Articolo metodologico

Strategie di imaging per l'intervento con agopuntura nei topi modello per la malattia di Alzheimer

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DOI:

10.3791/70998

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21 aprile 2026

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1Department of Traditional Chinese Medicine, General Hospital of the Chinese People's Liberation Army, 2Meizhou Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine (Meizhou Hospital of Traditional Chinese Medicine), 3School of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University, 4Department of Psychosomatic Medicine, Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Capital Medical University

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive una strategia di micro-PET in vivo combinata con saghi comportamentali e molecolari per valutare dinamicamente gli effetti dell'elettroagopuntura sulla deposizione di β-amiloide e sulla funzione cognitiva in un modello murino affetto da Alzheimer.

Abstract

La malattia di Alzheimer (DA) è un disturbo neurodegenerativo caratterizzato principalmente da una progressiva disfunzione cognitiva. Una delle sue caratteristiche patologiche tipiche è la formazione di placche senili nel cervello dovute alla deposizione di proteine β-amiloidi (Aβ). L'agopuntura ha dimostrato potenziale nella pratica clinica per migliorare la funzione cognitiva nei pazienti con AD. Tuttavia, i suoi effetti dinamici sulla patologia Aβ richiedono una chiarificazione oggettiva attraverso approcci tecnologici moderni. La tomografia a emissione di micro-positroni (micro-PET) fornisce uno strumento potente per l'osservazione in vivo e non invasiva della deposizione di Aβ nei cervelli di topi modello di AD. In questo protocollo, dettagliamo una strategia di imaging che utilizza [18F]AV-45 micro-PET per valutare gli effetti dell'intervento elettroagopuntura, completata dai test comportamentali Morris Water Maze e dall'analisi molecolare Western Blot. L'approccio integrato consente la visualizzazione e la quantificazione della progressione patologica di Aβ nei cervelli dei topi modello di Alzheimer. Questo fornisce evidenze oggettive e quantitative per esplorare l'effetto regolatorio dell'agopuntura sulla deposizione di Aβ. Integrando i principi della medicina tradizionale cinese con le moderne tecnologie di imaging molecolare e biologia molecolare.

Introduzione

Il monitoraggio in vivo della deposizione di β-amiloide(Aβ) nel cervello è cruciale per valutare la progressione patologica dell'AD1. A seguito dell'applicazione clinica di terapie mirate ad anticorpi Aβ (ad esempio, Lecanemab), la valutazione longitudinale e quantitativa del carico cerebrale di Aβ tramite PET è emersa come uno standard d'oro per determinare l'efficaciaterapeutica 2. Sebbene l'agopuntura abbia dimostrato potenziale negli studi preclinici per modulare il metabolismo di Aβ, gli approcci di ricerca tradizionali si sono in gran parte basati su analisi ex vivo, prive di strumenti efficaci per la valutazione diretta e oggettiva del suo impatto dinamico sulla deposizione di Aβ negli organismi viventi. Negli ultimi anni, i progressi nelle tecnologie di imaging molecolare hanno creato opportunità per colmare questa lacuna. il micro-PET ha permesso l'osservazione longitudinale non invasiva della deposizione di Aβ nei topi modelloAD 1. Ancora più importante, le nuove strategie di imaging si stanno evolvendo da approcci single-target a paradigmi multimodali. Ad esempio, studi hanno confermato che diversi sottotipi strutturali delle fibrille Aβ mostrano affinità di legame variabili ai traccianti PET comunemente usati, sollevando nuove richieste di quantificazioneprecisa 3. Contemporaneamente, tecniche emergenti come l'imaging neuroimmune (ad esempio, TSPO PET) e le valutazioni della funzione della barriera emato-encefalica offrono prospettive senza precedenti per chiarire in modo completo i complessi meccanismi patologici dell'AD e gli effetti multi-bersaglio degli interventiterapeutici 4.

Sulla base di questa base, questo studio mira a sviluppare una strategia avanzata di micro-PET utilizzando le più recenti sonde specifiche per Aβ per valutare dinamicamente e quantitativamente l'impatto dell'intervento di agopuntura sulla deposizione di Aβ nel cervello di topi modello di AD in vivo. Lo studio non solo convaliderà l'efficacia terapeutica dell'agopuntura, ma si impegnerà anche a fornire prove dirette dei suoi meccanismi sottostanti a livello di imaging molecolare.

Protocollo

Condurre tutti gli esperimenti in conformità con le Linee Guida per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio emesse dai National Institutes of Health. Il protocollo dello studio è stato approvato dal Comitato Etico Sperimentale sugli Animali dell'Università di Medicina Cinese di Pechino (n.: bucm-4-2021102707-5421).

1. Preparazione degli animali sperimentali

  1. Acquista mouse maschi APP/PS1 di 6 mesi e topi C57BL/6 con età e sesso abbinati dal peso 28,0 ± 2,0 g.
  2. Ospita i topi in gabbie standard a una temperatura ambiente di 24 ± 2 °C con un'umidità compresa tra il 40% e il 60%.
    NOTA: Gli animali erano ospitati in gabbie standard presso il Centro per gli Animali da Laboratorio dell'Università di Medicina Cinese di Pechino, Università Medica della Capitale.
  3. Mantieni gli animali sotto un ciclo standard di 12 ore luce/scuro (periodo buio: 20:00 - 8:00) con accesso gratuito a cibo e acqua. Cambia la biancheria da letto ogni giorno per garantire condizioni di abitazione pulite e asciutte.
  4. Acclimatare gli animali all'ambiente di laboratorio per 7 giorni. Inizia gli esperimenti l'ottavo giorno dopo l'acclimatazione.

2. Raggruppamento e interventi degli animali

  1. Assegnare casualmente venti maschi di 6 mesi di topi APP/PS1 a un gruppo modello per la malattia di Alzheimer (gruppo AD, n = 10) e a un gruppo elettroagopuntura (gruppo EA, n = 10). Assegnare dieci topi C57BL/6N abbinati a un gruppo di controllo normale (gruppo N, n = 10).
  2. Identifica i tre punti di agopuntura sulla testa per l'intervento: GV20 (Baihui), GV26 (Shuigou) e GV29 (Yintang).
    NOTA: La localizzazione dei punti di agopuntura si basa sull'"Animal Acupuncture Pointpoint Atlas" formulato dalla Experimental Acupuncture Research Society della China Association of Agopuncture-Moxibustion. GV20 si trova a metà tra le punte di entrambe le orecchie; GV29 si trova a metà tra le estremità mediali delle sopracciglia; e GV26 si trova sotto il setto nasale del topo, alla giunzione tra i due terzi inferiori e il terzo superiore della linea mediana della fissura labbrare. Il diagramma schematico è mostrato nella Figura 1.
  3. Somministrare la stimolazione elettroagopuntura al gruppo EA una volta al giorno per 20 minuti in 15 giorni consecutivi.
    1. Immobilizza il topo usando maniche di ritenuta in tessuto identiche e progettate su misura. Assicurati che il corpo sia comodamente avvolto mentre la testa rimane completamente esposta per un inserimento accurato dell'ago e una respirazione normale.
    2. Prepara aghi sterili e usa e getta per agopuntura (0,25 mm × 13 mm).
    3. Applica un metodo di punture rapido (inserzione rapida e ritiro immediato senza ritenzione) al punto di agopuntura GV26 (Shuigou) usando l'ago sterile per agopuntura.
    4. Collega le manette degli aghi a GV20 e GV29 ai clip di uscita di un apparecchio elettronico di elettroagopuntura.
    5. Impostare i parametri di stimolazione dell'apparecchio per fornire un'onda continua e rada, con frequenza di 2 Hz, tensione costante di 2 V e intensità di corrente di 0,1 mA.
    6. Osserva attentamente il topo e verifica che l'intensità della stimolazione induca un lieve tremolio ritmico della testa del topo.
  4. Mantenere i topi nei gruppi N e AD in condizioni abitative identiche senza alcun intervento. Sottoporre i gruppi N e AD alle stesse procedure quotidiane di gestione e contenzione del gruppo EA per tutto il periodo di 15 giorni per garantire la coerenza nelle condizioni sperimentali.

3. Il test del labirinto acquatico Morris (MWM)

NOTA: Il quadro comportamentale (Morris Water Maze) si basa sul nostro lavoroprecedente 5.

  1. Preparazione dell'apparecchio
    1. Posizionare un serbatoio d'acqua circolare (90 cm di diametro, 50 cm di profondità) nella sala di prova. Riempi il serbatoio con acqua (22 ± 2 °C) fino a una profondità di 30 cm.
    2. Aggiungi 0,5 kg di latte scremato in polvere all'acqua per renderla opaca. Dividere virtualmente il serbatoio in quattro quadranti uguali (I, II, III e IV).
    3. Posizionare una piattaforma di fuga (circolare, 5 cm di diametro, 28 cm di altezza) al centro del quadrante I.
    4. Posiziona segnali visivi distinti di forme diverse sulla parete interna di ogni quadrante per aiutare il mouse a imparare e memorizzare la posizione della piattaforma.
    5. Montare una fotocamera digitale 2 m sopra il centro della vasca, sul soffitto, e collegarla a un sistema di acquisizione immagine6.
  2. Abituazione
    1. Rimuovi la piattaforma dal serbatoio il giorno prima del test della piattaforma nascosta. Lascia nuotare liberamente nel serbatoio per 90 secondi al mattino e al pomeriggio, per ambientarsi nell'ambiente sperimentale.
  3. Test della piattaforma nascosta
    1. Esegui il test della piattaforma nascosta per cinque giorni consecutivi.
    2. Seleziona i punti di partenza rispettivamente dal secondo, terzo e quarto quadrante, assicurandoti che ogni punto di partenza sia equidistante dal centro del serbatoio.
    3. Metti il topo nell'acqua, rivolto verso la parete della vasca. Lascia al topo per 10 secondi di osservare l'ambiente circostante dopo essere stato immerso in acqua.
    4. Registra la latenza di fuga e il percorso di nuoto se il mouse individua la piattaforma nascosta e vi rimane sopra per 5 secondi entro un limite di 60 secondi. Guida manualmente il mouse sulla piattaforma se non riesce a trovarla entro 60 secondi.
    5. Permettere all'animale di rimanere sulla piattaforma per 10 secondi per osservare e memorizzare la posizione, e registrare la latenza di fuga come 60 secondi.
  4. Test della sonda spaziale
    1. Rimuovere la piattaforma nascosta dal serbatoio dopo cinque giorni consecutivi di addestramento sulle piattaforme nascoste.
    2. Posiziona ogni topo nell'acqua da uno dei punti di partenza situati nel secondo, terzo o quarto quadrante. Lascia che il topo nuoti liberamente per 60 secondi. Registra il percorso di nuoto e il tempo trascorso nel quadrante bersaglio (quadrante I).
    3. Riporta tutti i topi nelle loro gabbie di casa immediatamente tra una prova e l'altra per minimizzare il contatto diretto con l'esperimento.

4. Analisi del western blot

  1. Eutanasiare sei topi per gruppo 24 ore dopo il completamento dell'intervento di 15 giorni. Dissezionare e isolare rapidamente i tessuti ippocampali freschi sul ghiaccio.
  2. Pesa i tessuti dell'ippocampo e mettili in tubi microcentrifughe pre-raffreddati. Aggiungere un buffer di lisi RIPA freddo integrato con cocktail inibitori della proteasi all'1% e cocktail inibitori della fosfatasi all'1% in un rapporto di 10 μL tampone per 1 mg di tessuto.
  3. Omogeneizzare accuratamente i tessuti utilizzando un omogeneizzatore meccanico su ghiaccio. Centrifugare gli omogeneati a 12.000 x g per 15 minuti a 4 °C per rimuovere i detriti cellulari. Raccogli con cura il surnatante e trasferiscilo in un nuovo tubo microcentrifuga pre-raffreddato.
  4. Mescola i campioni di proteine con il tampone di carico a 5× SDS e fai bollire la miscela a 95 °C per 10 minuti per denaturare completamente le proteine. Carica quantità uguali di proteine (20 μg) per pozzo su un gel SDS-PAGE al 15%. Includere un marcatore di peso molecolare proteico pre-colorato in un pozzo adiacente.
  5. Fai funzionare il gel di impilamento a una tensione costante di 80 V per 30 minuti, poi risolvi le proteine nel gel separante a 120 V finché la fronte del colorante blu di bromofenolo raggiunge il fondo del gel.
  6. Trasferire le proteine separate su una membrana di fluoruro di polivinilidene (PVDF) da 0,22 μm a corrente costante di 250 mA per 90 minuti sul ghiaccio. Bloccare la membrana PVDF con latte scremato al 5% scimoso in soluzione salina Tris-buffer contenente 0,1% Tween 20 (TBST) per 1 ora a temperatura ambiente, con una delicata agitazione su uno shaker.
  7. Incubare la membrana con un anticorpo primario contro Aβ (diluito [1:1000] in buffer bloccante) e un anticorpo primario contro GAPDH (diluito [1:5000] in buffer bloccante) durante la notte a 4 °C su uno shaker orizzontale. Incubare la membrana con un anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano (HRP) (diluito [1:2000] in tampone bloccante) per 1 ora a temperatura ambiente.
  8. Lavare la membrana tre volte con TBST per 10 minuti ciascuna per rimuovere gli anticorpi secondari non legati.
  9. Applicare un substrato di chemiluminescenza avanzata (ECL) alla membrana e catturare il segnale utilizzando un sistema di imaging a chemiluminescenza.
  10. Quantificare le intensità delle bande proteiche utilizzando il software ImageJ (versione 1.53a). Normalizza i valori in scala di grigi delle bande target a quelli del GAPDH e calcola i livelli relativi di espressione delle proteine di interesse.

5. [18F]Radiosintesi AV-45

  1. Eseguire la radiomarcatura tramite sostituzione nucleofila di 3,0 mg del composto precursore con [18F]KF.
  2. Purificare il prodotto utilizzando cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) per ottenere una purezza radiochimica (RCP) superiore al 95%.
  3. Sciogliere il composto marcato nell'etanolo.
  4. Diluire la soluzione con cloruro di sodio allo 0,9% e preparare il prodotto finale in etanolo al 10% per un uso successivo7.

6. Imaging PET in vivo

  1. Seleziona casualmente quattro topi da ogni gruppo sperimentale.
    1. Posizionare il topo su una base riscaldante a circolazione (37 °C) o sotto una lampada riscaldante per 5–10 minuti prima della procedura, per favorire la vasodilatazione delle vene caudali.
    2. Fissa il topo in un adatto contenitore di roditori trasparente e ciobi a bordo, lasciando la coda completamente esposta. Disinfetta la coda e visualizza ulteriormente le vene laterali della coda pulendo la pelle con un tampone di etanolo al 70%.
  2. Estrarre il radiotracatore AV-45 formulato[18F] in una siringa di insulina da 0,5 mL dotata di ago. Preparare un volume di iniezione di circa 100–150 μL per raggiungere una dose di radioattività target di 3,0 MBq (purezza radiochimica > 95%)2.
  3. Misurare e registrare la radioattività iniziale della siringa riempita con tracciante utilizzando un calibratore di dosaggio.
  4. Inserire l'ago, bisellato verso l'alto, con un angolo ridotto (circa 10°–20°) nella vena laterale della coda. Attendi 60 minuti dopo la somministrazione, poi anestetizza il topo inalando isoflurano al 2%.
  5. Posiziona il mouse e acquisisci una PET TAC tridimensionale statica di 15 minuti.
  6. Ricostruisci i dati PET utilizzando un algoritmo tridimensionale di massimizzazione dell'aspettativa a sottoinsiemi ordinati (OSEM).
  7. Elaborare i dati ricostruiti con il software PMOD (versione 4.5).
    1. Co-registra i dati su un template cerebrale adatto a topi di piccole e medie dimensioni all'interno del modulo di fusione PMOD. Permette al software di delimitare automaticamente le regioni di interesse (ROI) nel cervello del topo.
  8. Calcola i valori standardizzati di assorbimento (SUV). Ottieni il rapporto standardizzato di valore di assorbimento (SUVR) confrontando il SUV di ogni ROI con quello delcerevelletto 8.
    NOTA: La variabilità accettabile della dose somministrata (2,0–3,8 MBq) tiene conto delle fluttuazioni giornaliere della resa dei radiotracatori e del peso corporeo del singolo topo. Poiché le quantificazioni successive si basano sul rapporto di valore di assorbimento standardizzato (SUVR)—che normalizza la regione target rispetto a una regione di riferimento (cervelletto)—le variazioni assolute di dose all'interno di questo intervallo non compromettono gli esiti di imaging comparativo. La tomografia a emissione di micro-positroni (Micro-PET) è mostrata nella Figura 2.

7. Analisi statistica

  1. Eseguire tutte le analisi statistiche utilizzando il software SPSS (versione 19.0).
  2. Presenta i dati come media ± deviazione standard (SD).
  3. Applica ANOVA unidirezionale per analizzare i risultati del test nascosto della piattaforma.
  4. Analizzare i dati del test della sonda spaziale e dell'imaging PET utilizzando ANOVA a misura ripetuta o ANOVA unidirezionale, seguiti da test post-hoc con LSD per confronti a coppie.

Risultati

Effetto dell'elettroagopuntura sulla funzione cognitiva nei topi APP/PS1

Per valutare la capacità di apprendimento spaziale, i topi hanno sottoposto prove di addestramento dal giorno 1 al giorno 5. Nel test della piattaforma nascosta (Figura 3A,B), la latenza di fuga dei topi in tutti i gruppi ha mostrato una tendenza al calo durante il periodo di addestramento. Rispetto al gruppo N, il gruppo AD ha mostrato una latenza di fuga significativamente prolungata (p < 0,05), indicando marcati deficit di apprendimento e memoria nei mouse APP/PS1 di 6 mesi. La latenza di escape nel gruppo AD era significativamente più lunga rispetto a quella sia nei gruppi N che EA (p < 0,01). In particolare, al quinto giorno, la latenza di fuga nel gruppo EA era significativamente più corta rispetto a quella del gruppo AD (p < 0,05) (Figura 3C). Dopo il periodo di addestramento di 5 giorni, la memoria spaziale è stata valutata utilizzando il test della sonda spaziale. Veniva calcolato il rapporto tra il tempo trascorso a nuotare nel quadrante target (piattaforma) e il tempo totale di nuoto; un rapporto più alto indica una migliore conservazione della memoria. I risultati hanno mostrato che il rapporto tempo di nuoto nel gruppo AD era significativamente inferiore a quello del gruppo N (p < 0,01). Al contrario, il gruppo EA ha mostrato un rapporto significativamente più alto rispetto al gruppo AD (p < 0,01). Tuttavia, il rapporto nel gruppo EA è rimasto inferiore a quello del gruppo N (p < 0,05) (Figura 3D).

È stato inoltre analizzato il numero di attraversamenti dei binari, che riflette la precisione della memoria spaziale. Un numero maggiore di incrociamenti suggerisce una migliore ritenzione della memoria. Il gruppo AD ha mostrato significativamente meno attraversamenti delle piattaforme rispetto al gruppo N (p < 0,05), mentre il gruppo EA ha mostrato un aumento significativo rispetto al gruppo AD (p < 0,05). Tuttavia, il gruppo EA aveva comunque meno incroci rispetto al gruppo N (p < 0,05) (Figura 3E).

Effetti dell'elettroagopuntura sulla deposizione di Aβ nell'ippocampo di APP/PS1 mice

La deposizione Aβ è stata valutata tramite immagini PET e il rapporto standardizzato del valore di assorbimento (SUVR) del tracciatore Aβ radiomarcato è stato calcolato nell'ippocampo dei topi APP/PS1 (Figura 4A). Le micro-scansioni PET hanno rivelato che sia il gruppo N che quello EA mostravano valori SUVR significativamente inferiori rispetto al gruppo AD (Figura 4B). Ulteriori analisi quantitative hanno confermato che l'SUVR ippocampo e l'Aβ nel gruppo EA erano significativamente più alti rispetto a quelli del gruppo N (p < 0,05), mentre sono rimasti significativamente inferiori rispetto al gruppo AD dopo l'intervento elettroagopuntura (p < 0,05) (Figura 4C).

Effetti dell'elettroagopuntura sull'espressione della proteina Aβ

Dopo le valutazioni comportamentali e di imaging, l'espressione della proteina Aβ nell'ippocampo è stata analizzata tramite analisi Western blot (Figura 5A). L'analisi quantitativa ha rivelato che l'espressione relativa di Aβ nel gruppo AD era significativamente elevata rispetto al gruppo N (p < 0,05). Il gruppo EA ha mostrato una significativa riduzione dell'espressione di Aβ nell'ippocampo rispetto al gruppo AD (p < 0,05). Tuttavia, i livelli di espressione nel gruppo EA sono rimasti più alti rispetto a quelli del gruppo N, indicando che, sebbene l'intervento abbia effettivamente attenuato l'accumulo di Aβ, non ha eliminato completamente le placche esistenti (Figura 5B).

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Figura 1: Diagramma schematico che mostra la posizione degli agopunti GV20 (Baihui), GV26 (Shuigou) e GV29 (Yintang) nei topi. Questa figura è stata riutilizzata con il permesso di Sun et al.5. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Tomografia a emissione di micropositroni (Micro-PET). L'IRIS PET/CT (Inviscan) è un sistema di imaging preclinico per topi e ratti, caratterizzato da alta sensibilità (>9%) e una risoluzione spaziale di 1 mm con un campo visivo assiale di 96 mm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Effetto dell'elettroagopuntura sulla funzione cognitiva. (A) Apparecchio MWM. (B) I topi sono stati testati utilizzando l'apparato Morris Water Mase (MWM). (C) Tendenze nella latenza di fuga durante il test della piattaforma nascosta. Rispetto al gruppo N, ◆◆p < 0,05; rispetto al gruppo del morbo di Alzheimer (AD), ▲▲p < 0,05. (D) Proporzione del tempo di nuoto nel primo quadrante. Rispetto al gruppo N, ◆◆p < 0,05; rispetto al gruppo AD, ▲▲p < 0,05. (E) Numero di attraversamenti dei binari nel quadrante delle banchine. Rispetto al gruppo N, ◆◆p < 0,05; rispetto al gruppo AD, ▲▲p < 0,05. Questa figura è stata riutilizzata con il permesso di Sun et al.5. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Effetti dell'elettroagopuntura sulla deposizione di Aβ. (A) La regione di interesse nell'ippocampo topo è mostrata in verde. (B) Immagini di tomografia a emissione micropositronica di Aβ nei topi di ciascun gruppo. (C) Confronto dei rapporti di valore di assorbimento standardizzati di [18F]AV-45 (SUVR; regione target/cerevelletto) nell'ippocampo di ciascun gruppo, quantificati tramite micro-PET. Rispetto al gruppo N, ◆◆p < 0,05; rispetto al gruppo della malattia di Alzheimer (DA), ▲▲p < 0,05. Questa figura è stata riutilizzata con il permesso di Sun et al.5. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Effetti dell'elettroagopuntura sull'espressione della proteina Aβ. (A) Bande rappresentative Western blot che mostrano i livelli di espressione di Aβ (4 kDa) e GAPDH (146 kDa) come controllo di carico. Le bande illustrano bassa espressione di Aβ nel gruppo N, alta espressione nel gruppo AD e espressione ridotta nel gruppo EA rispetto al modello AD. (B) Analisi quantitativa dell'espressione relativa di Aβ rispetto al GAPDH tra i gruppi sperimentali. Rispetto al gruppo N, ◆◆p < 0,05; rispetto al gruppo del morbo di Alzheimer (AD), ▲▲p < 0,05. Questa figura è stata riutilizzata con il permesso di Sun et al.5. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Visualizzare e quantificare Una deposizione nell'ippocampo offre una finestra cruciale sulla progressione patologicadell'anno 9 d.C. Sebbene esistano molteplici modalità di neuroimaging, ottenere una traduzione ad alta risoluzione, quantitativa e tra specie rimane un ostacolo significativo. Ad esempio, l'imaging a fluorescenza nel vicino infrarosso è spesso limitato dalla risoluzione spaziale, e la risonanza magnetica — pur essendo in grado di mappare le alterazioni strutturali — richiede spesso dosi di agenti a contrasto eccessivamente elevate per delimitare le placche amiloidi in vivo. Al contrario, il PET rappresenta uno strumento traslazionale ottimale, che consente la valutazione dinamica della neuroinfiammazione, del metabolismo del glucosio e dell'accumulo di A sia nei modelli animali che nelle popolazionicliniche 10,11. L'imaging molecolare tramite PET non solo facilita la diagnosi precoce e una precisa stadiazione patologica. ma è anche indispensabile per monitorare l'impegno dei bersagli e l'efficacia delle terapie emergenti per l'AD12. L'avvento della tecnologia micro-PET nell'ambito preclinico ha ampito sostanzialmente l'utilità del PET oltre i contesti clinici e la ricerca sui primati non umani. Caratterizzata da una risoluzione spaziale superiore e un'elevata sensibilità adattata a campi visivi ristretti, la micro-PET consente ai ricercatori di monitorare longitudinalmente la progressione neurodegenerativa nei modelli diroditori 13,14. In modo cruciale, metriche quantitative consolidate come il SUVR calcolato rispetto a regioni di riferimento prive di patologia robusta A, come il cervelletto, possono essere tradotte senza soluzione di continuità dal laboratorio al letto15. Storicamente, l'imaging PET utilizzando specifici traccianti ha mostrato alta sensibilità diagnostica (fino al 90%) e specificità (89%) per AD16,17. Mentre il tracciatore [11C]PIB rivoluzionò la visualizzazione amiloide precoce, la sua breve emivita limitò il suo diffusodispiegamento 18. Lo sviluppo successivo e l'approvazione FDA del 2012 di [18F]AV-45 (Florbetapir) mitigarono questelimitazioni, fornendo un'emivita più lunga insieme a un'eccellente affinità e selettività per Aβ. Di conseguenza, [18F]AV-45 è diventato un elemento fondamentale sia per la diagnostica clinica che per le valutazioniprecliniche 20.

Devono essere considerati diversi passaggi critici e potenziali modifiche durante l'utilizzo di questo protocollo. Innanzitutto, è essenziale un rigoroso controllo dei parametri della radiosintesi; qualsiasi deviazione nella quantità di precursore o nella temperatura di reazione può compromettere gravemente la purezza radiochimica e la resa di [18F]AV-45. In secondo luogo, un allineamento stereotassiano preciso durante l'imaging PET è fondamentale per evitare effetti di volume parziale, che possono distorcere artificialmente i calcoli SUVR nelle piccole regioni ippocampali dei topi. Per la risoluzione di bassi rapporti segnale-rumore nelle immagini PET, i ricercatori dovrebbero verificare l'attività specifica del tracciante iniettato e assicurarsi che la profondità dell'anestesia con isoflurano rimanga stabile, poiché il movimento respiratorio può offuscare le immagini.

Questa metodologia presenta alcune limitazioni. Sebbene il micro-PET AV-45 fornisca una vista macroscopica del carico regionale di Aβ, la sua risoluzione spaziale non consente la visualizzazione di singole placche amiloidi microscopiche. Inoltre, l'intervento elettroagopunture di 15 giorni implementato in questo studio ha dimostrato un'attenuazione significativa del carico di Aβ rispetto ai topi con AD non trattati; tuttavia, dato che la completa eliminazione delle placche Aβ stabilite richiede tipicamente mesi di intervento prolungato, il paradigma attuale riflette principalmente una modulazione precoce della dinamica solubile dell'Aβ o un arresto della deposizione progressiva piuttosto che una completa eliminazione strutturale della placca. Inoltre, ottenere scansioni PET prima e dopo l'intervento nello stesso soggetto fornirebbe un controllo longitudinale più forte, una strategia che dovrebbe essere adottata nei futuri disegni sperimentali.

In sintesi, i risultati di questo studio suggeriscono che l'intervento con elettroagopuntura (EA) mitiga significativamente l'accumulo di Aβ e preserva la funzione cognitiva spaziale nei topi APP/PS1. La base meccanicistica di questo miglioramento potrebbe riguardare gli effetti neuro-modulatori della stimolazione dei punti di agopuntu Governor Vessel (Du Mai) 21, che sono stati anatomicamente collegati a reti fasciali e neurovascolari che promuovono il flusso sanguigno cefalico e le vie di clearing. Fornendo prove di imaging molecolare solide e quantificabili, questo protocollo sottolinea l'importanza di integrare le modalità terapeutiche tradizionali con la neuroimaging avanzata. Questo quadro metodologico apre la strada a indagini più approfondite sulle vie terapeutiche dell'agopuntura nella lotta contro l'AD.

Dichiarazioni

Tutti gli autori hanno dichiarato che non ci sono potenziali conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata sostenuta dalla National Natural Science Foundation of China (n. 82004482, 82274654, 82274644), dalla Beijing Natural Science Foundation (n. 7252219) e dal Fondo per la Coltivazione dell'Innovazione del Sesto Centro Medico dell'Ospedale Generale dell'EPL (n. CXPY202405). Ringraziamo Biorender (biorender.com) per aver fornito gli strumenti grafici utilizzati in questo studio.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
[18F]AV-45Laboratorio Radiofarmaceutico dell'Università Normale di Pechino— —Il tracciante più utilizzato nel settore
0.22 & mu; Membrana m PVDFBeyotimeFFP71Trasferimento efficiente della pellicola
15% Gel SDS-PAGEBeyotimeP0066Ostacolare la migrazione delle proteine a piccole molecole
5 e volte; Buffer di caricamento SDSBeyotimeP0015Assicurati strisce chiare e una separazione accurata.
Mouse maschio APP/PS1 di 6 mesiCavenberg (Suzhou) Ricerca Labotatoria sugli Animali Co., Ltd.SCXK (Su) 2018-0002Ampiamente utilizzato per la ricerca sulla malattia di Alzheimer.
 
Maschio C57BL/6 topi di 6 mesiCavenberg (Suzhou) Ricerca Labotatoria sugli Animali Co., Ltd.SCXK (Su) 2018-0002Per il gruppo di controllo normale
Aβ AnticorpoProteintech25524-1-APRilevamento di A e beta; monomero
Aghi sterili e usa e getta per agopunturaZhongYan TaiHe Medical Instrument Co., LtdZYTH2013030504Strumenti comuni per l'agopuntura
Substrato ECLThermo Fisher (Pierce)  32106 (500 mL)Rilevamento delle proteine bersaglio
Apparecchiature di elettroagopuntura (EA)Beijing Huawei Industrial Development Co., Ltd.HANSLH202Apparecchiature di elettroagopuntura comunemente utilizzate in Cina
GAPDHProteintech23567-1-CBProteina di riferimento classica (1:5000)
Anticorpo secondario coniugato con HRPThermo Fisher Scientific (Invitrogen)31430 (2mL) / C31430100 (100μ L)Rilevamento delle proteine bersaglio (1:2000)
Software ImageJNIH  Versione 1.53aAnalisi dei valori in scala di grigi delle strisce
IsofluranoCentauro30135687 (250ml)Anestesia sicura e rapida dei topi
PET-TCSistema di imaging IRIS PET/CTIRISAlta sensibilità PET e eccellenti prestazioni quantitative
Cocktail di inibitori della fosfatasiBeyotimeP0055BMantenere lo stato di fosforilazione delle proteine
Software PMODTecnologie PMOD  Versione 4.5 Usato per  elaborazione e analisi dei dati di immagini PET
Marcatore di peso molecolare proteico pre-coloratoThermo Fisher (Pierce)26619 (2 volte; 250 e micro; L) Monitoraggio dell'elettroforesi e del trasferimento di membrana 
Cocktail inibitori della proteasiBeyotimeP1046Inibizione ad ampio spettro dell'attività endogena della proteasi
Buffer di lisi RIPABeyotimeP0013CMantenimento della modifica della fosforilazione proteica
Latte scremato in polvere usato nell'apparato Morris Water MazeYili6907992637815Rendere l'acqua opaca e nascondere le piattaforme sott'acqua
Il sistema di labirinto acquatico MorrisChengdu Taimeng Software Co., Ltd.WMT-100SAttrezzature per labirinto d'acqua ampiamente utilizzate in Cina

Riferimenti

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