Indagine del microambiente ovarico: metodi per l'isolamento, la coltura 2D e la coltura organoide delle cellule somatiche ovariche del topo

Sommario

Descriviamo metodi per isolare cellule somatiche ovariche di topo da una frazione arricchita di stroma dell'ovaio e per generare organoidi somatici ovaricos di topo utilizzando un approccio senza impalcatura.

Abstract

L'ovaio è costituito da popolazioni eterogenee di cellule somatiche, sia all'interno del follicolo che dello stroma circostante, che sono fondamentali per sostenere la funzione ovarica e per la generazione di gameti di alta qualità. Riportiamo metodi per isolare cellule somatiche dalle ovaie del topo, inclusi cellule endoteliali, epiteliali, steroidogeniche, stromali e immunitarie. Quando queste cellule somatiche ovarie primarie vengono placcate e coltivate in un sistema tradizionale di coltura 2D, l'eterogeneità cellulare, l'organizzazione, così come le interazioni cellula-cellula e matrice cellulare tipicamente presenti nell'ovaio si perdono. Pertanto, descriviamo anche come generare organoidi somatici ovaricos del topo utilizzando un approccio senza impalcatura. Questi organoidi si auto-assemblano, mantengono popolazioni cellulari diversificate e producono matrice extracellulare e fattori secreti, inclusi i citochine. Gli organoidi possono essere utilizzati per esperimenti di co-coltura e possono essere mantenuti in coltura per almeno 3 settimane con alta vitalità. Nel complesso, questi modelli permettono di esaminare la fisiologia e la patologia ovarica dal punto di vista delle cellule somatiche.

Introduzione

Sebbene l'ovocito, o gameta femminile, sia essenziale per dare origine alla generazione successiva, le popolazioni di cellule somatiche nell'ovaio svolgono ruoli fondamentali nello sviluppo dei gameti, nella produzione di ormoni steroidei e nell'omeostasi ovarica. Gli ovociti, circondati da cellule somatiche della granulosa e della teca, formano le unità funzionali dell'ovaio note come follicoli. Le cellule della granulosa sono fisicamente collegate all'ovocita tramite proiezioni transzonali e forniscono supporto metabolico e nutrizionale all'ovocita oltre a regolare l'arresto^{meiotico 1,2}. Inoltre, in risposta alle gonadotropine, le cellule della granulosa e della teca producono ormoni steroidei, tra cui estrogeni, progesterone e androgeni, che hanno effetti oltre il sistema riproduttivo, influenzando i sistemi cardiovascolare, muscoloscheletrico e nervoso, e quindi sulla salute generale^{femminile 3}. I follicoli ovarici si sviluppano all'interno di uno stroma ovarico eterogeneo composto da vascolare, cellule immunitarie, diverse popolazioni di fibroblasti interstiziali e cellule mesenchimate, oltre a una matrice extracellulare (^ECM)4 altamente ordinata. Questo microambiente stromale fornisce segnali fisici e chimici che influenzano la crescita dei follicoli, l'ovulazione e la^{luteinizzazione.}

Esistono diversi metodi per isolare e coltivare gameti e follicoli in vitro, e questi metodi hanno fatto progredire la nostra comprensione dell'oogenesi e della follicogenesi⁵. Tuttavia, il compartimento somatico dell'ovaio è relativamente poco studiato, in parte a causa della mancanza di modelli robusti in vitro. I modelli attuali del compartimento somatico ovarico sono in gran parte limitati a un singolo tipo cellulare, come fibroblasti, cellule epiteliali superficiali ovarica, endoteliali, immunitarie o^granulosache 6,7,8,9,10,11. La coltura di cellule somatiche ovariche primarie definite in modo ampio in 2D favorisce le popolazioni di macrofagi nel tempo, causando una perdita di eterogeneità^{cellulare 12}. Inoltre, la tradizionale coltura monostrato bidimensionale (2D) non consente le diverse interazioni cellula-cellula e matrice cellulare presenti nell'ovaio. Gli espiantili di tessuto ovarico mantengono la complessità cellulare e strutturale del tessuto nativo ma variano nella composizione a seconda di dove all'interno dell'ovaio sono stati^{derivati 13,14}.

Gli organoidi sono versioni tridimensionali (3D), multicellulari, miniaturizzate di organi o tessuti che riproducono l'organizzazione e le funzioni in vivo ^15,16. Gli organoidi possono essere generati da cellule staminali o primarie isolate da tessuto normale o^{malato 15}. Nel contesto del sistema riproduttivo femminile, sono stati generati organoidi per modellare l'endometrio, la tuba di Falloppio, la cervice e la^{placenta 17}. Tuttavia, per quanto riguarda l'ovaio, fino a poco tempo fa, i modelli organoidi erano limitati a un singolo tipo cellulare, come cellule epiteliali superficiali ovariche o tumorali, oppure sono stati generati da cellule staminali pluripotenti indotte per assomigliare a strutture follicolesi piuttosto che allo stroma^{ovarico 17,18}. Studi recenti hanno generato e caratterizzato organoidi utilizzando popolazioni eterogenee di cellule somatiche isolate da topo, macaco rhesus e tessuto ovarico^umano 19,20,21. Questi modelli organoidi hanno permesso di indagare i meccanismi cellulari alla base dell'invecchiamento ovarico, nonché gli effetti dell'esposizione ai ftalati sulla composizione^{ECM 19,21}.

Data l'importanza critica delle cellule somatiche, sia nel follicolo che nello stroma, per la funzione ovarica, descriviamo metodi per isolare le cellule somatiche da una frazione arricchita di stroma delle ovaie del topo e per la loro coltivazione in vitro utilizzando la coltura monostrato tradizionale o un modello organoide. Utilizzando microstampi di agarosio senza impalcatura, le cellule somatiche ovariche formano organoidi entro 1–3 giorni. Gli organoidi preservano popolazioni chiave di cellule ovarie, inclusi fibroblasti, macrofagi e cellule steroidogeniche, e possono essere coltivati fino a 3 settimane con alta vitalità. Gli organoidi somatici ovarici sono favorevoli a valutazioni trascristatiche e istologiche, analisi di mezzi condizionati, co-coltura con altri tipi cellulari e metodi di screening dei composti. Nel complesso, questi organoidi rappresentano un modello solido per l'interrogazione e la modulazione in vitro del compartimento somatico ovarico e possono essere applicati allo studio dello sviluppo, dell'invecchiamento, della fisiologia e della patologia ovarica.

Protocollo

L'uso di animali per sviluppare questo protocollo è stato in conformità con il Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali Istituzionali della Northwestern University e con le Linee Guida per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio del National Institute of Health (Numero di Garanzia del Benessere Animale della Northwestern University: A3283-01; ID protocollo IACUC: IS00013082_IM12). Le informazioni del produttore e i numeri di catalogo per tutti i materiali, inclusi i calchi in silicone per microstampi, supporti e integratori in agarosio, sono riportate nella Tabella dei Materiali. Una panoramica dei passaggi del protocollo è presentata nella Figura 1. Tutti i passaggi del protocollo devono essere eseguiti utilizzando dispositivi di protezione individuale appropriati, in conformità con tutte le normative istituzionali sulla biosicurezza e sulla salute e sicurezza ambientale e, salvo diversa specificazione, all'interno di un armadietto di biosicurezza di Classe II.

Figura 1: Schema dell'isolamento delle cellule somatiche ovariche del muro, generazione di organoidi somatici ovarici e applicazioni a valle. Le ovaie del topo sono isolate e la frazione stromale è arricchita. La frazione stromica arricchita viene digerita sia in modo enzimatico che meccanico. Il tessuto non digerito viene stirato fuori. Le cellule vengono imbottite, lavate, contate e impiattate per la coltura in 2D. Per la generazione di organoidi, dopo la coltura 2D durante la notte, le cellule vengono prelevate utilizzando tripsina e vengono messe in pellet, lavate e contate. Le cellule vengono seminate in microstampi di agarosio per la coltura di organoidi. Gli organoidi possono essere utilizzati per istologia, estrazione di RNA/proteine, analisi di mezzi condizionati, trattamenti e screening farmacologici, oltre che per la co-coltura. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Preparazione dei mezzi per l'isolamento e la coltura delle cellule somatiche ovariche

NOTA: La digestione del tessuto ovarico e la successiva isolazione e coltura delle cellule somatiche primarie richiedono quattro tipi di mezzi: mezzi sezionali (DM; usati nei passaggi 2.3–2.4 per la dissezione e la puntura delle ovaie del topo), mezzi enzimatici (EM; usati nei passaggi 2.5–2.8 per la digestione enzimatica delle ovaie topi arricchite da stroma), mezzi di tempra (QM; usati nello Passo 2.9 per rallentare la digestione enzimatica), e mezzi di impiccatura (PM; utilizzati nei passaggi 2.11–2.14 e 4.6 per il lavaggio, la placcatura e la coltura 2D delle cellule somatiche ovariche primarie, nonché per l'inattivazione della tripsina durante il prelievo delle cellule dalla coltura 2D). Tutti i mezzi devono essere preparati in un armadietto di sicurezza biologica sterilizzato di Classe II o in una cappa a flusso laminare. Le ricette dei substrati elencate di seguito sono sufficienti per processare ovaie da 5–6 topi, ma devono essere scalate secondo necessità. Tutti i mezzi possono essere preparati fino a una settimana prima e conservati a 4 °C, ma gli enzimi per l'EM devono essere aggiunti freschi il giorno dell'isolamento cellulare.

1. Prepara DM (15 mL) contenente 1% di siero bovino fetale (FBS) e 0,5% di penicillina-streptomicina (PS) nel mezzo L-15 di Leibovitz. Sterilizza il substrato usando un filtro sterile.
   NOTA: La DM viene tamponata per lo scambio d'aria ambientale e utilizzata durante la microdissezione dell'ovaio dai tessuti circostanti, così come per l'arricchimento della frazione stromica.
2. Prepara EM (10 mL) contenente FBS all'1% e 0,5% PS in αMEM. Aggiungi 82 unità enzimatiche/mL di collagenasi IV e 0,2 mg/mL di DNasi I (≥400 unità di attività enzimatica/mg). Sciogli gli enzimi invertendo e poi sterilizza il substrato usando un filtro sterile.
   NOTA: I mezzi enzimatici sono tamponati con bicarbonato di sodio per lo scambio d'aria al 5% di_CO2 e utilizzati per la digestione enzimatica dei pezzi di tessuto ovarico.
3. Prepara QM (20 mL) contenente 10% FBS e 0,5% PS in mezzo αMEM. Sterilizza il substrato usando un filtro sterile.
   NOTA: La QM è tamponata con bicarbonato di sodio per lo scambio d'aria al 5% di_CO2 e utilizzata per la tempra della digestione enzimatica.
4. Prepara PM (30 mL) contenente il 10% di FBS e l'1% di PS in RPMI 1640 (contenente 25 mM HEPES e 2 mM L-Glutamina). Sterilizza il substrato usando un filtro sterile.
   NOTA: Il PM è buffato con bicarbonato di sodio per lo scambio d'aria al 5% di_CO2 e utilizzato per la placcatura delle cellule somatiche ovariche primarie, oltre che per la coltura in 2D.

2. Digestione del tessuto ovarico e isolamento delle cellule somatiche primarie

NOTA: Le ovaie del topo vengono isolate e digerite sia in modo enzimatico che meccanico per isolare le cellule somatiche primarie. Le ovaie di 5–6 topi possono essere processate insieme nello stesso piatto. I passaggi seguenti devono essere eseguiti con tecniche asettiche, preferibilmente utilizzando un microscopio dissezionale in una cappa a flusso laminare.

1. Aggiungi 10 mL di EM, 20 mL di MQ e 20 mL di PM in piastre di Petri separate da 100 mm. Bilanciare le ciotole in un incubatore di coltura tissutale (ambiente umidificato, 37 °C con 5% di CO₂) per almeno 1 ora prima dell'uso.
2. Fai caldo il DM in un bagno d'acqua (37 °C) prima dell'uso.
3. Dissezionare le ovaie del topo in una piastra di Petri da 35 mm contenente 3 mL di DM. Separare le ovaie dal tessuto adiposo attaccato, dall'ovidotto e dalla borsa ovarica usando pinze a punta fine e/o microforbici (Figura 2Ai,ii). Utilizzare un microscopio dissezionale secondo necessità per la microdissezione.
4. Trasferire le ovaie dissezionate su un vetro da orologio da 45 mm con 2–3 mL di DM. Al microscopio dissezionante, ancorare e perforare tutte le aree delle ovaie usando aghi di insulina da 28-G con le mani non dominante e dominante, rispettivamente, per circa 10 minuti. Ruota frequentemente il tessuto ovarico per assicurarti che tutte le aree vengano disturbate.
   NOTA: La perforazione delle ovaie arricchisce la frazione stromale rilasciando follicoli preantrali così come complessi cumuli-ovociti e cellule di granulosa dai follicoli antrali (Figura 2Aiii–iv).
5. Utilizzare pinze a punta fine per spostare ovaie di topo arricchite da stroma verso la piastra di Petri con EM equilibrata (Figura 2Bi).
6. Lavorando rapidamente per minimizzare le variazioni di temperatura e pH del mezzo, si strappano le ovaie arricchite con stroma in pezzi di circa 2–3 mm con pinze a punta fine (Figura 2Bii).
7. Tieni la piastra di Petri inclinata e pipetta ripetutamente EM contenente pezzi di tessuto ovarico con una pipetta p1000, impostata a 1 mL, 100× o per 3 minuti, a seconda di quale prima arrivi (Figura 2Biii). Fai roteare la piastra di Petri se necessario per assicurarti che tutti i pezzi di tessuto siano pipettati.
   NOTA: Se il tessuto è troppo grande per essere pipettato con una punta p1000, la punta può essere tagliata con un bisturi sterile per allargare l'apertura. Il foro dovrebbe essere abbastanza largo da permettere l'ingresso della maggior parte (>50%), ma non di tutti, i pezzi di tessuto, creando un effetto di tosatura.
8. Trasferire la piastra di Petri contenente pezzi di EM e tessuto ovarico in un incubatore di coltura tissutale (ambiente umidificato, 37 °C con 5% di_CO2) e incubare per un totale di 30 minuti, rimuovendo la piastra e pipotando ripetutamente (100× o per 3 minuti) dopo 15 minuti, e poi di nuovo alla fine dei 30 minuti di incubazione (Figura 2Biii).
   NOTA: Dopo i primi 15 minuti di incubazione, i pezzi di tessuto dovrebbero essere digeriti abbastanza da permettere che l'>80% passi attraverso una punta di pipetta p1000 senza dover tagliare la punta per allargare l'apertura. La durata totale della digestione e la quantità di pipettura necessaria dipenderanno dalla dimensione iniziale dei pezzi di tessuto strappati. Inoltre, l'età e lo sforzo del topo, la variabilità da lotto a lotto nell'attività degli enzimi e la dimensione del foro della pipetta possono tutti influenzare la velocità di degrado del tessuto. La digestione deve essere stintata quando i frammenti di tessuto ovarico sono scomposti in frammenti di circa 1 mm ancora visibili a occhio libero (Figura 2Biv). Una digestione eccessiva può causare perdita cellulare e diminuzione della vitalità cellulare.
9. Diluire gli enzimi per rallentare la digestione dei tessuti aggiungendo 20 mL di MQ pre-equilibrata (Figura 2Ci).
10. Far passare la sospensione cellulare attraverso un colino cellulare da 40 μm posizionato su un tubo conico da 50 mL per rimuovere i pezzi di tessuto non digerito (Figura 2Cii). Centrifugare il filtrato a 300 × g per 5 minuti a temperatura ambiente per pelletare le celle (Figura 2Ciii).
11. Lavare le cellule rimuovendo il soprantantante tramite aspirazione, risospendendo il pellet cellulare in 1 mL di PM prebilanciato, trasferendo la sospensione cellulare in un tubo microcentrifugante da 1,5 mL e centrifugando a 300 × g per 5 minuti a temperatura ambiente per poi pelletare nuovamente le cellule (Figura 2Civ).
12. Rimuovere il soprantantante, risospendere il pellet cellulare in 1 mL di PM, colorare un'aliquota di 10 μL di cellule con blu di tripano per valutare la vitalità cellulare e contare le cellule utilizzando un emocitometro.
    NOTA: Vedi la Tabella 1 per il numero previsto di cellule somatiche ovariche primarie, a seconda della tensione e dell'età del topo, in questa fase del protocollo di isolamento. La vitalità cellulare a questo stadio dovrebbe essere dell'>80%.
13. Placcare le cellule su un vaso trattato con coltura tissutale a una densità approssimativamente di 1,25 × 10 5-1,5 × 10⁵/^cm2 (ad esempio, per conteggi cellulari di circa 3 × 10⁶, cellule a piastra su un piatto trattato con coltura tissutale da 60 mm, e per conteggio cellulare di circa 1 × 10⁶, cellule a piastra su un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti trattata con coltura tissutale).
    1. Aggiungi PM aggiuntiva a seconda del volume totale del piatto o del piatto (ad esempio, aggiungi 4 mL di PM se usi un piatto da 60 mm o 2 mL di PM se usi un pozzo di piastra a 6 pozzi).
       NOTA: La densità di placcatura sopra elencata è raccomandata se le cellule saranno utilizzate per la generazione di organoidi dopo la coltura 2D durante la notte. Per una coltura 2D più lunga, le cellule possono essere placcate a densità inferiore. I mezzi di impiccatura extra che non sono stati bilanciati possono essere conservati a 4 °C per un massimo di 1 settimana. Il PM è necessario sia per la generazione di organoidi sia per mantenere le cellule somatiche ovariche in coltura 2D. A questo punto del protocollo, le cellule somatiche ovariche possono essere mantenute in una coltura monostrato 2D (passo 2.14) oppure possono essere utilizzate per generare organoidi (prosegui alla Sezione 3). È necessaria una coltura 2D notturna prima della generazione dell'organoide per rimuovere eventuali ovociti dai follicoli in fase iniziale che potrebbero essere passati attraverso il filtro cellulare a 40 μm.
14. Dopo la placcatura durante la notte (minimo 16 ore), lavare le cellule con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS; Mg/Ca-free (pH 7,0–7,3) per rimuovere cellule morte e detriti (Figura 3A). Aggiungi PM fresco dopo il lavaggio e sostituisci il substrato con PM fresco a giorni alterni durante la cultura (Figura 3B).
    NOTA: Nonostante un'elevata vitalità cellulare dopo l'isolamento, si osserva tipicamente un grande attrito del conteggio cellulare totale dopo la placcatura durante la notte, dovuta sia alla morte cellulare sia all'incapacità di attaccarsi al vaso della coltura tissutale (Figura 3A).

Figura 2: Schema dell'isolamento delle cellule somatiche ovariche del muro. (A) Immagini rappresentative della (i,ii) dissezione ovarica del topo e (iii,iv) arricchimento stroma. L'ovaio del topo è delineato con una linea tratteggiata in Ai. (B) Immagini rappresentative di frammenti di tessuto ovarico durante la digestione meccanica ed enzimatica. Ovaie arricchite con stroma (i) prima e (ii) dopo la lacerazione, (iii) pezzi di tessuto ovarico durante la pipetazione e (iv) pezzi di tessuto ovarico dopo la digestione. (C) Immagini rappresentative di (i) stemperamento della digestione, (ii) filtraggio della sospensione cellulare e (iii,iv) pelleting delle cellule somatiche ovariche primarie del muro. Gli inserti in Cii e Ciii mostrano frammenti di tessuto non digerito catturati rispettivamente dallo scolpo cellulare e dalla pellet cellulare dopo la centrifugazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Le cellule somatiche ovariche primarie possono essere coltivate in 2D. (A) Immagini rappresentative di luce trasmessa delle cellule somatiche ovariche primarie placcate in un piatto da 60 mm 16 ore dopo la placcatura, prima e dopo il lavaggio con PBS. (B) Immagini rappresentative di luce trasmessa di cellule somatiche ovariche primarie placcate in una piastra a 24 pozzetti per 3 giorni in coltura. Barre della scala = 400 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Preparazione di microstampi e mezzi di agarosio per la generazione e la cultura di organoidi

NOTA: Gli organoidi somatici ovaricos vengono generati e coltivati in microstampi di agarosio senza impalcature con mezzi organoidi ovarico. Microstampi di agarosio e mezzi organoidi ovarici devono essere preparati con tecniche asettiche in un armadietto di sicurezza biologica sterilizzato di Classe II o in una cappa a flusso laminare.

1. Preparazione di microstampi di agarosio
   1. Inserire calci in silicone per microstampi e pinze Graefe in una sacca di sterilizzazione e in autoclave usando un ciclo di asciuttura per sterilizzar (pressione nella camicia: 20 psi, temperatura della camera: 250 °F (121,11 °C, tempo di sterilizzazione: 15 min).
      NOTA: Diversi calchi in silicone possono essere autoclavati e utilizzati contemporaneamente per una generazione più rapida di microstampi di agarosio.
   2. Aggiungere 1 mL di PBS contenente l'1% di PS in ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzi per la conservazione dei microstampi di agarosio.
   3. Sciogli l'1,5% (p/v) di agarosio sterile in PBS riscaldandolo in un microonde, in un bagno d'acqua calda o su una piastra riscaldante.
      NOTA: Sciogliere l'agarosio riscaldando al microonde in un tubo conico da 50 mL posto in un becher da 100 mL pieno d'acqua funziona bene (Figura 4Ai). Oltre a consentire un controllo controllato dell'ebollizione, il bagno d'acqua calda creato nel becher rallenta la risolidificazione dell'agarosio.
   4. Lascia raffreddare l'agarosio liquido fino a circa 50 °C finché il tubo non può essere maneggiato comodamente.
   5. Pipettare lentamente 300–350 μL di agarosio all'1,5% nel calco in silicone, assicurandosi di non riempire troppo o meno il cast ed evitando di creare bolle (Figura 4Aii). Assicurati che l'agarosio crei uno strato piatto nella parte superiore del calo piuttosto che un bordo concavo o convesso (Figura 4Aiii,iv). Scoppiare bolle usando una punta sterile di pipetta p10 prima che l'agarosio inizi a solidificarsi (Figura 4Bi–iii).
   6. Lascia solidificare l'agarosio nella fusione di silicone per 2–3 minuti a temperatura ambiente (Figura 4Biv).
   7. Una volta solido, inverti il silicone gettato su un pozzo della piastra di coltura tessutale a 24 pozzi contenente PBS + 1% PS. Fletti con attenzione il silicone per rilasciare il microstampo di agarosio nella piastra (Figura 4Ci).
      NOTA: Microstampi di agarosio immersi in PBS +1% PS in una piastra di coltura tissutale a 24 pozzi avvolta in parafilm possono essere conservati a 4 °C fino a 1 mese prima dell'uso (Figura 4Cii). I microstampi di agarosio devono essere preparati almeno 16 ore prima dell'uso, poiché i micropozzi spesso contengono bolle d'aria immediatamente dopo la colata e l'immersione in PBS + 1% PS (Figura 4Ciii). Tuttavia, queste bolle d'aria si dissipano durante la conservazione (Figura 4Civ). Prima dell'uso per la coltura organoide, gli inserti micropozzo di agarosio devono essere esaminati attentamente al microscopio per confermare che i micropozzi non siano stati fusi o disturbati durante la fusione (Figura 4Di–iv). I microstampi difettosi non sono raccomandati per la generazione e la coltura di organoidi. Si raccomanda di preparare un eccesso di microstampi di agarosio per compensare ~25% che presentano difetti
2. Preparazione dei mezzi organoidi ovarici
   1. In un armadietto di biosicurezza, aggiungere integratori di mezzo di crescita organoide (Mouse) 1 e 2 e 1% di PS al mezzo basale secondo le istruzioni del produttore. Conservare il substrato organoide ovarico preparato a 4 °C per un massimo di 2 settimane prima dell'utilizzo.
      NOTA: Gli integratori 1 e 2 possono essere allicitati e conservati a -20 °C.

Figura 4: Schema che mostra la preparazione dei microstampi di agarosio. (A) immagini rappresentative di (i) preparazione all'1,5% di agarosio, (ii) pipettaggio in calchi in silicone, (iii) calchi di silicone correttamente riempiti e (iv) calchi in silicone sovrapieni. Le linee tratteggiate in Aiii e Aiv mostrano rispettivamente fondi piatti e convessi dei microstampi di agarosio. (B) Immagini rappresentative di (i,ii) calchi di silicone riempiti con bolle nell'agarosio, (iii) scoppiare bolle con la punta di una pipetta prima della solidificazione dell'agarosio, e (iv) un microstampo di agarosio solidificato all'interno del calo di silicone. (C) Immagini rappresentative di (i) rimozione di microstampi di agaroso solidificati dai calchi in silicone, (ii) conservazione dei microstampi di agarosio in piastre a 24 pozzi contenenti PBS + 1% PS, (iii) bolle presenti nei micropozzi immediatamente dopo la fusione, e (iv) microstampo d'agarosio senza bolle e correttamente colato dopo 16 ore di conservazione. (D) Immagini rappresentative di microstampi con (i,ii) pozzi combinati, (iii) pozzi interrotti o (iv) danni. Abbreviazioni: PBS = soluzione salina tamponata con fosfato; PS = penicillina-estreptomicina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Generazione e cultura degli organoidi

NOTA: Dopo la coltura 2D durante la notte, le cellule somatiche ovariche primarie vengono prelevate dalla coltura 2D e seminate in microstampi di agarosio per generare organoidi. I seguenti passaggi devono essere eseguiti utilizzando una tecnica asettica in un armadietto di sicurezza biologica sterilizzato di Classe II.

1. Riscaldare il PM e i mezzi organoidi a 37 °C in un bagno d'acqua e riscaldare lo 0,05% di tripsina a temperatura ambiente.
2. Utilizzando le pinze Graefe, trasferire con cura i microstampi nei pozzi di una nuova piastra a 24 pozzi (Figura 5Ai).
3. Aggiungere 500 μL di mezzo organoide ovarico a ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzi contenente un microstampo di agarosio (Figura 5Aii). Assicurati che i microstampi siano completamente sommersi nel materiale e bilancia microstampi e substrati per almeno 30 minuti in un incubatore (ambiente umidificato, 37 °C con 5% di_CO2).
4. Rimuovere il PM dalle cellule somatiche ovariche aderenti aspirando e lavare le cellule con PBS privo di Mg/Ca.
5. Aggiungere lo 0,05% di tripsina (1–2 mL di tripsina per una piastra a 6 pozzi o un piatto da 60 mm) per prelevare le cellule dalla coltura 2D. Incubare le cellule con tripsina per 2–3 minuti a 37 °C in un incubatore.
6. Confermare che le cellule si siano staccate al microscopio e inattivare la tripsina aggiungendo due volumi di PM riscaldato per ogni volume di tripsina utilizzato.
7. Trasferire la sospensione della cella in un tubo conico da 15 mL e mettere le celle in centrifugazione a 300 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.
8. Risospendere le cellule in 1 mL di PM riscaldato, colorare un'aliquota di cellule con blu di tripano per valutare la vitalità cellulare e contare le cellule utilizzando un emocitometro.
   NOTA: Vedi la Tabella 1 per il numero previsto di cellule somatiche ovariche primarie, a seconda del ceppo e dell'età del topo, dopo la coltura 2D durante la notte e la successiva tripsinizzazione. La vitalità delle cellule tripsinizzate è tipicamente superiore al 90%.
9. Granulare le cellule tramite centrifugazione (300 × g per 5 minuti a temperatura ambiente) e risospendere il pellet cellulare in mezzo organoide ovarico a una densità di 3,33 × 10⁶ cellule vive per 1 mL di mezzo, cioè 2,5 ×^{10 5} cellule vive per 75 μL di mezzo.
   NOTA: Qui, 2,5 × 10⁵ cellule vengono seminate per ogni microstampo di agarosio. Pertanto, il numero totale di microstampi che possono essere generati dipenderà dal numero totale di cellule. Gli organoidi possono essere generati con meno di 2,5 × 10⁵ cellule per micromaffo di agarosio, ma la dimensione degli organoidi, la cinetica di aggregazione, la composizione cellulare relativa e le funzioni, inclusa la produzione ormonale, possono essere influenzate.
10. Rimuovere i microstampi di agarosio equilibrati dall'incubatrice, assicurarsi che i microstampi siano orientati in modo che la camera di semina cellulare sia rivolta verso l'alto e rimuovere il mezzo organoide ovarico dalle camere di semina cellulare (Figura 5Aiii).
    1. Rimuovi il substrato dalle camere di semina cellulare dei microstampi usando le pinze Graefe per sollevare e inclinare i microstampi o pipettando. Per rimuovere il substrato dalle camere di semina cellulare tramite pipetta, si mantiene delicatamente la punta della pipetta sopra l'angolo della camera di semina cellulare mentre si estrae il substrato. Non entrare in contatto diretto con il microstampo di agarosio per evitare di disturbare i micropozzi.
       NOTA: Le camere di semina cellulare dovrebbero essere il più asciutte possibile, in modo che i micropozzi siano visibili a occhio, ma l'esterno dei microstampi dovrebbe comunque essere circondato da mezzi organoidi ovarici (Figura 5Aiii).
11. Dispensare 75 μL della sospensione cellulare (cioè 2,5 × 10⁵ cellule) direttamente nella camera di semina cellulare di ogni microstampo di agarosio ed evitare di creare bolle (Figura 5Bi). Riporta la piastra a 24 pozzi nell'incubatrice.
12. Una o due ore dopo la semina cellulare, aggiungere ulteriori 250 μL di mezzo organoide ovarico riscaldato intorno all'esterno dei microstampi di agarosio, facendo attenzione a non disturbare le camere di semina cellulare (Figura 5Bii).
    NOTA: Le cellule somatiche ovariche primarie dovrebbero iniziare ad aggregarsi entro 1–24 ore dopo la semina nei microstampi di agarosio (Figura 5Biii).
13. Sostituire il substrato che circonda i microstampi di agarosio con 750 μL di substrato organoide ovarico fresco il giorno successivo alla semina cellulare e successivamente a giorni alterni durante la coltura.
    1. Per cambiare il supporto, tieni la piastra con un leggero angolo per rimuovere il materiale esaurito intorno ai microstampi di agarosio. Non rimuovere il materiale dalle camere di semina delle cellule. Pipetta delicatamente il substrato fresco verso la parete del pozzo per evitare di disturbare le camere di semina delle cellule.
       NOTA: I mezzi condizionati derivanti da modifiche al mezzo possono essere salvati e conservati a -80 °C per l'analisi dei fattori organoidi secreti. Una volta formati gli organoidi (1–3 giorni dopo la semina cellulare), i mezzi possono essere sostituiti con substrati contenenti proteine ricombinanti, inibitori, ecc., per esaminare gli effetti di vari trattamenti sulla funzione organoide o per lo screening dei composti.

Figura 5: Schema della generazione degli organoidi somatici ovarico. (A) Immagini rappresentative di (i) trasferimento di microstampi di agarosio alla piastra di coltura con pinze di Graefe, (ii) equilibrio di microstampi di agarosio in mezzi organoidi ovarico, e (iii) rimozione di mezzi dalle camere di semina cellulare. La freccia in Aiii indica camera di semina delle celle vuota. (B) Immagini rappresentative di (i,ii) semina di cellule in microstampi di agarosio e (iii) una scansione a luce trasmessa di un microstampo di agarosio contenente cellule somatiche ovariche aggregante. Barra della scala (Biii): 2500 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

5. Utilizzo degli organoidi per applicazioni a valle

NOTA: Gli organoidi possono essere utilizzati per una varietà di applicazioni a valle, tra cui istologia, applicazioni in biologia molecolare (ad esempio, analisi di RNA/proteine), analisi di mezzi condizionati e co-coltura.

1. Istologia
   NOTA: Gli organoidi possono essere processati per ottenere punti finali istologici senza rimozione dai microstampi di agarosio. In effetti, gli organoidi all'interno dei microstampi di agarosio agiscono in modo simile ai microarray tissutali, permettendo così una valutazione istologica ad alta produttività di diversi organoidi distanziati in modo coerente contemporaneamente.
   1. Sciogliere l'1,5% (p/v) di agaroso sterile nel PBS bollendo.
   2. Dopo la coltura degli organoidi somatici ovarico, tieni la lamina inclinata e rimuovi il materiale che circonda i microstampi di agarosio.
   3. Al microscopio dissezionante, rimuovere il substrato dalle camere di semina cellulare facendo fluttuare delicatamente una punta di pipetta sopra l'angolo di ogni camera di semina cellulare e tirando con cura il substrato senza disturbare gli organoidi o disturbare il microstampo stesso.
   4. Con cura si pipettano 100–125 μL di agarosio liquido all'1,5% raffreddati a circa 50 °C nell'angolo di ogni camera di semina cellulare per riempire e sigillare le camere di semina cellulare, facendo attenzione a non disturbare gli organoidi (Figura 6Ai).
   5. Lascia solidificare l'agarosio per 2–3 minuti a temperatura ambiente.
   6. Aggiungi 750 μL di Davidson modificato o paraformaldeide al 4% in ciascun pozzo e fissa gli organoidi all'interno dei microstampi sigillati di agarosio durante la notte a 4 °C.
   7. Dopo la fissazione, rimuovere il fissativo e lavare i microstampi di agarosio con etanolo al 70%.
      NOTA: I microstampi possono essere conservati al 70% di etanolo a 4 °C fino alla lavorazione dei tessuti (disidratazione, pulizia e infiltrazione della cera). Durante la lavorazione dei tessuti, tieni traccia dell'orientamento dei microstampi di agarosio.
   8. Dopo la lavorazione dei tessuti, si infondono i microstampi di agarosio nella paraffina in modo che i microstampi siano piatti all'interno dei blocchi di paraffina e che la parte inferiore dei microstampi sia la prima a essere sezionata (Figura 6Aii).
   9. Blocca la paraffina a 5 μm e posiziona le sezioni di tessuto su vetri carichi del microscopio.
      NOTA: La presenza di micropozzi può essere visualizzata dall'occhio durante la sezionamento sia nelle sezioni di tessuto sia nei blocchi di paraffina (Figura 6Aiii,iv). La presenza di organoidi all'interno delle sezioni del micromaffo può essere verificata esaminando vetrine sezionate al microscopio (Figura 6Av). Invece di posizionare 2–3 sezioni consecutive sulla stessa vetrina, posizionare 2–3 sezioni ciascuna distanti 50 μm (cioè ogni^decima sezione) su una singola vetrina aumenta la probabilità che la maggior parte degli organoidi sia rappresentata in almeno una sezione su ciascuna vetrina. Gli organoidi sono costantemente distanziati all'interno delle sezioni tissutali, aumentando la facilità di imaging dopo la colorazione istologica (Figura 6Avi).
   10. Lascia asciugare i vetri in forno a 37 °C durante la notte.
   11. Procedere con la colorazione istologica o immunoistochimica oppure conservare le vetrine a temperatura^{ambiente 19}.
2. Raccolta di organoidi per applicazioni molecolari
   NOTA: Dopo la coltura, gli organoidi possono essere rimossi dai microstampi di agarosio e processati per una varietà di applicazioni successive in biologia molecolare, inclusa l'estrazione di RNA o proteine per valutare l'espressione genica o proteica.
   1. Tieni la piastra contenente i microstampi di agarosio inclinata leggermente e rimuovi il materiale che circonda i microstampi di agarosio tramite pipetta.
   2. Aggiungi 750 μL di PBS a temperatura ambiente ai pozzi contenenti i microstampi di agarosio.
   3. Usa le pinze Graefe per invertire e agitare i microstampi di agarosio e liberare gli organoidi nel PBS circostante. Confermare il rilascio degli organoidi dai microstampi di agarosio al microscopio.
   4. Rimuovere i microstampi vuoti di agarosio usando le pinze Graefe e trasferire il PBS contenente gli organoidi in tubi microcentrifuga tramite pipetta.
   5. Mettere gli organoidi in pellet centrifugando a 10.000 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.
   6. Rimuovere il soprantantante aspirando e procedere con l'estrazione di RNA o proteine. In alternativa, congelare rapidamente la capsula e conservarla a -80 °^{C 19}.
3. Salvataggio dei mezzi condizionati organoidi per l'analisi
   NOTA: I mezzi condizionati dagli organoidi possono essere conservati durante la coltura per l'analisi dei fattori segregati dagli organoidi, inclusi ormoni, citochine e fattori di crescita. I risultati rappresentativi dell'analisi delle citochine in mezzi condizionati da organoidi sono mostrati nella Figura 7A.
   1. Tieni la piastra contenente i microstampi di agarosio con un leggero angolo e rimuovi il materiale condizionato che circonda i microstampi tramite pipetta. Non rimuovere il materiale dalle camere di semina cellulare per evitare di disturbare gli organoidi.
   2. Trasferire il materiale condizionato in tubi microcentrifughe e procedere con l'analisi del materiale o il congelamento rapido e conservare a -80 °^{C 19,22}.
      NOTA: Opzionalmente, centrifuga il mezzo condizionato a 10.000 × g per 5 minuti per eliminare cellule morte o detriti. Trasferire il soprandanante su nuovi tubi microcentrifughe prima dell'analisi o dello stoccaggio del supporto.
4. Co-cultura organoide
   NOTA: Gli organoidi somatici ovarici possono essere co-colti con altre cellule e tessuti attraverso diversi metodi. I risultati rappresentativi della co-coltura di organoidi con cellule e follicoli del cancro ovarico, con i metodi descritti rispettivamente nei passaggi 5.4.1 e 5.4.3, sono mostrati in Figura 7B,C.
   1. Per generare organoidi utilizzando una combinazione di cellule somatiche ovariche primarie di topo e altri tipi cellulari per indagare gli effetti delle interazioni cellulari dirette, segui i passaggi 5.4.1.1–5.4.1.4.
      1. Segui i passaggi 4.1–4.9 per lavare le cellule somatiche ovariche primarie dopo la coltura 2D durante la notte, prelevare le cellule dalla coltura 2D usando tripsina allo 0,05%, pellet, contare e risospendere le cellule nel mezzo organoide ovarico a una densità di 2,5 × 10⁵ cellule vive per 75 μL di mezzo.
      2. Se l'altro tipo cellulare di interesse è aderente, prelevare le cellule da una coltura 2D. Contare le cellule, metterle in pellet tramite centrifugazione e risospendere in mezzo organoidale ovarico a una densità di 2,5 × 10⁵ cellule vive per 75 μL di mezzo.
      3. Combinare la sospensione delle cellule somatiche ovariche primarie con la sospensione dell'altro tipo cellulare di interesse a un rapporto noto.
      4. Segui i passaggi 4.10–4.13 per seminare la sospensione cellulare risultante in microstampi di agarosio e coltivare organoidi.
   2. Per trasferire microstampi di agarosio contenenti organoidi formati su piastre a 24 pozzetti contenenti altre cellule o organoidi, si seguono i passaggi 5.4.2.1–5.4.2.4.
      NOTA: Per valutare gli effetti dei fattori secreti derivati dagli organoidi su altri tipi cellulari e viceversa, gli organoidi formati possono rimanere all'interno dei microstampi di agarosio, e interi microstampi di agarosio possono essere trasferiti su una piastra a 24 pozzi contenente altre cellule o organoidi. Questi metodi di co-coltura possono essere utilizzati quando i mezzi organoidi ovarici possono essere utilizzati per coltivare entrambi i tipi cellulari e tessuti.
      1. Calda il mezzo organoide ovarico fino a 37 °C in un bagno d'acqua.
      2. Tieni la piastra contenente i microstampi di agarosio ad angolo e rimuovi il materiale che circonda i microstampi di agarosio tramite pipetta.
      3. Utilizzando le pinze Graefe, trasferire con attenzione i microstampi in piastre a 24 pozzetti contenenti altre cellule o organoidi.
      4. Aggiungi 750 μL di nuovo substrato organoide ovarico per circondare i microstampi di agarosio.
   3. Per rimuovere gli organoidi formati dai microstampi di agarosio e trasferirli in nuovi microstampi di agarosio, si seguono i passaggi 5.4.3.1–5.4.3.13.
      NOTA: Se i mezzi organoidi ovarici non sono i mezzi desiderati per esperimenti di co-coltura, il paradigma descritto nel passo 5.4.2 pone la sfida di un significativo trasferimento del mezzo, dato che i microstampi di agarosio sono saturi di mezzi organoidi ovarici. Gli organoidi formati (1-3 giorni dopo la semina iniziale delle cellule) possono essere spostati dai loro microstampi di agarosio e trasferiti in nuovi microstampi di agarosio per ulteriori colture o co-colture al fine di prevenire il trasferimento del substrato.
      1. Riscaldare il substrato desiderato per la co-coltura a 37 °C in un bagno d'acqua.
         NOTA: I mezzi basati su DMEM, αMEM e F12 sono stati utilizzati con successo per esperimenti di co-coltura con organoidi somatici ovarico.
      2. Utilizzando le pinze di Graefe, trasferire con cura i nuovi microstampi di agarosio dal PBS +1% PS nei pozzi di una piastra a 24 pozzetti contenente altre cellule o organoidi per la co-coltura.
      3. Assicurati che i microstampi siano completamente sommersi nel substrato, aggiungi ulteriore materiale desiderato per la co-coltura se necessario e bilancia microstampi e substrati per almeno 30 minuti in un incubatore (ambiente umidificato, 37 °C con 5% di CO₂).
      4. Tieni la lastra contenente i microstampi di agarosio con organoidi formati inclinata leggermente e rimuovi il materiale che circonda i microstampi di agarosio tramite pipetta.
      5. Aggiungere il mezzo desiderato per la co-cultura attorno ai microstampi di agarosio con gli organoidi formati.
      6. Usa le pinze Graefe per invertire e agitare i microstampi di agarosio e liberare gli organoidi nel mezzo circostante. Confermare il rilascio degli organoidi dai microstampi di agarosio al microscopio.
         NOTA: Se le cellule somatiche ovariche primarie non si sono aggregate adeguatamente, gli organoidi potrebbero non rimanere intatti quando vengono rimossi dai microstampi di agarosio. L'assemblaggio dell'organoide può richiedere 1–3 giorni, a seconda della tensione e dell'età dei topi da cui sono state isolate le cellule somatiche ovariche.
      7. Rimuovere i microstampi vuoti di agarosio usando le pinze Graefe e trasferire il materiale contenente gli organoidi in tubi microcentrifughe tramite pipetta.
      8. Centrifugare gli organoidi a 300 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.
      9. Al microscopio dissezionante, rimuovere il soprantantante tramite pipetta, lasciando 50–75 μL di mezzo contenente gli organoidi.
      10. Rimuovi i microstampi equilibrati dall'incubatrice e assicurati che i microstampi siano orientati in modo che la camera di semina delle cellule sia rivolta verso l'alto.
      11. Rimuovere il substrato dalle camere di semina cellulare usando pinze Graefe o pipettando.
          NOTA: I pozzi non dovrebbero contenere più di 500 μL di substrato in modo che le camere di semina cellulare dei microstampi possano essere svuotate.
      12. Trasferire gli organoidi direttamente nella camera di semina cellulare di ogni nuovo microstampo di agarosio tramite pipetta. Riporta la piastra a 24 pozzi nell'incubatrice.
      13. Dopo 1–2 ore, aggiungere ulteriori 250 μL del mezzo desiderato intorno all'esterno dei microstampi di agarosio, facendo attenzione a non disturbare le camere di semina cellulare.

Figura 6: I principali tipi di cellule ovariche sono conservati negli organoidi somatici ovarici. (A) Immagini rappresentative di (i) sigillare un microstampo con agarosio alla fine della coltura, (ii) un microstampo non tagliato e (iii) un microstampo sezionato incorporato in un blocco di paraffina. I micropozzi possono essere visualizzati in sezioni montate (iv), e la presenza di organoidi all'interno di microstampi sezionati può essere (v) confermata al microscopio prima della colorazione istologica (vi). (B) Immagini rappresentative di sezioni di tessuto ovarico e di sezioni organoidi somatiche ovarie dopo colorazione immunoistochimica utilizzando anticorpi contro Vimentina, F4/80, Foxl2 e 3β-HSD. Barre di squama = 20 μm. Abbreviazioni: H&E = ematossilina ed eosina. Questa figura è stata adattata con il permesso di Dipali et ^al.19. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Co-coltura di organoidi somatici ovaricoli con follicoli e cellule tumorali ovarica. (A) La secrezione di citochine organoidi è stata misurata per microstampo di agarosio al quinto giorno di coltura ed è stata normalizzata a mezzi condizionati da microstampi di agarosio senza organoidi. N = 4 microstampi di agarosio. (B) Immagini rappresentative di luce trasmessa dei follicoli ovarici ai giorni 0, 4 e 8 di coltura con o senza organoidi (di controllo) e (i) uno schema del paradigma della co-cultura. Barre della scala = 400 μm. Quantificazione di (ii) sopravvivenza follicale e (iii) crescita in 8 giorni di coltura con o senza organoidi (di controllo). I dati sono mostrati come media ± SD. Alcune barre di errore sono troppo piccole per essere visualizzate. N = 56 follicoli per gruppo. **P < 0,01. (C) Immagini rappresentative a luce trasmessa (in alto) e fluorescenti (in basso) di cellule somatiche ovarie primarie coltivate in un rapporto 10:1 con cellule tumorali ovariche marcate con proteine fluorescenti rosse (OVCAR8-RFP) negli organoidi ai giorni 1, 3 e 5 di coltura. Barre della scala = 400 μm. Abbreviazione: RFP = proteina fluorescente rossa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

6. Consigli per la risoluzione dei problemi

1. Problema 1: Il numero di cellule somatiche primarie ovariche isolate è inferiore al previsto.
   NOTA: Se i frammenti di tessuto ovarico sono costantemente più piccoli di 1 mm o non visibili dall'occhio dopo la digestione enzimatica, il numero cellulare isolati può essere basso a causa della diminuzione della vitalità dovuta a una digestione eccessiva. Se i frammenti di tessuto ovarico sono maggiori di 1 mm dopo la digestione enzimatica, il numero cellulare isolato può essere basso a causa di una digestione insufficiente del tessuto ovarico.
   1. Se i frammenti di tessuto ovarico sono più grandi di 1 mm dopo la digestione enzimatica, si seguono i passaggi 6.1.1.1–6.1.1.2.
      1. Conferma che la Collagenasi IV e la DNasi I rientrino nella loro durata di conservazione raccomandata e non abbiano perso attività enzimatica a causa di una conservazione impropria o, nel caso della DNasi I, cicli ripetuti di congelamento-disgelo.
      2. Aumentare la quantità di pipetamento ripetuto del tessuto ovarico, ridurre la dimensione del foro della punta p1000 se è stata tagliata per allargare l'apertura e/o aumentare il tempo di incubazione nell'EM.
   2. Se i frammenti di tessuto ovarico sono costantemente molto più piccoli di 1 mm dopo la digestione enzimatica, si riduce la quantità di pipetting ripetuto del tessuto ovarico, si aumenta la dimensione del foro della punta p1000 tagliando per allargare l'apertura e/o diminuisci l'incubazione totale nell'EM.
2. Problema 2: Più del ~25% dei microstampi di agarosio colati presentano difetti
   1. Conferma che il molto in silicone sia privo di agarosio residuo e detriti. Se necessario, lava i calchi in silicone con PBS e ri-sterilizza tramite autoclav. Se necessario, riscalda nuovamente l'agarosio all'1% usato per la fusione, poiché l'agarosio che si solidifica potrebbe non riempire uniformemente il molto di silicone e/o causare bolle.
   2. Una volta pipettato nel calco in silicone, lascia che l'agarosio si solidifichi completamente, poiché la rimozione prematura del microstampo di agarosio dal cast può causare micropozzi interrotti.
   3. Conferma che i calchi in silicone non siano sottoriempiti, poiché ciò può ridurre l'integrità strutturale del microstampo di agarosio, causando danni quando il silicone viene fletto per rimuovere il microstampo di agarosio.
   4. Inoltre, il produttore dei calchi in silicone raccomanda che vengano autoclavati non più di 12 volte. Se il calso in silicone è stato sterilizzato eccessivamente, sostituiscilo.
3. Problema 3: Gli organoidi non si formano in più del 10% dei micropozzi
   1. Conferma che i calci in silicone non siano sovraccaricati durante la fusione dei microstampi di agarosio, poiché ciò può portare a una distribuzione irregolare delle cellule nei micropozzi, favorendo i micropozzi centrali del microstampo di agarosio rispetto a quelli esterni.
   2. Evita di creare bolle quando si dispensa la sospensione cellulare nella camera di semina cellulare dei microstampi di agarosio, poiché le bolle possono interrompere la distribuzione delle cellule nei micropozzi.
   3. Se necessario, iniziare con una sospensione di celle superiore a 75 μL (a una densità di 3,33 × 10⁶ cellule vive per 1 mL) per microstampo per assicurarsi che non si formino bolle a causa di volume insufficiente nella punta della pipetta.
   4. Aumentare l'intervallo tra la semina cellulare e l'aggiunta di substrati organoidi ovarici all'esterno del microstampo dell'agarosio per garantire tempo sufficiente alle cellule di depositarsi nei micropozzi.

Risultati

Per determinare la composizione cellulare degli organoidi somatici ovarici, abbiamo eseguito un'immunoistochimica di sezioni di tessuto organoide dopo 6 giorni di coltura utilizzando anticorpi contro i principali tipi di cellule ovarie. Gli organoidi contenevano fibroblasti positivi alla vimentina, macrofagi positivi a F4/80, oltre a popolazioni cellulari steroidogeniche (Figura 6B⁾¹⁹. Abbiamo utilizzato un anticorpo contro Foxl2 per ...

Discussione

Questo articolo descrive metodi per isolare le cellule somatiche ovariche primarie del topo da una frazione stroma arricchita dell'ovaio, in modo da mantenere l'eterogeneità del compartimento somatico ovarico. Le cellule somatiche ovariche primarie di topo possono essere coltivate in uno strato monodimensionale 2D oppure possono essere utilizzate per generare organoidi somatici ovarici utilizzando microstampi di agarosio senza impalcature e senza impalcatura. I microstampi di agarosio co...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0.2 μm, Polyethersulfone syringe filter	Corning	431229
1.5 mL microcentrifuge tubes	MIDSCI	PR-MCT15
100 mL glass beaker	Fisherbrand	FB100100
100 mm Petri dishes	Corning	351029
15 mL conical tubes	ThermoFisher Scientific	339651
24-well plates (TC-treated)	Corning	353047
28-gauge insulin needles	Exel International	26027
35 mm Petri dishes	Corning	351008
3β-HSD antibody	Cosmo Bio	K0607	1:1000
4% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	1574100
40 µm cell strainer	Corning	431750
45 mm watch glass	Electron Microscopy Sciences	7054345
50 mL concial tubes	ThermoFisher Scientific	339652
60 mL sterile syringe	Air-Tite	ML60
60 mm TC-treated plates	Corning	353037
6-well plates (TC-treated)	Corning	353046
Agarose	Hoefer	GR140-500	Gel strength >1200 g/cm2; Gel Temperature 36 °C
Autoclave sterilization pouch	Fisherbrand	01-812-55
Biotinylated Goat Anti-Mouse IgG	Vector Laboratories	BA-9200-1.5	1:200
Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG	Vector Laboratories	PK-6101	1:200
Biotinylated Goat Anti-Rat IgG	Vector Laboratories	BA-9400-1.5	1:100
Bluing reagent	Fisherbrand	23-245681
Centrifuge with swing bucket rotor for 50 mL conical tubes	ThermoFisher Scientific	Sorvall X1R Pro-MD
Class II biosafety cabinet	The Baker Company	SG403A
Cleaved Caspase-3 (CC3) antibody	Cell Signaling Technology	9579T	1:250
CO2 incubator	ThermoFisher Scientific	Heracell VIOS 160i CO2 Incubator
Collagenase, Type IV, powder	Gibco, Fisher Scientific	17-104-019
C-Series Mouse Cytokine Antibody Array 3 Kit	RayBiotech	AAM-CYT-3-8
Cytoseal XYL	Epredia	83124
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Millipore Sigma	DN25-100MG	Dnase I
Dissecting microscissors	World Precision Instruments	WPI-14003
Dissecting scissors	World Precision Instruments	WPI-15922
Dissection microscope	Leica	MZ9.5, S9 series
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco, Fisher Scientific	14-190-250	pH 7.0–7.3
Eosin	Fisherbrand	23-314631
F4/80 antibody	Bio-Rad	MCA497G	1:50
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United States	Gibco, ThermoFisher Scientific	10082147
Fine-tipped dissecting forceps	World Precision Instruments	WPI-14098
FOXL2 antibody	Abcam	ab246511	1:200
Graefe Forceps	Fine Science Tools	1105010
Hematoxylin	EK Industries	EKI 47971GL
Hemocytometer	MedOne	DHCN015
Imaging System	ThermoFisher Scientific	EVOS FL Auto
IntestiCult Organoid Growth Medium (Mouse)	STEMCELL Technologies	06005	Basal medium, Supplements 1 and 2
Laminar flow hood	IVFtech	IVFtech sterile workstation
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco, Fisher Scientific	11415114
Microscope slides	Mercedes Scientific	MER 7255/90/WH/CC
MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids	Millipore Sigma	Z764043-6EA	Silicone casts for agarose micromolds
Modified Davidson's Fixative	Electron Microscopy Sciences	6413350
OVCAR8-RFP cells			Gift from Joanna Burdette PhD, University of Illinois Chicago
Penicillin-Streptomycin	Millipore Sigma	P4333-100ML
Picrosirius Red staining solution	StatLab	STPSRPT
RPMI 1640 Medium (ATCC modification)	Gibco, Fisher Scientific	A1049101
Tabletop centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5430 R
Trypan blue	ThermoFisher Scientific	T10282
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco, ThermoFisher Scientific	25300054
Vimentin antibody	Cell Signaling Technology	5741S	1:100
αMEM, GlutaMAX Supplement, no nucleosides	Gibco, Fisher Scientific	32561102