Articolo metodologico

Strategia integrata UHPLC-MS/MS e HRMS per lo screening di composti potenzialmente epatotossici contenenti furano in Dioscorea bulbifera L.

DOI:

10.3791/70865

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19 maggio 2026

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1The First Affiliated Hospital of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, 2School of Pharmacy, Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Medicine and Health Management, Guizhou Medical University, 4Guizhou Provincial Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicine and TCM, Guizhou Medical University

In questo articolo

Sommario

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Questo studio ha sviluppato una strategia integrata che combina UHPLC–MS/MS e HRMS per lo screening di composti potenzialmente epatotossici contenenti furani in Dioscorea bulbifera L.

Abstract

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Dioscorea bulbifera L. (DBL), una medicina erboristica tradizionale utilizzata per trattare disturbi della tiroide e tumori, ha sollevato notevoli preoccupazioni sulla sicurezza a causa dei suoi potenziali effetti epatotossici. Ricerche precedenti suggeriscono che questo danno epatico possa essere associato all'attivazione metabolica dei composti contenenti furano (FCC) presenti nella DBL. Qui, abbiamo caratterizzato sistematicamente le FCC e i loro metaboliti reattivi nell'estratto DBL attraverso un approccio analitico integrato che combina cromatografia liquida ad altissima prestazione abbinata a spettrometria di massa tandem (UHPLC-MS/MS) e cromatografia liquida ad ultra-alte prestazioni abbinata a spettrometria di massa ad alta risoluzione tandem (UHPLC-HRMS). Utilizzando sia analisi mirate che non mirate a spettrometria di massa, abbiamo identificato un totale di 849 costituenti nell'estratto acquoso di DBL, inclusi 10 furanoditerpenoidi e 17 ulteriori FCC. Per chiarire le vie metaboliche di attivazione, abbiamo utilizzato glutatione (GSH) e 4-bromobenzilamine (BBA) come agenti di doppia trappolazione all'interno di un sistema di incubazione microsomale del fegato (MLM) del topo. Attraverso il metabolismo mediato da P450, sette addotti corrispondenti derivati da diosbulbina B (DSB), C (DSC), D (DSD), E (DSE), L (DSL), N (DSN) e 2-pentilfurano sono stati intrappolati e caratterizzati con successo. Questo studio stabilisce un approccio sensibile e specifico per la profilazione completa di potenziali composti epatotossici del furano nella DBL, fornendo preziose informazioni sulla formazione di metaboliti reattivi e sui meccanismi di tossicità correlati alla medicina erboristica contenente furano.

Introduzione

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Le preoccupazioni di sicurezza legate alla medicina tradizionale cinese (MTC), in particolare al danno epatico indotto da farmaci (DILI), ostacolano la loro ampia utilità clinica e la loromodernizzazione 1,2,3. Crescenti evidenze suggeriscono che la maggior parte dei componenti della MTC non è intrinsecamente tossica; invece, la loro epatotossicità deriva dall'attivazione metabolica in vivo 1,4,5. I composti contenenti furano (FCC) sono ben riconosciuti come precursori epatotossici prominenti, subendo attivazione metabolica mediata da P450 per produrre intermediari elettrofili altamente reattivi, in particolare cis-enediali, fondamentali per l'inizio della tossicità epatica. Questi metaboliti elettrofili formano addotti covalenti con tioli di cisteina e gruppi amminoli di proteine essenziali, facilitando così la progressione degli effetti tossici 6,7,8.

Nella MTC, Dioscorea bulbifera L. (DBL) è stata ampiamente utilizzata per il trattamento di disturbi della tiroide, tumori e malattie della pelle 9,10. Un totale di 152 costituenti chimici sono stati isolati e caratterizzati dalla DBL, inclusi 41 furanoditerpenoidi11. Tra questi, la diosbulbina B (DSB), un componente bioattivo importante, è stato dimostrato di indurre lesioni epatiche nei modelli murini, un effetto strettamente legato alla formazione del cis-enediale (DDE) derivato dal DSB12,13. Guidata dai progressi nella strumentazione analitica, la spettrometria di massa è diventata uno strumento importante per analizzare componenti chimici complessi e metaboliti dellaMTC 14,15. Convenzionalmente, i cis-enedial prodotti dal metabolismo del DSB vengono rilevati intrappolando specie elettrofile con N-acetil-L-lisina in combinazione con glutatione o N-acetil-L-cisteina, seguiti dall'analisi LC-MS/MS dei derivati chimicamente stabili delpirrol risultanti 16,17. Sulla base di questo approccio, abbiamo precedentemente sviluppato una strategia migliorata che impiegava la cattura simultanea di intermediari metabolici derivati dal furano con GSH e BBA, abbinata all'analisi LC-MS/MS utilizzando una scansione a perdita neutra di 129 Da e una scansione ionica precursore di m/z 272 per gli addotti GSH, insieme a una scansione ionica precursore 1:1 di m/z 169 e 171 derivata dalla parte BBA per il rilevamento del pirrolo (Figura 1)18, 19. Sebbene efficace per furanoidi noti, questo approccio presenta limitazioni notevoli quando applicato a miscele complesse, in particolare per FCC privi di informazioni strutturali pregresse. Pertanto, rimane l'urgente necessità di una strategia analitica completa in grado di consentire una caratterizzazione chimica approfondita di matrici complesse della MTC, supportando allo stesso tempo uno screening efficiente dei precursori epatotossici.

Qui, riportiamo una strategia integrata per la caratterizzazione sistematica delle FCC potenzialmente epatotossine nella DBL (Figura 2). La strategia prevede tre passaggi chiave: (i) profilazione chimica completa dell'estratto acquoso di DBL utilizzando metabolomica (WTM) ampiamente mirata basata su UHPLC–MS/MS; (ii) catturato di intermediari reattivi generati dalle FCC con GSH e BBA; e (iii) rilevamento e elucidazione strutturale degli addetti GSH/BBA formati tramite attivazione metabolica di costituenti potenzialmente tossici utilizzando HPLC–MS/MS e UHPLC–MS/MS. Questo approccio integrato consente l'identificazione inequivocabile dei principali precursori tossici responsabili dell'epatotossicità indotta dalla DBL da matrici complesse della MTC e fornisce un quadro altamente sensibile e specifico per la valutazione della sicurezza della MTC.

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Protocollo

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NOTA: I reagenti e le attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione della soluzione di test DBL

  1. Raccogli e autentica tre lotti dei tuberi di Dioscorea bulbifera L. Seguendo la Specifica Nazionale per la Lavorazione della MTC, rimuovere le radici fibrose dai tuberi, lavarle per rimuovere lo sporco, tagliarle in fette circolari spesse 1 cm mentre sono fresche, asciugare le fette in un forno ad aria forzata a 60 °C, poi toglierle e raffreddarle a temperaturaambiente di 20.
  2. Pesa 200 g di DBL per ogni lotto e macinale in una polvere grossolana (dimensione particella 250-850 μm) utilizzando un frantoio ad alta velocità.
  3. Immergi 20 g di polvere grezza in 200 mL di acqua deionizzata (1:10, p/v) per 30 minuti. Contemporaneamente, si lavora una miscela dei tre lotti di polvere grossolana preparata nel passaggio 1.2 (miscelata in un rapporto 1:1:1, a w).
  4. Estrai il materiale imbevuto riscaldando sotto reflusso per 60 minuti. Filtra l'estratto con garza o un setaccio per rimuovere residui insolubili. Aggiungi 200 mL di acqua deionizzata al residuo rimanente e ripeti l'estrazione del reflusso due volte, ciascuna per 60 minuti. Combina tutti e tre i filtrati e concentra l'estratto accumulato ebollindo fino a un volume finale di 100 mL.
  5. Trasferire l'estratto concentrato in un liofilizzatore a vuoto e liofilizzare per ottenere la polvere.
  6. Pesa con precisione 18 mg di ogni lotto di polvere estratta. Sciogliete ciascuno in 1,5 mL di acetonitrile al 50% e vortice la miscela per 30 secondi per garantire l'omogeneità.
  7. Centrifugare la soluzione a 13.800 x g per 10 minuti a 4°C e raccogliere il sovrantantante come soluzione di incubazione MLM.
  8. Pipetta 20 μL della soluzione originale, diluisci a 1:50 con il 50% di acetonitrile e vortice per 30 secondi. Successivamente si filtra la soluzione attraverso una membrana microporosa da 0,22 μm per ottenere il campione pronto all'analisi spettrometrica di massa.

2. Caratterizzazione chimica della DBL

  1. Condizioni cromatografiche
    1. Usa una colonna C18 (2,1 mm x 100 mm, 1,8 μm) e imposta la temperatura del forno a 40 °C. Preparare la fase mobile A come acido formico allo 0,1% (v/v) in acqua e la fase mobile B come acetonitrile.
    2. Programmare l'eluzione del gradiente come segue: 0–10 min, 2%–50% B; 10–11 minuti, 50%–95% B; e 11–13 min, 95% B. Imposta la portata a 0,4 mL/min e inietta 2 μL del campione.
  2. Eseguire analisi spettrometriche di massa utilizzando i seguenti parametri: Sorgente ionica: ionizzazione elettrospray IonDrive Turbo V (ESI); Modalità acquisizione: monitoraggio delle reazioni multiple (MRM) con acquisizione simultanea nelle modalità ioniche positive e negative; Tensione di spruzzatura ionica: +5,5 kV (positivo) / −4,5 kV (negativo); Gas a tendina: 35 psi; Temperatura di sorgente: 400 °C; Gas sorgente ionica 1: 60 psi; Gas sorgente ionica 2: 60 psi; Potenziale di declustering (DP): ±100 V.
  3. Elaborazione dei dati
    1. Acquisire e processare i dati MRM utilizzando il software SCIEX Analyst (v1.6.3). Converti i file di dati grezzi (.wiff) in formato TXT usando MSConvert. Annota i composti rilevati interrogando la libreria proprietaria BiotreeDB (V2.1) MS. L'annotazione si basava sull'abbinamento dei tempi di ritenzione (RT), dei rapporti massa-carica (m/z) e dei pattern di frammentazione con standard autentici.

3. Caratterizzazione dei coniugati GSH/BBA generati nelle incubazioni MLM

  1. Incubazione MLM
    1. Scongelare lentamente la sospensione microsomica del fegato del topo sul ghiaccio. Sul ghiaccio, preparare la miscela di incubazione in un tubo microcentrifuga da 2 mL aggiungendo sequenzialmente i componenti elencati di seguito. Aggiungi per ultimo il sistema rigenerante NADPH. Per il gruppo di controllo, sostituire il sistema rigenerante NADPH con un volume uguale di PBS ghiacciato. Vortice per un breve periodo di miscelazione.
      1. Prepara una miscela di incubazione composta dai seguenti componenti: Sospensione microsomica del fegato di topo (MLM, proteina 4 mg/mL): 125 μL; Soluzione di cloruro di magnesio (MgCl₂) (32 mM): 10 μL; DBE (12 mg/mL) o soluzione standard DSB (35 mM): 10 μL; Soluzione di glutatione (GSH) (50 mM): 100 μL; Soluzione BBA (250 mM): 10 μL; PBS buffer (pH 7,4, contenente 1,0 mol/L EDTA e 0,1 mol/L K2HPO 4): 145 μL; Soluzione del sistema rigenerante NADPH (5,0 mM): 100 μL.
    2. Immediatamente al termine dell'incubazione, rimuovere tutti i tubi dall'incubatrice. Terminare la reazione enzimatica aggiungendo 1 mL di acetonitrile gelato (-20 °C) a ogni provetta.
    3. Vortice per 3 minuti per precipitare le proteine. Centrifuga a 13.800 x g per 10 minuti a 4 °C.
    4. Raccogli il surnadante, filtra attraverso una membrana da 0,22 μm e trasferisci il filtrato in una fiala autocampionatore.
  2. Screening preliminare dell'incubazione MLM di estratti DBL tramite HPLC-MS/MS
    1. Condizioni cromatografiche
      1. Usa una colonna C18 (150 mm x 4,6 mm, 3 μm) e imposta la temperatura della colonna a 25 °C. Preparare la fase mobile A come acido formico allo 0,1% (v/v) in acqua e la fase mobile B come acetonitrile.
      2. Esegui la seguente pendenza: 0–2 min, 10% B; 2–15 min, aumento lineare dal 10% al 90% B. Impostare la portata a 0,8 mL/min e iniettare 5 μL del campione preparato.
    2. Condizioni di spettrometria di massa. Imposta la gamma di scansione completa su m/z 500–1000. Scansioni a ioni precursori (PI) a m/z 169 e 171, e una scansione a perdita neutra (NL) di 129 Da in modalità ionica positiva, e una scansione PI a m/z 272 in modalità ionica negativa. Impostare i parametri chiave come segue: tensione di spruzzatura ionica (IS), +5.500 V (positivo) / −4.500 V (negativo); potenziale di declustering (DP), ±70 V; potenziale d'ingresso (EP), ±10 V; energia di collisione (CE), +35 V (positivo) / −40 V (negativo); potenziale di uscita della cella di collisione (CXP), ±10 V; gas sorgente ionica 1 e 2 (GS1/GS2), 50 psi ciascuno; gas da tenda (CUR), 40 psi; e la temperatura di sorgente (TEM), 650 °C.
    3. Acquisire e elaborare tutti i dati di spettrometria di massa utilizzando il software SCIEX Analyst (v1.6.3).
  3. Identificazione di derivati del pirrol e FCC da parte di UHPLC-HRMS
    1. Condizioni cromatografiche
      1. Usa una colonna C18 (2,1 mm x 100 mm, 1,9 μm) e imposta il forno a colonna a 30 °C. Preparare la fase mobile A come acido formico allo 0,1% (v/v) in acqua e la fase mobile B come acetonitrile.
      2. Programma il gradiente come segue: 0-20 min, 5%-95% B; 20-21 min, 95% B. Imposta la portata a 0,3 mL/min e inietta 2 μL del campione.
    2. Eseguire analisi spettrometriche di massa con i seguenti parametri: Sorgente ionica: ESI; tensione di spruzzatura degli ioni: +3,5 KV (ioni positivi)/-2,5 KV (ioni negativi); temperatura capillare: 320 °C; temperatura del riscaldatore a sonda: 350 °C; Gas di guaina: 10 arb; corrente massima di spruzzo: 100 μA; Livello RF dell'obiettivo S: 50%; energia di collisione: 35 V (ioni positivi) e 40 V (ioni negativi); Portata di scansione: 100-1000 m/z.
    3. Preprocessing dei dati
      1. Sulla base delle FCC identificate dal DBL e del meccanismo di trappolamento (Figura 1), estraggi i coniugati GSH/BBA previsti utilizzando ChemBioDraw Ultra 14.0 (Figura Supplementare 1).
      2. Importa i file grezzi HRMS acquisiti (.raw) nel modulo Qual Browser di Xcalibur (V4.1). Crea un flusso di lavoro di identificazione nel software per selezionare i coniugati GSH/BBA.
      3. Confrontare gli spettri sperimentali MS1 e MS2 con le strutture previste dei coniugati GSH/BBA derivate dalle FCC (previste tramite ChemBioDraw Ultra 14.0) basandosi sui meccanismi di adduzione noti (Figura 1 e Figura Supplementare 1). Utilizzare una soglia minima di intensità di picco di 1 x 105 e una tolleranza di accuratezza di massa di ± 10 ppm per tutti gli ioni monitorati. Confermare i coniugati basandosi sul caratteristico schema isotopico del bromo (circa 1:1) osservato sia negli spettri MS1 che MS2 , inclusi ioni diagnostici a m/z 169 e 171.
      4. Determinare i pesi molecolari delle FCC genitori sottraendo la massa del tag GSH/BBA dagli ioni molecolari osservati. Usa 472/474 Da (C17H21O5N4BrS) per la sottrazione.
      5. Caratterizzare le FCC principali in DBL tramite UHPLC–HRMS sulla base dei risultati ottenuti sopra.

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Risultati

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FCC identificate nella DBL
Per caratterizzare il profilo chimico della DBL, è stata utilizzata una combinazione di profilazione WTM a tripla quadrupola e HRMS. Questo doppio approccio ha permesso un'analisi completa delle coppie di ioni estratte, generando cromatogrammi ionici estratti (EIC, Figura 3A) altamente informativi e cromatogrammi ionici totali (TIC, Figura 3B). Nelle condizioni cromatografiche e di ...

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Discussione

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Le precedenti indagini sull'epatotossicità della DBL si sono concentrate principalmente sugli intermediari metabolici delle singole FCC utilizzando strategie di catturamirate 9,22. Sebbene questi approcci forniscano preziose intuizioni meccanicistiche, la loro efficacia in matrici erboristiche complesse è spesso limitata dalla scarsa rilevabilità degli intermediari bioattivati a bassa abbondanza. Nel presente studio, abbiamo svil...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro fu sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (n. 82360759), dalla Natural Science Foundation della provincia del Guizhou (n. ZK [2024]406, ZK [2024] 397, Postdoctoral Station [2021]007, BSH [2024]005), e l'Università di Medicina Tradizionale Cinese del Guizhou TD Hopes [2023]005.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
4-bromobenzilamminaJiuding Chemical (Shanghai) Technology Co., LtdX114214A
AcetonitrileSigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd1000294000
CentrifugaWuxi BaiTaKe Biotechnology Co., LtdCR3180
Cromatografica  campione  BottiglieZhejiang ALWSCI Technology Co., LtdC0000008
Diosbulbina BChengdu PufeiDe Biotech Co., Ltd18022603
Dioscorea bulbifera L.-DBL-1; DBL-2; DBL-3I materiali vegetali sono stati autenticati dal Prof. Weike Jiang (Università di Medicina Tradizionale Cinese di Guizhou, Guiyang, Cina), con campioni di riferimento depositati presso il Laboratorio Chiave di Farmacologia di Base della provincia di Guizhou.
Bilanciamento elettronicoFabbrica di Strumenti Elettronici di Shanghai AntingFA1004B
Acido formicoThermo Fisher Scientific Co., Ltd195715
GlutationeSigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., LtdSLBX5462
Alta velocità   FrantumatoreYongkang Biao Hardware Products Co., LtdXC-2000Y
Microsomi del fegato dei topi di Kunming (maschi)Dalian Meilun Biotechnology Co., Ltd.MB12496-1
Cloruro di magnesioBeijing Solarbio Science & Technology Co., LtdM8161
MetanoloSigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd646377
Filtro milliporoTianjin Jinteng Experimental Equipment Co., LtdNylon66
NADPH Na4Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd102X022
FornoStrumento di laboratorio e strumenti di laboratorio di Tianjin Equipment Co., LtdGFL125
Soluzione salina tamponata con fosfatoBeyotime Biotechnology  Co., LtdC0221B
Termostatico  acqua  bath  oscillatoreShanghai Zijia Instrument Co., LtdTHZ-82A
Ultra-freezerThermo Fisher Scientific Co., LtdTDE60086FV-ULTS
Purificatore a ultrasuoniShanghai Zijia Instrument Co., LtdL10-250A
Miscelatore a vorticeFabbrica di Strumenti Medici Jiangsu HaimenVM-D

Riferimenti

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