Articolo metodologico

Un modello oromucosale porcine ex vivo standardizzato per la valutazione dei flussi peptidici

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DOI:

10.3791/70935

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9 giugno 2026

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1UCD School of Veterinary Medicine and UCD Conway Institute, University College Dublin, 2UCD School of Mechanical and Materials Engineering, University College Dublin

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive una piattaforma di screening che utilizza mucose epiteliali buccali suiniforme appena isolate per valutare la permeazione peptidica. Il metodo integra la permeazione di un GLP-1RA in presenza di un potenziatore di permeazione proveniente da soluzioni, camere Hilltop e film in cellule di diffusione Franz, e inserti stampati in 3D, accompagnati da una valutazione istologica della mucosa.

Abstract

La somministrazione oromucosa di farmaci in film, compresse, pastille e altre forme di dosaggio offre una via sistemica comoda per pazienti pediatrici e anziani, e per chi non riesce a ingoiare facilmente capsule o compresse. Lo sviluppo di formulazioni peptidiche buccali e sublinguali richiede modelli preclinici che si allineino alle strutture epiteliali oromucose non cheratinizzate dell'uomo, tra cui maiali e cani sono i più adatti. Abbiamo procurato tessuti oromucosi freschi scartati da un macello. Le mucose sono state sezionate dal muscolo liscio sottostante tramite riscaldamento controllato e poi montate in cellule di diffusione Franz o in nuovi inserti a basso volume stampati in resina con resina. Combinazioni di potenziatori peptidico-permeazione sono state aggiunte sul lato donatore e le molecole permeate sono state campionate dal lato ricevente e quantificate tramite cromatografia liquida ad altissima prestazione (uHPLC). Per gli inserti, i valori di resistenza elettrica transepiteliale (TEER) delle mucose montate sono stati misurati utilizzando elettrodi a bacchetta EVOM. L'istologia tissutale è stata esaminata dopo l'incubazione sia nelle cellule di diffusione di Franz che negli inserti 3D. La concentrazione ottimale di potenziatore di permeazione è stata scelta quando miscele acquose di peptide e potenziatore hanno prodotto un aumento della permeazione. La permeazione peptidica ha raggiunto il 4,3% in 3 ore negli inserti tridimensionali (3D) e l'1,7% nei modelli a camera Hilltop, quest'ultimo simulando l'esposizione diretta da un film buccale. Sono stati sviluppati e applicati film mucoadesivi polimerici strato per strato contenenti combinazioni peptidico-potenziatore ai tessuti mucosi per studi di permeazione utilizzando camere di diffusione. La permeazione peptidica ex vivo attraverso le mucose buccali suine ha raggiunto il 2% quando le mucose sono state esposte alla combinazione ottimale di glicosossicolato (GDC) incorporata nei film buccali. Questi studi di screening ex vivo forniscono un percorso per la successiva valutazione farmacocinetica di formulazioni di film carichi di peptidi somministrate tramite la via oromucosa in maiali e persone.

Introduzione

Le oromucose buccali e sublinguali sono vie interessanti per la somministrazione orale dei farmaci perché offrono siti direttamente accessibili e l'evitamento del metabolismo epatico di primo passaggio, potenzialmente migliorando la biodisponibilità e l'accettabilità da parte del paziente rispetto ad altre vie, inclusa lavia orale 1,2. I peptidi vengono generalmente somministrati per iniezione rispetto all'amministrazione orale a causa della scarsa permeazione attraverso l'epitelio intestinale, a causa del loro maggiore peso molecolare, idrofilicità e suscettibilità alla degradazioneenzimatica 3. La FDA ha approvato 102 peptidi per applicazioni terapeutiche, con ~450 peptidi terapeutici in fase di valutazione in studi preclinici oclinici 4. Queste includono compresse orali formulate con potenziatori di permeazione (ad esempio, semaglutide, Rybelsus)5 e piattaforme oromucose (Minirin Melt e acetato sublinguale di desmopressina Nocdurna) sviluppate utilizzando la tecnologia Zydis per compresse orali disintegranti (ODT) di Catalent 6. Nonostante un'ampia indagine sugli studi sulla permeabilità bucale dei farmaci, i valori di permeabilità delle molecole mostrano scarsa riproducibilità e una comparabilità limitata negli studi 7,8. Queste incongruenze derivano in gran parte da variazioni nei modelli animali sperimentali utilizzati e da differenze nella manipolazione e preparazione delle mucose buccaliisolate 9.

I sagaggi di permeabilità ex vivo utilizzando mucose buccali e sublinguali isolate sono uno strumento prezioso per prevedere la permeabilità in vivo delle piccole molecole oromucose e per lo screening preclinico dei componenti di formulazione rilevanti per le formedosologiche 10,11,12; tuttavia, il loro utilizzo nello screening peptidico è stato limitato perché la permeabilità basale è trascurabile. Negli ultimi anni, la mucosa buccale suina è diventata il modello preferito perché la sua struttura non cheratinizzata e le sue caratteristiche fisiologiche e biochimiche somigliano molto a quelleumane 13. I campioni bucali dei cani sono ancora meno accessibili rispetto al tessuto suino dei macelloni, anche se entrambe le fonti sono14 non cheratinizzate. Persiste una notevole variabilità nello spessore epiteliale e nei metodi di lavorazione. La standardizzazione della preparazione oromucosa bucale e sublinguale è essenziale. Variabili come le condizioni di conservazione a breve e lungo termine, lo spessore del tessuto e il mantenimento della vitalità durante gli esperimenti influenzano tutte i risultati della permeabilità ex vivo 8. La conservazione dei tessuti è fondamentale, poiché sia l'integrità strutturale che l'attività metabolica della mucosa influenzano direttamente i profili didiffusione 12,15. La perdita della funzione barriera può portare a tassi di permeazione artificialmenteelevati del farmaco 16,17. Oltre alla conservazione, il metodo utilizzato per dissezionare le mucose buccali suine da montare nelle camere di permeazione introduce ulteriore variabilità. Le differenze nella rimozione del tessuto connettivo sottomucoso, sia per mezzi meccanici, chimici o termici, possono alterare lapermeabilità 18. Sebbene alcuni rapporti suggeriscano che la separazione del calore per isolare l'epitelio dal muscolo liscio preservi lapermeabilità 19, manca un consenso. Attualmente, non esiste un metodo universalmente accettato per dissezionare e valutare l'integrità delle mucose buccaliisolate 20. Lo zucchero idrofilo etichettato fluoresceina isotiocianato-destrono (FITC dextrano 4000, FD-4) è comunemente utilizzato come marcatore di integrità per la mucosa buccale suina perché solo piccole molecole sotto ~500 Da possono permeare passivamente il tessuto. Al contrario, una mucosa intatta limita il trasporto FD-4, e un trasferimento da donatore a ricevente sotto lo 0,6% è tipicamente considerato accettabile in 2-4 ore21,22. Inoltre, la colorazione del tessuto con ematossilina ed eosina fornisce una valutazione semplice della morfologiaepiteliale 23.

In questo lavoro, abbiamo stabilito un protocollo standardizzato per la gestione della mucosa delle mucose buccali suine isolate, progettato per ottimizzare l'integrità e la permeabilità mucosa per un periodo prestabilito. I nostri obiettivi erano fornire un quadro sperimentale per dissezionare il tessuto epiteliale bucale suino e migliorare l'affidabilità delle valutazioni di permeabilità ex vivo dei peptidi tra oromucose montate in camere di diffusione e inserti. Abbiamo prima condotto analisi visive per identificare la mucosa buccale priva di danni proveniente dal mattatoio. Abbiamo ottimizzato le tecniche di lavorazione dei tessuti, lo spessore della mucosa e i metodi per mantenere l'integrità dei tessuti durante gli esperimenti. Utilizzando un agonista stabile e a bassa potenza del recettore peptide-1 simile al glucagone (GLP-1 RA) come molecola strumento, abbiamo condotto studi di permeazione peptidica in presenza e assenza di un potenziatore della permeazione del sale biliare, glicodesossicolato di sodio (GDC), su mucose bucali montate in cellule di diffusione di Franz e su inserti personalizzati stampati in 3D di tipo transwell. GDC e GLP-1 RA sono stati presentati a mucose buccali provenienti da soluzioni, camere Hilltop e film polimerici bistrato mucoadesivo. Abbiamo utilizzato marcatori di permeabilità, istologia tissutale e valori di resistenza elettrica trans-epiteliale/endoteliale (TEER) come principali parametri di valutazione.

Protocollo

Le guance di maiale utilizzate in questo studio furono raccolte in un macello locale; pertanto, non era richiesta alcuna approvazione etica.

1. Isolamento, preparazione e conservazione dell'epitelio buccale suino

  1. Raccogliere tessuti delle guance di maiale da un mattatoio locale e trasportarli entro 90 minuti al laboratorio in soluzione salina fosfato ghiacciata (PBS, pH 7,4). Entro i successivi 60 minuti, preparare i tessuti secondo la metodologia precedentementedescritta 19,24, con modifiche minori per diversi siti oromucosi come mostrato nella Figura 1.
  2. Utilizzando un bisturi, separare le mucose buccali dal tessuto sottostante e risciacquare il tessuto tre volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Scartare le mucose con danni alla superficie visiva.
  3. Immergi mucose intatte in PBS a 65 °C per 3 minuti e separi l'epitelio e il tessuto connettivo sottostante residuo dal muscolo liscio usando una pinza da orologiaio taglia 5. Questo metodo è anche applicabile per isolare mucose epiteliali sublinguali e linguali.
  4. Asciugare delicatamente le oromucose dissezionate su carta filtrante di cellulosa e procedere con gli studi di permeazione (opzione preferibile) oppure congelare per un massimo di 4 settimane.
  5. Per il processo di congelamento dopo la separazione, immergi oromucose per 2 ore in un crioprotettivo, 85% glicerolo25, con una lieve scuotita. Il glicerolo ad alta viscosità sostituisce l'acqua intercellulare per prevenire la formazione di cristalli d'acqua, che potrebbero danneggiare la struttura tissutale.
  6. Dopo questo periodo, sostituisci il glicerolo con PBS fresco e glicerolo al 10%. Congelare i campioni mucosi a -20 °C o -70 °C, a seconda della durata di conservazione richiesta. Eseguire la procedura di congelamento a una velocità controllata di ~-1 °C·min-1.
    NOTA: Tutti gli esperimenti sono condotti utilizzando almeno tre esemplari di tessuti provenienti dalle guance di diversi animali.

2. Studio di permeazione ex vivo nelle mucose montate in celle di diffusione di Franz e uso di camere Hilltop per presentare GLP-1 RA e GDC

NOTA: Gli studi di permeabilità ex vivo vengono effettuati inizialmente su mucose buccali suine appena isolate utilizzando cellule di diffusione di Franz (FDC).

  1. Montare le mucose del tessuto dissezionato in camere (area finestra 1,2cm 2) mostrata nella Figura 2 e bilanciare per 30 minuti con PBS, pH 6,8 (lato donatore, volume 1 mL) e PBS, pH 7,4 (lato ricevitore, volume 10 mL).
  2. Dopo 30 minuti di equilibrio, sostituire la soluzione donatrice PBS (pH 6,8) con 1 mL di PBS contenente un rapporto 1:1 tra GLP-1RA (25 mg/mL) e GDC (25 mg/mL).
  3. Continua a mescolare la camera del ricevitore con 10 mL di PBS pH 7.4, mantenuto a 37 °C a 300 giri/min. Campionare 1 mL dal compartimento ricevitore ogni 60 minuti per 180 minuti. Preleva campioni triplicati dai compartimenti donatori all'inizio e alla fine dell'esperimento. Dopo ogni campionamento, rifornire le camere con 1 mL di PBS.
  4. Al termine dell'esperimento, conservare il tessuto nel 10% di formalina per l'istologia oppure omogeneizzarlo per quantificare il peptide GLP-1RA rimasto nel tessuto.
  5. Analogamente, si verifica la permeabilità del GLP-1RA utilizzando camere Hilltop (HTC).
    NOTA: Lo scopo dell'uso dell'HTC è confermare l'effetto oromucoso di potenziamento della permeazione della GDC sulla GLP-1 RA in soluzione prima di formulare un film buccale a due strati. L'HTC è una camera costruita con Kraton G-2705, un copolimero biocompatibile stirene-etilene-butilene-stirene (SEBS), con un diametro esterno di 19 mm, e contiene un tampone Webril (diametro 12,7 mm) composto al 100% da fibre di cotone non intrecciate, che funge da materiale assorbente antiaderente per l'applicazione insoluzione 26.
  6. Allo stesso modo, si valuta la permeabilità ex vivo di GLP-1RA e GDC (rapporto 1:1) caricati in film mucoadesivi bistrato posizionando i film nelle camere donatrici dei FDC o in inserti 3D, come descritto per l'HTC.
  7. Per confermare l'integrità del tessuto epiteliale bucale suino, si utilizza FD-4 (0,05 mM) come indicatore di flusso fluorescente e aggiungilo sul lato donatore per valutare la perdita nel tessuto.
    NOTA: I tessuti che mostrano perdite sono esclusi dai calcoli della permeabilità.
  8. Dopo l'esperimento di 3 ore, quantificare il flusso cumulativo di GLP-1 RA tramite analisi uHPLC dei campioni da 200 μL prelevati dal compartimento basolaterale in triplice. Ripeti tutti gli esperimenti di permeazione tre volte. Quantificare il flusso cumulativo di GLP-1RA da una curva di calibrazione generata da concentrazioni prestabilite di GLP-1RA.

3. Preparazione di pellicole buccali intrappolate con GLP-1RA e GDC

NOTA: I film a doppio strato bucale contenenti uno strato mucoadesivo e uno strato di supporto sono prodotti utilizzando colata a solvente con un rivestimentosemi-automatizzato 27.

  1. Prepara un film a due strati per intrappolare il GLP-1RA utilizzando HPMC e PVP-K90 come polimeri formatori di pellico, e un componente mucoadesivo, Na-CMC.
    NOTA: Consulta la Tabella 1 per la composizione dello strato mucoadesivo e di supporto del film buccale. La GDC è incorporata con un peptide GLP-1 RA in film modello in basse quantità di mg per osservare il suo effetto sulla permeazione peptidica attraverso le mucose buccali suine montate in camere.
  2. Preparare lo strato mucoadesivo dissolvendo i polimeri formanti pellicola, 45 mg di HPMC, 10 mg di Na-CMC e 25 mg di PVP-K90, in acqua deionizzata contenente il 3% di glicerolo a 400 giri/min per 10 minuti utilizzando un agitatore magnetico a piastra riscaldante.
    NOTA: HPMC è solubile a temperatura ambiente, mentre PVP-K90 richiede riscaldamento a 40 °C per 30 minuti per dissolversi.
  3. Aggiungere 2 mg di Aerosil 200 F sotto mescolatura, seguiti dall'aggiunta del GLP-1 RA. Poi aggiungi GDC e disperdi a 600 giri/min per 30 minuti.
  4. Ultrasuonare la soluzione polimerica finale per 90 minuti utilizzando un bagno ultrasonico per rimuovere le bolle.
  5. Fondi film su un rivestimento di polietilene tereftalato (PET) e rivestimento con una lama da dottore impostata a 2600 μm a 2 mm/s. Asciuga le pellicole in un forno ad aria calda a 40 °C per ~1 ora.
  6. Per lo strato di supporto, sciogliere il 5% di etilcellulosa (EC) e il 5% glicerolo propilenico (PG) in acqua idroalcolica (etanolo:acqua), poi versare la sospensione disciolta su un rivestimento PET. Infine, taglia i film essiccati in quadrati da 1 cm × 1 cm, imballa in bustine di alluminio e conserva a 4 °C.

4. Stampa di un inserto 3D personalizzato che imita il transwell

NOTA: Gli inserti personalizzati stampati in 3D sono realizzati seguendo un metodo precedentemente descritto con modificheminori 28.

  1. In breve, progettare il modello 3D utilizzando software di progettazione assistita da computer (CAD).
  2. Mantenere le dimensioni dell'inserto 3D uguali a quelle del corpo cilindrico principale (camera donatrice), con una superficie massima di 1659,06mm2 e dimensioni esterne complessive di 25,20 mm lungo l'asse x, 14,50 mm lungo l'asse y e 21,63 mm lungo l'asse z.
  3. Inoltre, progettare un anello circolare di ritenzione staccabile per sostenere il tessuto epiteliale. L'anello ha un diametro esterno di circa 19,90 mm e un diametro interno di 17,93 mm, corrispondenti alle dimensioni del corpo cilindrico principale, e può essere inserito in piastre Transwell a 12 pozzi (Figura 3).
  4. Fabbricare tutti i componenti utilizzando una stampante 3D per stereolitografia desktop (SLA) con una resina trasparente polimerizzabile ai raggi UV. Tutte le dimensioni sono approssimative e possono essere regolate secondo necessità per garantire un adattamento corretto nei Transwell e la compatibilità sperimentale.
    NOTA: Per garantire la rimozione dei monomeri non reattivi e dei potenziali leevitabili, tutte le parti sono state sottoposte a un protocollo standardizzato di post-lavorazione, incluso un lavaggio di 10 minuti in alcool isopropilico (IPA) al 99% incontaminato, seguito da un indurimento UV secondo le specifiche del produttore, cioè 1 minuto a temperatura ambiente in una Form Cure 2. Il file stereolitografico (STL) per la progettazione di modelli 3D può essere trovato su https://doi.org/10.5281/zenodo.19368577 o file supplementari (File Supplementare 1 e File Supplementare 2).

5. Permeazione attraverso le mucose montate in inserti 3D

NOTA: La permeabilità ex vivo di GLP-1RA e GDC incorporata in film buccali mucoadesivi bilayer può essere valutata utilizzando inserti 3D a basso volume, progettati su misura per imitazione del Transwell (Figura 2) come alternativa alle FDC. Questo perché il lato ricevitore da 10 mL delle FDC diluisce il peptide, mettendo in discussione la sensibilità di rilevamento dell'uHPLC. Il disegno FDC non è quindi conveniente né pratico per i flussi peptidici, poiché richiederebbe una rilevazione continua di un saggio immunosorbente legato a enzimi (ELISA) o di radioimmunosaggio (RIA).

  1. Produci/stampi gli inserti in una resina polimerizzabile UV usando una stampante SLA3D desktop 28, e montali su piastre di coltura tessutale a 12 pozzi.
  2. Posizionare le mucose buccali suine su un'area finestra di 1,4 cm2 tra le camere apicale e basolaterale, misurare la resistenza elettrica transepiteliale di base (TEER) utilizzando un voltohmmetro EVOM 2 con elettrodi STX2 a bastoncini posizionati nei lati donatore e ricevente degli inserti. TEER è calcolato secondo la Legge di Ohm.
  3. Dopo aver posizionato il film (1,0 ×1,0 cm 2) sulla parte superiore del tessuto, si introduce 0,5 mL di PBS (pH 6,8) nella camera apicale e 1,5 mL di PBS (pH 7,4) nella camera basolaterale.
  4. Raccogliere campioni (0,2 mL) dai lati del ricevitore a intervalli di 1 ora per 3 ore e sostituirli con volumi uguali di nuovo buffer.
  5. Quantificare il peptide GLP-1 RA flussato tramite uHPLC.
    NOTA: Non si osserva adsorbimento di GLP-1RA con inserti 3D dopo 3 ore, come mostrato nella Figura Supplementare 1 e nel File Supplementare 3.
  6. Misura la resistenza elettrica transepiteliale (TEER) usando un voltohmmetro EVOM 2 con elettrodi STX2 a intervalli di 1 ora per 3 ore. Il TEER è calcolato secondo la legge di Ohm.
  7. Per confermare l'integrità del tessuto epiteliale buccale e sublinguale suino, si utilizza FD-4 (0,05 mM) come marcatore fluorescente.
    NOTA: Tutti gli esperimenti sono condotti in triplice e i risultati riportati sono la media ± SD di tre set di dati.

6. rilevamento uHPLC del GLP-1 RA

  1. Quantificare la quantità di GLP-1 RA permeata attraverso oromucose montate in FDC e inserti, da ciascuna delle soluzioni laterali donatrici, HTC e film tramite uHPLC utilizzando una colonna CSH C18 (130 Å, 1,7 μm, 2,1 mm × 50 mm) con una fase mobile dello 0,1% TFA in acetonitrile (Eluent A) e 0,1% TFA in acqua (Eluent B), eluzione gradiente per 8 minuti a 30 °C, con un volume di iniezione di 20 μL e una portata di 0,7 mL/min, e rilevamento UV a 214 nm (tempo di ritenzione: ~4,2 min).
  2. Esegui uno studio di linearità.
    1. Progettare uno studio di linearità per stimare la risposta analitica delle condizioni ottimizzate dell'uHPLC utilizzando standard di calibrazione GLP-1 nell'intervallo 2,5–20,0 μg·mL⁻1.
    2. Preparare standard di calibrazione (n = 6–8 livelli) indipendentemente e iniettare i campioni in triplice. Eseguire una regressione lineare ai minimi quadrati dell'area di picco (mAU) rispetto alla concentrazione nominale, e valutare la linearità utilizzando il coefficiente di determinazione (r2), la % di intercetta y e la distribuzione dei residui (risposta osservata–prevista).
      NOTA: L'ispezione visiva del grafico di calibrazione e del grafico dei residui ha indicato una deviazione insignificante dalla linearità al livello di sensibilità più basso (2,5 μg·mL⁻1), con residui entro il limite di accettazione predefinito (±3%). L'intervallo di calibrazione è quindi limitato a un intervallo di 2,5–20,0 μg·mL⁻1, durante il quale la regressione ha mostrato linearità accettabile (r2 ≥ 0,999, % di intercetta Y < 2%, e tutti i residui entro il ±3%).

7. Stima del GLP-1RA trattenuto nel tessuto bucale

  1. Rimuovere le mucose epiteliali buccali suine esposte alla GLP-1 RA e GDC dai FDC/inserti.
  2. Risciacquare il tessuto tre volte con PBS per rimuovere gli excipienti adsorbiti e il film.
  3. Successivamente, omogeneizzare il tessuto in 5 mL di PBS utilizzando un omogeneizzatore da tavolo fino a quando non si frammenta completamente.
  4. Conservare il campione durante la notte a 4 °C per consentire l'equilibrio della partizione peptidica tra tessuto omogeneizzato e PBS.
  5. Successivamente, centrifugare la miscela a 5000 × g per 5 minuti per precipitare i frammenti e raccogliere il soprandanante per la quantificazione.
  6. Sterilizza il soprandanante tramite filtri centrifuga da 0,22 μm per rimuovere le particelle residue prima dell'analisi uHPLC.

8. Istologia del tessuto oromucoso

NOTA: Dopo 3 ore di permeazione del GLP-1 RA da miscele, HTC o film, le mucose vengono processate per la valutazione dei danni.

  1. Fissare i tessuti al 10% di formalina per 48 ore, poi inserire i tessuti fissi nella paraffina.
  2. Dividere i tessuti a una dimensione di 5 μm usando un microtomo.
  3. Successivamente colora i tessuti con ematossilina ed eosina (HE) per esaminarne l'integrità istologica tramite microscopia ottica a ingrandimento di 4×.
  4. Le vetrine vengono fotografate con un microscopio verticale e analizzate utilizzando software di analisi delle immagini.
    NOTA: Il flusso di lavoro complessivo è riassunto nella Figura 4.

Risultati

Isolamento e dissezione dei tessuti epiteliali buccali suini
La mucosa buccale suina è ampiamente utilizzata come tessuto surrogato per le oromucose umane perché condividono caratteristiche anatomiche comparabili e proprietà di barrierafisiologica 29. I tessuti epiteliali buccali suini sono isolati sia con metodi chirurgici che di riscaldamento, come mostrato nella Figura 4. Inizialmente, il bisturi viene utilizzato per rimuovere muscoli e tessuti connettivi più profondi dalle guance. I pezzi isolati di tessuto con strati mucosari combinati e intatti e tessuto connettivo vengono poi posti in PBS caldo riscaldati a 65 °C per 3 minuti. Il tessuto viene rimosso dal tampone e l'epitelio e la lamina propria sottostante vengono staccati con la pinza di misura 5. Il riscaldamento consente uno spessore costante e uniforme nell'epitelio dissezionato risultante.

Permeazione ex vivo di un GLP-1RA attraverso oromucose buccali suine montate in FDC e inserti stampati in 3D
La permeazione ex vivo di GLP-1RA è stata valutata utilizzando mucose epiteliali buccali suine montate in FDC e inserti. Per valutare il rapporto ottimale di concentrazione del GLP-1 RA: GDC, sono stati fissati HTC contenenti dischi di cotone con un'area di 12,7 mm sul lato donatore delle mucose montate nelle FDC, e la miscela peptide-potenziatore è stata pipettata sul cotton pad. La permeazione cumulativa del GLP-1 RA ha raggiunto circa il 4,3% in 3 ore quando la GDC è stata inclusa in un rapporto 1:1 (GLP-1RA 25 mg: GDC 25 mg). Al contrario, in assenza della GDC, non è stato osservato alcun flusso rilevabile di GLP-1RA27. I parametri quantitativi di permeabilità, inclusal'app P, sono calcolati utilizzando la seguente formula:

Papp = figure-results-1

Dove:
P app: coefficiente apparente di permeabilità (cm/s).
dQ/dt: velocità di trasporto del GLP-1RA allo stato stazionario, calcolata come la quantità di peptide trasportato per unità di tempo (μg/s).
A: area dell'inserto 3D (cm2).
Co: la concentrazione iniziale del peptide nel compartimento donatore (apicale) (μg/mL).

Il coefficiente apparente di permeabilità (Papp) di GLP-1RA nelle mucose buccali suine è mostrato nella Figura Supplementare 2. Quando il rapporto GLP-1RA:GDC era 1:1, le stesse concentrazioni degli HTC venivano incorporate nei film a due strati; tuttavia, la permeazione del GLP-1RA attraverso i tessuti buccali suini isolati non era quantificabile utilizzando il sistema convenzionale FDC, poiché la presentazione del GLP-1RA dai film alle mucose è più lenta rispetto a quella delle miscele in soluzione o degli HTC. Per superare questa limitazione, furono sviluppati inserti personalizzati a basso volume stampati in 3D per ridurre il volume del ricevitore a 1,5 mL, migliorando così la sensibilità di rilevamento. Utilizzando inserti 3D, la permeazione cumulativa di GLP-1RA dai film buccali su 3 ore era misurabile e raggiunse circa l'1,8%, come mostrato nella Figura 5. I valori TEER e i flussi FD-4 sono stati utilizzati per valutare l'integrità della barriera epiteliale e la permeabilità paracellulare. Un calo dipendente dal tempo della TEER è stato osservato (Figura Supplementare 3) nei gruppi di trattamento e corrispondeva a un aumento della permeazione del GLP-1RA. PBS e tessuti trattati con pellicola bianca non hanno mostrato cambiamenti nel TEER, indicando che la matrice a due strati non ha disturbato la barriera. Questi dati implicano la GDC come principale contributo all'effetto di potenziamento della permeazione.

Valutazione istologica del tessuto suinale
È stata effettuata una valutazione istologica della mucosa buccale suina ex vivo per valutare l'impatto dei metodi di isolamento tissutale e per esaminare l'integrità epiteliale dopo 3 ore di esposizione a GLP-1RA e GDC. Come mostrato nella Figura 6, i tessuti appena isolati ottenuti con il metodo di riscaldamento hanno preservato l'architettura fisiologica epiteliale normale, con strati stratificati intatti e muco superficiale continuo, e non hanno mostrato segni di danni strutturali. Al contrario, i tessuti isolati tramite separazione meccanica o sottoposti a conservazione/congelamento hanno mostrato lievi alterazioni nella morfologia delle cellule epiteliali e una riduzione dello spessore del muco superficiale. Le mucose buccali esposte a 25 mg di GLP-1RA in presenza di 25 mg di GDC mantenevano l'integrità epiteliale e somigliavano molto ai controlli non trattati. Sono stati osservati solo lievi edema ed erosione epiteliale superficiale. Esposizione al solo GLP-1RA o a blank e GLP-1RA: I film bistrato caricati con GDC non hanno prodotto danni vissibili ai tessuti, e le caratteristiche istologiche erano paragonabili a quelle dei tessuti di controllo trattati con PBS.

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Figura 1: Cavità orale suina che mostra aree mucose bucali e sublinguali. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: FDC e componenti. Sei camere sono montate in un sistema integrato (a sinistra). Un individuo, Franz Cell, è mostrato (al centro). Il sistema di montaggio del tessuto bucale in una singola camera (a destra). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Componenti di inserti in resina 1cm 2 stampati in 3D. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Flusso di lavoro per l'isolamento, il montaggio, la permeazione e i processi di caratterizzazione istologica dell'epitelio bucale suino. Creato nel BioRender.com. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Quantità cumulativa del GLP-1 RA. Quantità cumulativa ex vivo di GLP-1 RA permeata sul lato ricevente della mucosa epiteliale bucale suina dopo 180 minuti di applicazione di 25 mg/mL di GLP-1RA (Rosso), 25 mg/mL di GLP-1RA: 25 mg/mL di soluzione GDC (Nero) e 25 mg/mL di GLP-1RA: 25 mg/mL di GDC caricato in film (viola) applicato tramite inserti HTC, FDC e 3D. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 6: Immagini microscopiche colorate con HE delle mucose epiteliali buccali suine in diverse condizioni di esposizione. (A) pellicola bianca, (B) miscela acquosa di GLP-1RA: GDC, (C) pellicole intrappolate con GLP-1RA:GDC, (D) mucose isolate da tessuto fresco dopo trattamento termico (65 °C), (E) epitelio bucale isolato da tessuto congelato dopo trattamento termico, (F) mucose isolate tramite metodo meccanico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Composizione dello strato mucoadesivo
ComponentiConcentrazione (mg)
GLP-1RA12,5 mg
GDC12,5 mg
HPMC45 mg
Na-CMC10 mg
PVP-K9025 mg
Glicerolo3 mg
Aerosil 200F2 mg
Strato di supporto
Cellulosa etilica5 mg
Glicole propilenico5 mg

Tabella 1: Composizione del mucoadesivo e degli strati di supporto di pellicola buccale.

Figura supplementare 1: Adsorbimento di GLP-1RA dopo l'incubazione di 0,5 mg di GLP-1RA per 6 ore con inserti 3D. I dati sono la media ± DE di tre esperimenti (n = 3).Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 2: Coefficiente di permeabilità apparente (Papp) di un GLP-1RA dopo un'esposizione di 3 ore di tessuto mucoso buccale suino montato in inserti 3D. 25 mg/mL di soluzione GLP (rosso), 25 mg/mL di GLP + 25 mg/mL di soluzione acquosa GDC (nera) e 25 mg/mL di GLP + 25 mg/mL di GDC incorporati in film buccali (viola). I dati rappresentati sono la media ± SD (n = 3). È stata osservata significatività statistica tra i gruppi: p < 0,05. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 3: Resistenza transepiteliale (TEER). Riduzione graduale della resistenza transepiteliale (TEER) da tessuto epiteliale bucale porcinale isolato fissato in inserti 3D, dopo esposizione a 25 mg/mL di GLP-1 + 25 mg/mL di soluzione GDC (rosso), 25 mg/mL di GLP-1 + 25 mg/mL di GDC in film buccali (verde) e 25 mg/mL di GLP-1RA in PBS (blu). Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 4: Integrità e perdita dei tessuti. L'integrità e la perdita dei tessuti sono state valutate esponendo tessuti epiteliali buccali suini in inserti 3D a 0,05 mM FD4 sul lato donatore. I campioni venivano prelevati a intervalli fissi di 60 minuti nell'arco di 6 ore. Media +SD di tre esperimenti. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 1: transwell-Oring-v7 (JOVE).stl.Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 2: transwell-v9 (JOVE).stl.Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 3: Dettagli sperimentali aggiuntivi.Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Questa metodologia descrive protocolli sperimentali per l'isolamento di epiteli buccali suini e altri epiteli oromucosi, insieme a saggi di permeabilità per terapie a base peptidica utilizzando un analogo stabile di GLP-1RA a bassa potenza comeesempio 30. I peptidi sono macromolecole idrofile con permeabilità trascurabile attraverso le membrane mucose17. L'esecuzione efficace del protocollo sopra descritto si basa sull'isolamento preciso e sul montaggio della mucosa buccale e sublinguale. L'isolamento richiede abilità specializzate e un rigoroso controllo della temperatura; Anche piccole fluttuazioni termiche durante il processo di riscaldamento possono indurre cambiamenti fisiologici e morfologici deleteri nel tessuto epiteliale, compromettendo infine l'integrità dei dati di permeazione. Inoltre, la fissazione del tessuto isolato all'interno degli inserti personalizzati stampati in 3D rappresenta un passaggio fondamentale. Data la natura delicata degli strati epiteliali, vi è un rischio maggiore di rottura o perdita del tessuto durante il montaggio. Per mitigare questo problema, abbiamo utilizzato un test di perdita FD4, che funge da misura di controllo qualità per garantire l'integrità della membrana prima di iniziare gli studi sul flux. La perdita FD4 è stata inizialmente valutata visivamente e ulteriormente quantificata tramite spettroscopia UV-visibile. I dati corrispondenti sono forniti nei dati supplementari (Figura Supplementare 4 e File Supplementare 3).

La FDC convenzionale, considerata standard per studi ex vivo , presenta spesso sfide nella quantificazione delle terapie peptidiche a causa degli elevati volumi nella camera ricevente, tipicamente di 10 mL. L'elevato volume porta a una diluizione eccessiva del campione, spingendo le concentrazioni di peptidi permeati sotto il LOD più basso per i metodi analitici standard. Per evitare ciò, abbiamo sviluppato un nuovo inserto stampato in 3D che imita la scala e i volumi del sistema transwells utilizzato per i monostrati di cellule epiteliali, incluso ilCaco-2 31. Gli inserti possono essere posizionati direttamente in piastre standard di coltura tissutale a 12 pozzi e accogliono in modo sicuro mucose epiteliali buccali isolate suine. Questa modifica riduce significativamente il volume del compartimento donatore quasi 7 volte fino a 1,5 mL, concentrandosi così sull'analita e superando le limitazioni di sensibilità dell'uHPLC. Questo adattamento è particolarmente importante per la quantificazione di costosi farmaci peptidici a bassa permeabilità.

È stato osservato un aumento della permeazione di GLP-1 RA in presenza di GDC utilizzando il sistema 3D insert. La quantità cumulativa permeata di GLP-1RA ha raggiunto ~55,3 μg in 3 ore, corrispondente al ~4,3% della concentrazione inizialmente applicata sul lato donatore. Al contrario, non è stato rilevato alcun flusso misurabile di GLP-1 RA quando concentrazioni simili di GLP-1RA e GDC intrappolate in film buccali sono state applicate a mucose buccali montate in FDC, suggerendo che potrebbe essersi verificata una permeazione peptidica ma è rimasta analiticamente non rilevabile a causa di una diluizione eccessiva nel grande volume del ricevitore. Tuttavia, la permeazione cumulativa di GLP-1 RA dalla formulazione a due strati di film buccale ha raggiunto circa l'1,8% in 3 ore in inserti 3D in 3 ore, dimostrando la fattibilità di rilevare il trasporto peptidico a basso livello attraverso il tessuto buccale tramite forme dosative utilizzando il sistema di ricevitore miniaturizzato. La permeazione ex vivo del GLP-1 RA è stata inoltre valutata utilizzando HTC contenenti un cotton pad caricato con il peptide e il GDC. Questo è un dispositivo di screening iniziale molto utile per dimostrare il concetto che la presentazione di un peptide da film con un potenziatore di permeazione può essere possibile. L'integrità della barriera dell'epitelio buccale suino può essere monitorata durante l'esperimento utilizzando TEER e perdita FD-4. Una lenta diminuzione del TEER dipendente dal tempo è stata osservata durante l'esposizione all'agonista del recettore GLP-1 (GLP-1 RA), coerente con un aumento del trasporto paracellulare indotto nelle mucose bucali dal salebiliare 32.

Un limite di questa tecnica è la dipendenza da tessuto suino fresco, che non è sempre disponibile su richiesta dai macelloni, e la qualità dei tessuti può variare. Per affrontare i vincoli nell'ottenere tessuto fresco a una distanza ragionevole dal laboratorio, abbiamo valutato la crioprotezione per conservare campioni di alta qualità che avremmo potuto utilizzare in seguito. Sebbene l'uso di tessuto fresco sia ottimale, l'uso di tessuti mucosi isolati immagazzinati richiede un uso attento di crioprotettori e tassi di congelamento per prevenire la formazione di cristalli di ghiaccio e i conseguenti danni alla barriera. Il protocollo ha la capacità di colmare il divario tra gli studi standard su scala macro sulla permeazione e l'analisi peptidica ad alta sensibilità. Ottimizzando sia il processo di isolamento del tessuto sia il protocollo di permeazione utilizzando inserti 3D, abbiamo raggiunto un grado di riproducibilità e sensibilità più elevato rispetto a quanto tipicamente riportato con le FDC. Inoltre, l'uso degli inserti 3D fornisce un quadro di riferimento per i ricercatori per stabilire limiti di rilevamento per costose molecole peptidiche, rappresentando un miglioramento significativo nella flessibilità e nella produttività della ricerca mucosa ex vivo .

Questi protocolli forniscono una base per una misurazione affidabile della permeazione del tessuto mucoso utilizzando classi di farmaci oltre i peptidi. La capacità di generare profili di permeazione ad alta risoluzione a partire da modelli ex vivo aiuterà le previsioni per i dati di assorbimento preclinico derivati da modelli animali. La permeazione ex vivo della RA GLP-1 è stata inoltre valutata utilizzando HTC contenenti un cotton pad caricato con il peptide e GDC, una soluzione potenziatrice della permeazione. Questo approccio di somministrazione ha garantito un contatto intimo e riproducibile tra l'admixture e la superficie mucosa. È stato osservato un aumento significativo della permeazione di GLP-1RA con un rapporto 1:1 di GDC negli inserti 3D che imitano i transwell. Questo è un dispositivo di screening molto utile per dimostrare il concetto che la presentazione di un peptide da film con un potenziatore di permeazione può essere possibile in un design costruito adattato da monostrati coltivati di cellule epiteliali a mucose tissutali. L'integrità della barriera dell'epitelio buccale suino può essere monitorata durante l'esperimento utilizzando la misurazione TEER e la perdita FD4.

Nel complesso , le valutazioni ex vivo della permeazione e istologiche dimostrano che una valutazione affidabile del trasporto bucale e sublinguale dei peptidi in presenza di un potenziatore di permeazione dipende dalla preparazione tissutale, dai protocolli di flusso e dalla sensibilità analitica. Tra gli approcci di isolamento esaminati, la separazione dell'epitelio buccale e sublinguale suino appena acquisito tramite il metodo del calore ha fornito un buon equilibrio tra il mantenimento dell'integrità epiteliale e la riproducibilità della dissezione tissutale, come dimostrato da TEER di base stabile, perdita minima di FD4 e strutture cellulari tissutali preservate. È importante sottolineare che l'inserto stampato in 3D ha notevolmente migliorato l'affidabilità sperimentale riducendo la diluizione del compartimento ricevitore, permettendo la quantificazione di bassi flussi peptidici non rilevabili nelle FDC. Nel complesso, questi risultati supportano l'uso di mucose epiteliali buccali isolate in una camera di inserto tissutale come piattaforma ex vivo per valutare l'amministrazione bucale di peptidi terapeutici per la consegna sistemica.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno coinvolgimenti finanziari o conflitti di interesse da divulgare.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano Ben Shovlin (UCD School of Veterinary Medicine) per l'assistenza tecnica. Ringraziamo anche il dottor Hans Eckhardt (UCD School of Chemistry) per il supporto nell'analisi uHPLC. Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dal programma di ricerca e innovazione Horizon Europe dell'Unione Europea nell'ambito della sovvenzione numero 101071054. Riconosciamo inoltre il sostegno finanziario aggiuntivo dalla Grant Number 13/RC/2073_P2, dal Research Ireland CURAM Center for Medical Devices e dal Fondo Europeo per lo Sviluppo. Gli autori desiderano ringraziare Kenneth McNamara di Rosderra Irish Meats per la fornitura di guance di maiale.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Computer / LaptopGenericoQualsiasi sistema standard≥8 GB di RAM consigliati
Script di acquisizione datiPersonalizzatocollect.pyScript di acquisizione basato su Python
Elettrodi in gel usa e gettaGenericoElettrodi Ag/AgCl pre-gelatiMonouso, adesivi
Modulo di acquisizione EEGUpside Down LabsBioAmp EXG PillFront-end analogico per segnali biopotenziali
Gel per elettrodi (se si usano elettrodi riutilizzabili)GenericoGel conduttivoMigliora la conducibilità del segnale
Applicazione interattiva (gioco)GenericoQualsiasi gioco semplice (ad esempio, corse)Interfaccia controllata tramite tastiera
Cavi jumperGenericoConnettori maschio-femminaCavi standard per breadboard
Matplotlib / SeabornOpen-sourceUltime versioniLibrerie di visualizzazione
Scheda microcontrolloreArduinoUno / Maker UnoADC a 10 bit, interfaccia USB
Ambiente di programmazione PythonPython Software FoundationPython ≥3.8Lingua di programmazione open-source
Libreria PyTorchMeta AIVersione ≥1.12Framework di apprendimento profondo
Scikit-learnOpen-sourceUltima versione stabileUtilità ML
Librerie di elaborazione del segnaleSciPyUltima versioneFiltraggio, STFT
Cavo USBGenericoUSB Tipo-A a BCavo di trasferimento dati

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