-reattiva ad alta sensibilità (CRP) di 1,11 mg/L (<6,00 mg/L). Il conteggio assoluto dei linfociti T helper/inducer (CD3+, CD4+) era di 15 cellule/μL (550–1440 cellule/μL). I test quantitativi di reazione a catena della polimerasi (PCR) hanno rilevato DNA del virus Epstein-Barr (EBV) a 1,21 × 10⁴ IU/mL (0–200 IU/mL) e DNA umano di citomegalovirus (HCMV) a 4,53 × 10⁵ IU/mL (0–200 IU/mL), entrambi positivi; altri esami del sangue di routine erano poco particolari.

Data la viremia confermata per HCMV, il paziente è stato iniziato con una terapia antivirale combinata con ganciclovir e foscarnet, continuando però Biktarvy per la soppressione dell'HIV. Metilprednisolone a dose di polso e IVIG sono stati mantenuti per ITP. A causa della febbre persistente e bassa, il rituximab è stato somministrato al sesto giorno ospedaliero e il voriconazolo è stato iniziato al settimo giorno come profilassi contro la candidosi orofaringea.

Al momento del ricovero, l'esame fisico ha rivelato una massa sulla regione frontale destra (Figura 1). Al sesto giorno ospedaliero, materiale purulento è stato aspirato da questa lesione per una valutazione microbiologica. La colorazione diretta con Gram del pus ha mostrato abbondanti bacilli ramificati e filamentosi Gram-positivi (Figura 2). Una parte del campione è stata inoculata su piastre di agar sanguigno Columbia e incubata a 35 °C in un'atmosfera arricchita al 5–10% di CO₂. Dopo 24 ore di incubazione, sono state osservate colonie bianche, sollevate, secche, rugose, granulari e non emolitiche. Al quinto giorno di incubazione, le colonie hanno sviluppato una pigmentazione giallo pallido (Figura 3). La colorazione acido-fasta modificata dell'isolato ha prodotto organismi parzialmente acido-fastici e parzialmente non acido-fast (Figura 4).

La SM di Maldi-TOF utilizzando il sistema Autobio MS2000 ha identificato l'organismo come N. concava (Figura 5). Questa identificazione è stata successivamente confermata dal sequenziamento del gene 16S rRNA, che ha anche classificato l'isolato come N. concava. Sono stati effettuati test di suscettibilità agli antimicrobici, i risultati sono riassunti nella Tabella 1. I risultati di suscettibilità, interpretati secondo le linee guida CLSI M24 per Nocardia spp., indicavano suscettibilità a tutti gli agenti testati.

All'ottavo giorno ospedaliero, a seguito del rapporto di laboratorio di abbondanza di bacilli Gram-positivi, il voriconazolo è stato interrotto e è stata iniziata la terapia antimicrobica combinata con linezolide e trimetoprim–sulfametossazolo. La temperatura corporea del paziente si è gradualmente normalizzata e si è osservato un miglioramento clinico. Al giorno 18 ospedaliero, il paziente è stato dimesso in condizioni migliorate, con prescrizioni di linezolide orale e metilprednisolone per continuare il trattamento ambulatoriale.

Diagnosi, valutazione e piano:
Il paziente ha l'AIDS con un basso conteggio assoluto di cellule T-helper/inducer CD4+, predisponente a infezioni opportuniste. Il CMV e il DNA EBV rilevabili indicano una possibile replicazione attiva del citomegalovirus e del virus Epstein-Barr. L'esame fisico ha rivelato un ascesso della fronte destra e peteccioni/purpura sparsi. Il pus aspirato dall'ascesso frontale ha prodotto colonie identificate come N. concava dalla MALDI-TOF MS.

La TAC toracica ha mostrato cambiamenti interstiziali bilaterali del lobo inferiore; è necessario un follow-up per escludere nocardiosi polmonare o malattia polmonare interstiziale correlata all'HIV/CMV. L'ascesso è stato inciso e drenato, la trombocitopenia è stata gestita e il paziente è stato dimesso con linezolide orale più trimetoprim–sulfametossazolo per nocardiosi.

Il monitoraggio post-dimissione include emocromo settimanale e profili epatici/renali per monitorare la mielosoppressione e la sindrome infiammatoria da ricostituzione immunitaria; È necessaria una riospedalizzazione immediata se si manifestano febbre, nuovi noduli, sanguinamenti o sintomi neurologici.

Protocollo

I protocolli di studio sono stati approvati dal Comitato Etico Medico del Primo Ospedale Affiliato del College of Medicine dell'Università di Zhejiang. (Numero di riferimento: IIT20240874A).

1. Valutazione del paziente e valutazione iniziale

1. È stata ottenuta una storia medica completa.
   1. Un mese prima della presentazione, il paziente ha sviluppato vesciche orali di sangue ed ecchimosi agli arti senza alcun fattore scatenante identificabile.
   2. Il paziente successivamente si è rivolto a un ospedale locale, dove è stato avviato il Biktarvy come terapia antiretrovirale e gli sono stati somministrati agenti trombopoietici; tuttavia, non si ottenne alcun miglioramento ematologico.
2. Durante l'esame fisico, il paziente è stato osservato in uno stato febbrile di basso grado. Sono state osservate petecchie ed echimosi sparse su tutta la superficie del corpo, e una massa ben circonscrita era presente nella regione frontale destra.
3. Indagini di laboratorio
   1. Emocromo completo (enumerazione piastrinica): Il sangue intero (3 mL) è stato raccolto in un tubo contenente acido etilendediaminatetraacetico (EDTA), delicatamente invertito 8–10 volte e analizzato entro 4 ore dalla flebotomia.
   2. Saghi su proteine siero-reattive C-reattive e procalcitonina: Il sangue (2–3 mL) veniva prelevato in un tubo separatore siero, lasciato coagulare per 20–30 minuti, centrifugato a 1.500–2.000 g × per 10 minuti e analizzato il giorno della prelieva.
   3. Enumerazione citometrica a flusso dei sottoinsiemi di linfociti (CD3/4/8/16/19/45/56): Il sangue intero (3 mL) è stato raccolto in un tubo EDTA, delicatamente invertito 8–10 volte per garantire un'adeguata anticoagulazione e analizzato entro 24 ore dalla prelieva.
   4. Reazione a catena quantitativa della polimerasi (PCR) per il virus di Epstein–Barr e il DNA del citomegalovirus: Il sangue intero (3 mL) è stato prelevato in un tubo EDTA, delicatamente invertito 8–10 volte, mantenuto a 2–8 °C e trasportato entro 4 ore dalla preleva. Il plasma veniva separato tramite centrifugazione entro 2–4 ore dopo la flebotomia e conservato a 4 °C in attesa di analisi.

2. Procedure diagnostiche

1. Aspirazione guidata dall'ecografia di un ascesso della fronte destra:
   1. Dopo la normale disinfezione cutanea e la copertura sterile, è stata somministrata un'anestesia di infiltrazione locale con lidocaina al 2%. Sotto guida ultrasonografica in tempo reale, una siringa da 20 mL con ago attaccato veniva avanzata nell'ascesso frontale e 4 mL di liquido purulento venivano aspirati.
   2. Il paziente è rimasto stabile emodinamicamente e non ha riportato alcun fastidio durante tutta la procedura. Non sono state osservate complicazioni immediate nel periodo post-procedurale.
2. L'aspirato purulento è stato inviato al laboratorio di microbiologia per la colorazione immediata con Gram e la successiva coltura al 5–10% di CO₂ a 35 °C.
   1. Per la colorazione di Gram, prima prendi un vetrino pulito per preparare una macchia batterica, fissala sulla fiamma, poi applica una tinta viola cristallina per la macchia primaria per 1 minuto, seguita da un risciacquo con acqua.
   2. Poi, aggiungi la soluzione di iodio come mordente per 1 minuto e risciacqua con acqua. Poi decolora con etanolo al 95% per circa 20–30 secondi finché il deflusso non diventa incolore, e risciacquo immediatamente con acqua per evitare la decolorazione.
   3. Infine, controtingi con soluzione di safranina per 30 secondi a 1 minuto, risciacqua con acqua, asciuga con taponi e osserva al microscopio.
3. Un anello di colonie dalla piastra di agar sanguigno è stato selezionato e sottoposto a colorazione acido-fast modificata.
   1. Per una macchia acido-resistente modificata, prima si prende una vetrina pulita per preparare una macchia batterica, fissala sulla fiamma, poi copri la macchia con la macchia di carbol fucsina e riscalda finché il vapore non sale senza bollire, mantenendo per 3–5 minuti, seguita da un risciacquo con acqua.
   2. Poi, esegui una decolorazione debole con una soluzione acquosa all'1% di acido solforico per 30 secondi a 1 minuto finché la spalmatura non appare rosa chiaro, e risciacquare con acqua.
   3. Infine, controcolora con soluzione di blu di metilene per 30 secondi a 1 minuto, risciacqua con acqua, asciuga con tagli e osserva al microscopio.
4. L'identificazione è stata effettuata utilizzando un sistema automatico di identificazione microbica tramite spettrometria di massa, e l'isolato è stato identificato come N. concava.
   1. Preparazione del campione
      1. Preparazione della piastra bersaglio: Una singola colonia pura veniva raccolta con un bastone di bambù e spalmata uniformemente sul punto bersaglio della piastra MALDI.
      2. Aggiunta di acido formico: Dopo che la frota è stata asciugata all'aria, è stato aggiunto 1 μL di acido formico a ciascun punto bersaglio per la lisi cellulare.
      3. Aggiunta di matrice: Dopo che la macchia era stata completamente asciugata all'aria, 1 μL di soluzione matriciale (acido α-ciano-4-idrossicinnamico, HCCA) veniva immediatamente sovrapposto e la lastra veniva lasciata asciugare nuovamente all'aria.
   2. Accendi e configura il software.
      1. Accendi l'alimentazione dello strumento, la pompa a vuoto e il computer, e aspetta che il vuoto raggiunga lo stato di funzionamento. Avvia il software della workstation e accedi.
      2. Conferma la comunicazione normale tra il software e lo strumento e verifica che il vuoto, la temperatura e lo stato del laser siano tutti normali.
   3. Inserisci le informazioni nel software.
      1. Entra in scena il modulo di gestione delle placche target. Seleziona il tipo di piastra target, crea un nuovo lotto e inserisci le informazioni sul campione, inclusi ID campione, tipo, fonte e osservazioni.
      2. Salva le informazioni sulla targa target e seleziona il relativo database di identificazione per il confronto.
   4. Usa lo strumento e raccogli dati.
      1. Posiziona la piastra del bersaglio essiccata nella camera degli strumenti e chiudi la porta della camera. Seleziona Run Target Plate nel software e conferma l'ID e la posizione della targa target.
         NOTA: Il software completa automaticamente l'eccitazione laser, il volo degli ioni, l'acquisizione di segnali e la generazione dello spettro. È disponibile il monitoraggio in tempo reale dei progressi dell'acquisizione e della qualità dello spettro.
   5. Analisi e identificazione dei dati
      1. Elaborazione dello spettro: Il software esegue automaticamente smoothing, correzione di base ed estrazione dei picchi sullo spettro grezzo.
      2. Confronto database: Lo spettro di picco caratteristico processato viene confrontato con il database standard dello spettro dei batteri noti integrato nello strumento.
      3. Interpretazione dei risultati: Il software fornisce risultati e punteggi di identificazione basati sulla somiglianza del confronto. Generalmente, un punteggio ≥ 9,0 indica un'identificazione affidabile a livello di specie; un punteggio tra 6,0 e 8,9 indica l'identificazione a livello di genere; e un punteggio inferiore a 6.0 è considerato inaffidabile.
      4. Reportistica e gestione dei dati: Spettri grezzi, risultati di identificazione e log vengono salvati automaticamente. I dati possono essere esportati, analizzati statisticamente e interfacciati con il LIS.
   6. Procedura di spegnimento
      1. Dopo aver completato tutti i compiti, esci dall'interfaccia operativa. Entra in modalità standby nel software, aspetta che lo strumento si depressurizza in sicurezza, chiudi software e computer, e infine spegni l'alimentazione dello strumento e della pompa a vuoto.
5. Test di suscettibilità agli antimicrobici
   1. Scegliere le colonie e macinarle con una barra abrasiva o perline di vetro in acqua sterile per preparare una sospensione omogenea, regolare allo standard di torbidità McFarland di 0,5; poiché Nocardia tende a formare grumi, è necessario un accurato abrasivo per garantire una sospensione uniforme.
   2. Poi si aggiunge la sospensione batterica a ciascun pozzo della piastra di microdiluizione contenente il brodo Mueller-Hinton regolato per i cationi (CAMHB), si inocula 10 μL per pozzo per ottenere un inoculo finale di circa 1 ×^{10 5}–5 × 10⁵ CFU/mL, allestendo contemporaneamente un pozzo di controllo della crescita senza antibiotici e un pozzo di controllo negativo.
   3. Incubare la micropiastra a 35 ±± 2°C nell'aria ambiente per 3–5 giorni, mantenendo il coperchio della piastra sigillato durante l'incubazione per prevenire la disidratazione.
   4. Dopo l'incubazione, osserva la crescita batterica in ciascun pozzo a occhio nudo e registra la concentrazione minima di farmaco che inibisca completamente la crescita come concentrazione inibitoria minima (CMI).

3. Terapia antibiotica

1. Immediatamente dopo il ricovero, è stata avviata una terapia combinata antivirale e immunosoppressiva: sono stati somministrati ganciclovir più foscarnet insieme alla continuazione di Biktarvy per la soppressione dell'HIV, mentre la terapia con metilprednisolone e immunoglobulina endovenosa è stata avviata contemporaneamente.
2. Giorno 6: Febbre ricorrente e bassa ha portato all'aggiunta del rituximab al regime terapeutico.
3. Giorno 7: Per prevenire una possibile infezione fungina invasiva, è stato avviato il voriconazolo empirico.
4. Giorno 8: La microscopia ha rivelato abbondanti bacilli Gram-positivi; Il voriconazolo fu interrotto e la terapia antimicrobica fu prontamente sostituita con linezolide più trimetoprim-sulfametoxazolo. Successivamente, è scesa la defervescenza e lo stato clinico del paziente è progressivamente migliorato. È stato dimesso in ospedale al giorno 18 in condizioni stabili.

Risultati

Un paziente maschio sieropositivo di 50 anni si è presentato con peteccioni e echimosi generalizzate, oltre a herpes orale. Dopo il ricovero, ricevette terapie empiriche antivirali e trombopoietiche. L'esame fisico ha rivelato una massa sulla fronte destra. È stata eseguita un'aspirazione guidata da ultrasuoni (Figura 1) per ottenere pus da utilizzare per l'esame di laboratorio. I risultati della colorazione di Gram sono mostrati nella Figura 2, mentre quelli de...

Discussione

Nocardia è un batterio aerobico, Gram-positivo, classificato nel phylum Actinobacteria, classe Actinobacteria, sottoclasse Actinobacteridae, ordine Actinomicetali, sottoordine Corynebacterineae, famiglia Nocardiaceae e genere Nocardia¹⁵. Sono state identificate oltre 100 specie, con i patogeni più comuni in esseri umani e animali che sono N. asteroides, N. brasiliensis, N. farcini...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
5– Incubatore 10% CO2	Thermo Fisher Scientific	20172416507
Colorazione acida veloce	Baso	20170094
Serie Autof MS	Autobio Diagnostica	https://en.autobio.com.cn/Product/productDetail/fid/63/cid/2/id/145.html
Autof MS2000	Autobio Diagnostica	20182400196
Acido formico	Autobio Diagnostica	20140009
Gram Stain	BioMé rieux	20171067
&alfa;-ciano-4-idrossicanico	Autobio Diagnostica	20140009