Progressi della ricerca sulle strategie di valutazione dell'efficienza della riparazione dei danni al DNA

Xiao Liu; Yiwei Zhu; Ling Li; Siyu Hang; Sipei Wu; Song-Bai Liu

doi:10.3791/71031

Articolo di revisione

Progressi della ricerca sulle strategie di valutazione dell'efficienza della riparazione dei danni al DNA

DOI:

10.3791/71031

⸱

23 giugno 2026

Xiao Liu^*¹^,² , Yiwei Zhu^*³ , Ling Li¹^,² , Siyu Hang¹ , Sipei Wu⁴ , Song-Bai Liu¹^,²

¹Jiangsu Province Engineering Research Center of Development and Translation of Key Technologies for Chronic Disease Prevention and Control, Suzhou Vocational Health College, ²School of Chemistry and Life Sciences, Suzhou University of Science and Technology, ³Department of Orthopedics, The First Affiliated Hospital of Soochow University, ⁴Department of Hematology, The First Affiliated Hospital of Soochow University

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Gli saghi sull'efficienza della riparazione del danno del DNA possono essere ampiamente suddivisi in tre gruppi: saghi funzionali basati su cellule, saghi biochimici in vitro e saggi con marcatori molecolari. Questi approcci consentono una valutazione qualitativa o quantitativa dell'efficienza della riparazione attraverso molteplici vie di riparazione del danno al DNA.

Abstract

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Il DNA genomico cellulare è continuamente esposto a fattori endogeni ed esogeni che inducono varie forme di danno al DNA. Nelle cellule dei mammiferi, il carico giornaliero di danni al DNA può raggiungere 10⁴–¹⁰ 5 lesioni per cellula. I danni al DNA che persistono nella fase S possono portare a mutazioni. Quando tali mutazioni si verificano in oncogeni, geni soppressori tumorali o geni coinvolti nella proliferazione cellulare, possono favorire la trasformazione cellulare e la carcinogenesi. Pertanto, la riparazione dei danni al DNA svolge un ruolo fondamentale nel mantenere la stabilità genomica e prevenire lo sviluppo del cancro. La valutazione della capacità di riparazione del DNA si ottiene al meglio misurando l'attività funzionale dei sistemi di riparazione del DNA. Le vie di riparazione dei danni del DNA e le loro efficienze di riparazione sono altamente rilevanti per lo sviluppo di farmaci chemioterapici, la validazione della funzione genica e la terapia oncologica. Di conseguenza, l'indagine sull'efficienza di riparazione delle singole vie di riparazione del danno al DNA ha un importante significato teorico e pratico. Questa revisione riassume i principali percorsi di riparazione del danno al DNA, i metodi utilizzati per valutare l'efficienza della riparazione e i vantaggi e i limiti di questi approcci.

Introduzione

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Il sistema di riparazione del danno al DNA è un meccanismo di difesa cellulare fondamentale che mantiene la stabilità genomica riducendo la frequenza delle mutazioni e sopprimendo la^{carcinogenesi 1}. Diversi tipi di danno al DNA vengono riparati attraverso vie di riparazione distinte ma^{interconnesse 2}. Ad esempio, le disallineazioni di base generate durante la replicazione del DNA vengono corrette tramite riparazione di disadattamento (MMR), mentre basi modificate chimicamente, come le basi alchilate, vengono principalmente riparate tramite riparazione da escissione di basi (BER^)3. I 6-4 fotoprodotti indotti dagli ultravioletti (UV) e gli ingombranti addotti nucleotidicici generati da alcuni agenti chimici vengono rimossi tramite la riparazione tramite escissione di nucleotidi (NER). Il danno al collegamento incrociato interstrand (ICL) viene riparato attraverso le attività coordinate delle proteine associate alla via 4 dell'anemia di Fanconi^. Le rotture a singolo filamento (SSB) vengono riparate tramite il percorso di riparazione della rottura a singolo filamento (SSBR), mentre le rotture a doppio filamento (DSB) vengono principalmente riparate tramite giunzione non omologa delle estremità (NHEJ) o ricombinazione omologa (HR). Nella maggior parte dei casi, le lesioni complesse del DNA si risolvono tramite interazioni coordinate tra più vie di riparazione^{del DNA 5}.

La valutazione del danno al DNA e dell'efficienza di riparazione nelle cellule si basa tipicamente su una combinazione di approcci sperimentali, tra cui il saggio Comet, immunofluorescenza (IF), Western blotting (WB), riattivazione delle cellule ospiti (HCR) e saggi di riparazione basati su plasmidi. Questi metodi valutano il danno e la riparazione del DNA rilevando rotture di fili di DNA, marcatori di danno al DNA e l'espressione o localizzazione di proteine associate alla^{riparazione 6}. Tuttavia, la quantificazione accurata dell'efficienza della riparazione cellulare richiede generalmente saghi dinamici basati su sfide. In questi approcci, vengono indotte sperimentalmente lesioni specifiche del DNA e le cellule vengono campionate in punti temporali sequenziali per monitorare la formazione e la rimozione dei segnali di danno. Il confronto dei livelli di danno residui nel tempo rispetto al carico iniziale del danno consente una valutazione quantitativa della cinetica di riparazione e della funzionalità del percorso.

Per confrontare sistematicamente le caratteristiche e le applicazioni degli saggi di efficienza di riparazione del danno al DNA attualmente disponibili, questa revisione riassume i principali metodi di rilevamento secondo cinque parametri: specificità lesione/substrato, risoluzione analitica, sensibilità, capacità quantitativa e requisiti di strumentazione (Tabella 1). Questa revisione mira a fornire una guida metodologica pratica per selezionare approcci appropriati per indagare le vie di riparazione del danno del DNA nella ricerca di base, traslazionale e clinica.

Metodo di rilevamento	Specificità di lesione/substrato	Risoluzione analitica	Soglia di sensibilità/rilevamento	Output quantitativo vs. qualitativo	Requisiti di strumentazione
Tachia occidentale	CPD, 6-4PP, proteine di riparazione (ad esempio, MGMT, RAD51)	Popolazione	Moderato	Semi-quantitativo	Elettroforesi proteica, trasferimento di membrana, sistema di imaging per chemiluminescenza
Immunofluorescenza	CPD, focus DSB (ad esempio, γ-H2AX, RAD51)	Cella singola	Moderato	Semi-quantitativo	Microscopio a fluorescenza
HPLC-MS/MS	CPD, 6-4PP, danni ossidativi e alchilati alle basi	Popolazione/In vitro	Estremamente alto	Quantitativo	HPLC-MS/MS
Saggio sull'attività enzimatica MGMT	Danni da alchilazione O⁶-meG	Popolazione/In vitro	Alto	Quantitativo	Lettore di microplacche
Analisi della cometa	SSB, DSB, basi ossidate (con pretrattamento FPG/OGG)	Cella singola	Alto	Quantitativo	Microscopio a fluorescenza/sistema di elettroforesi
Test per incisione	Siti AP, incisioni NER, incisioni BER	Popolazione/In vitro	Alto	Quantitativo	Imaging su gel, radiomarcatura/rilevamento della fluorescenza
Sistema di riparazione ricostituito	Danni base specifici per il sito, siti AP, rotture dello strand	In vitro	Alto	Quantitativo	Elettroforesi su gel, rilevamento fluorescenza/sclerosi multipla
Saggio di riparazione basato su plasmidi	Danni specifici per il sito	Popolazione	Moderato	Quantitativo	Lettore di microplacche, citometro a flusso, conteggio delle colonie
Saggio del giornalista	Danni specifici per il sito; BER, NER, HR, NHEJ, MMR	Popolazione	Alto	Quantitativo	Lettore di microplacche, citometro a flusso, microscopio a fluorescenza
HCR/FM-HCR	Danni UV, collegamenti incrociati in platino, danni site-specific	Popolazione	Alto	Quantitativo	Citometro a flusso, rivelatore di fluorescenza/chemiluminescenza
RADD	Danno al DNA ad ampio spettro	Cella singola	Estremamente alto	Quantitativo	Microscopio a fluorescenza a singola molecola
qPCR	Danni da raggi UV, lesioni che bloccano la catena	Popolazione	Moderato	Quantitativo	Strumento qPCR in tempo reale
Rilevamento MSI	Instabilità dei microsatelliti associata alla carenza MMR	Popolazione	Moderato	Qualitativo	Strumento PCR/elettroforesi capillare
DR-GFP/EJ5-GFP	Riparazione DSB mediata da HR e NHEJ	Popolazione	Alto	Quantitativo	Citometro a flusso/microscopio a fluorescenza
BLESS/FELICITÀ	Mappatura DSB a livello genomico	Cella singola	Estremamente alto	Quantitativo	Sequencer ad alta capacità
iPOND	Proteine DDR presso fork di replicazione/riparazione associata a TLS	Fork/proteoma di replicazione	Alto	Semi-quantitativo	Piattaforma di spettrometria/sequenziamento di massa

Tabella 1: Confronto sistematico dei metodi per rilevare l'efficienza di riparazione dei danni al DNA. Confronto dei metodi comunemente utilizzati per valutare l'efficienza della riparazione dei danni al DNA su più vie di riparazione. La tabella riassume la specificità delle lesioni o del substrato, la risoluzione analitica, la sensibilità, la capacità quantitativa e i requisiti di strumentazione per ciascun saggio, inclusi approcci biochimici, molecolari e basati su cellule.

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Revisione e prospettiva

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1. Riparazione diretta (DR)

La riparazione diretta (DR) è la forma più semplice di riparazione del DNA e si riferisce al ripristino diretto del DNA danneggiato senza rimuovere basi o^{nucleotidi 7}. La DR ripara principalmente due principali tipi di lesioni del DNA. Il primo è il danno da ciclobutano pirimidinico dimer (CPD) indotto dalla radiazione ultravioletta (UV). In molti organismi, la fotoliasi riconosce e lega i dimeri pirimididi. All'esposizione alla luce visibile, la fotoliasi si attiva, inverte direttamente il danno al DNA e poi si dissocia dalla molecola di DNA. Questo meccanismo di fotoriattivazione è particolarmente importante nelle piante e negli organismi inferiori. Tuttavia, i mammiferi placentati, compresi gli esseri umani, non hanno fotoliasi funzionale e quindi non possono effettuare la fotoriattivazione. Di conseguenza, i danni da CPD indotti dai raggi UV nelle cellule umane vengono riparati principalmente tramite la riparazione tramite escissione dei nucleotidi (NER⁾⁸.

Il secondo tipo principale di danno riparato tramite DR è il danno base indotto da alchilazione. La riparazione è mediata da O 6-alchilguanina-DNA alchiltransferasi (AGT), nota anche come O^{6-metilguanina-DNA} metiltransferasi (MGMT). Questo enzima trasferisce i gruppi alchili dalla posizione O⁶ dei residui di guanina a se stesso, ripristinando così direttamente la base del DNA danneggiata.

Metodi per rilevare l'efficienza della DR

Rilevamento dell'efficienza di riparazione per danni CPD indotti da radiazioni ultraviolette (UV)
1. Test Western blot (WB) per rilevare cambiamenti nel contenuto della CPD
  Utilizzando anticorpi specifici per le DPC, gli investigatori possono rilevare cambiamenti nell'abbondanza di DPC in diversi momenti dopo l'irradiazione UV e dedurre l'efficienza di riparazione dal livello di danno residuo. Una maggiore efficienza di riparazione corrisponde a una rimozione più rapida del CPD. La rilevazione della CPD basata su WB è un approccio classico ed efficace per valutare l'attività di riparazione del DNA; tuttavia, esistono diverse limitazioni. Innanzitutto, il saggio misura i livelli medi di danno tra le popolazioni cellulari e quindi manca di risoluzione a singola cellula. In secondo luogo, e più importante, il saggio non può distinguere tra le vie di riparazione. Poiché le CPD nelle cellule umane sono principalmente riparate tramite NER, l'analisi WB da sola non può distinguere se l'attività di riparazione osservata rifletta la riparazione mediata dalla fotoliasia o l'attività NER senza un ulteriore contesto sperimentale.
2. Posizionamento dell'immunofluorescenza (IF) Cambiamenti dinamici della concentrazione della DPC
  Le cellule sottoposte a irradiazione UV e trattamento di fotoriparazione possono essere colorate usando anticorpi specifici per la CPD, e i cambiamenti nei foci nucleari della CPD possono essere visualizzati tramite microscopia a fluorescenza. L'analisi quantitativa della formazione e eliminazione dei focus della DPC consente la valutazione della capacità di riparazione del DNA sia a livello di popolazione che di singola cellula. Il tasso di scomparsa dei focus CPD riflette direttamente l'efficienza delle riparazioni. IF fornisce una visualizzazione spaziale e temporale delle dinamiche di riparazione all'interno delle singole cellule e consente il rilevamento dell'eterogeneità cellula a cellula. Tuttavia, i segnali di fluorescenza sono suscettibili all'estinzione e l'analisi quantitativa spesso si basa sul conteggio manuale, che introduce la soggettività del genere. Nelle cellule di mammiferi privi di attività di fotoriattivazione, questo metodo riflette principalmente l'efficienza di riparazione mediata dalla NER.
3. Cromatografia liquida ad alte prestazioni - spettrometria di massa (HPLC-MS/MS) per analisi quantitativa CPD
  Il DNA estratto viene digerito enzimaticamente in nucleosidi, dopodiché i CPD vengono separati dai nucleosidi normali tramite cromatografia liquida ad alta performance (HPLC). L'analisi quantitativa viene successivamente eseguita utilizzando la spettrometria di massa tandem (MS/MS). L'efficienza della riparazione viene determinata confrontando l'abbondanza di CPD prima e dopo la^{riparazione 9}. L'HPLC-MS/MS offre una specificità estremamente elevata e sensibilità a livello picomolare; tuttavia, il metodo richiede strumenti costosi, preparazione complessa del campione e non riflette lo stato di riparazione in situ delle celle intatte. Nei campioni di cellule umane, l'esito di riparazione misurato riflette prevalentemente l'attività del NER.
Efficacia della riparazione del danno alla base del DNA indotta da agenti alchilanti
1. Saggio sull'attività enzimatica MGMT
  L'efficienza di riparazione del danno al DNA indotto dagli agenti alchilanti viene comunemente valutata misurando l'attività^{MGMT 10}. I substrati di DNA metilato marcati radioattivamente vengono utilizzati per monitorare il trasferimento dei gruppi metilici dal DNA danneggiato alla proteina MGMT, consentendo così una valutazione quantitativa dell'efficienza della riparazione.
2. Segnalazione di un saggio genico per rilevare l'efficienza di riparazione di O^6-meG
  Plasmidi reporter contenenti lesioni di O 6-metilguanina (O^6-meG) possono essere costruiti per valutare l'efficienza della riparazione. La lesione introdotta sopprime l'espressione genica del reporter fino a quando la riparazione mediata da MGMT ripristina l'attività del reporter. L'efficienza della riparazione viene successivamente quantificata misurando i livelli di espressione genica dei reporter. I saggi genici Reporter forniscono una valutazione intuitiva e quantitativa dell'attività di riparazione nelle cellule^{viventi 11}. Tuttavia, questi saghi richiedono la costruzione di vettori specifici per lesione e coinvolgono cicli sperimentali relativamente^{lunghi 12}.
Efficienza nella riparazione dei danni al rilevamento di rottura della catena
1. Saggio della cometa
  Il test della cometa, noto anche come elettroforesi in gel a cellula singola (SCGE), è un metodo sensibile per rilevare rotture di filamento di DNA a livello di singola cellula. I frammenti di DNA danneggiati migrano dal nucleo durante l'elettroforesi, formando code simili a quelle di una cometa, mentre il DNA intatto rimane concentrato nella regione nucleare. Parametri come la lunghezza della coda della cometa, il contenuto di DNA della coda e il momento della coda possono essere quantificati utilizzando microscopia a fluorescenza e software di analisi delle immagini. Queste metriche permettono una valutazione quantitativa della gravità della rottura del filamento di DNA. Confrontando i profili delle comete immediatamente dopo l'induzione del danno al DNA con quelli ottenuti dopo la riparazione, si può stimare l'efficienza di^{riparazione 13}.
  Il saggio Cometa offre diversi vantaggi, tra cui semplice funzionamento, costo relativamente basso, alta sensibilità e risoluzione a singola cella. Ulteriori perfezionamenti di questo metodo hanno portato allo sviluppo di varianti modificate con enzimi e di saghi di riparazione del DNA in vitro basati su comete, che possono essere utilizzati per valutare le attività BER e NER.

2. Riparazione da escissione della base (BER)

La riparazione da escissione di basi (BER) è una via di riparazione del DNA altamente conservata che rimuove principalmente piccole lesioni di base generate da ossidazione, alchilazione e^{deaminazione 14}. Il BER condivide una notevole sovrapposizione meccanicistica con la riparazione a rottura a singolo filamento (SSBR), e alcuni eventi SSBR sono considerati estensioni del BER. Secondo la lunghezza della patch di riparazione, il BER è classificato in BER (SP-BER) e BER (LP-BER) con patch lungo.

La BER è avviata da glicosilasi di DNA che riconoscono ed eliminano le basi danneggiate tagliando il legame N-glicosidico tra la base e il desossiribosio, generando così siti apurinici/apirimidinici^{(AP) 15}. L'endonucleasi AP 1 (APE1) successivamente spacca la spina dorsale del DNA sul lato 5′ del sito AP, producendo i terminali fosfato 3′-OH e 5′-desossiribosio (dRP). Durante SP-BER, il gruppo dRP viene rimosso, la DNA polimerasi β (Polβ) riempie il gap del singolo nucleotide e la DNA ligasi III (LigIII) completa la legazione.

La riparazione delle rotture a singolo filamento indotte dall'alchilazione contenenti terminali bloccati a 3′ segue un meccanismo simile ma richiede un ulteriore trattamento delle estremità. La polinucleotide chinasi 3′-fosfatasi (PNKP) rimuove innanzitutto terminali anomale 3′ per generare un gruppo 3′-OH corretto. Polβ successivamente riempie il nucleotide mancante e LigIII sigilla la tagliatura per completare la riparazione.

Metodi per rilevare l'efficienza BER

Analisi della cometa modificata con enzimi
Il saggio Comet modificato con enzimi estende il saggio standard incorporando enzimi riparativi specifici per lesione. Questi enzimi riconoscono e tagliano le basi danneggiate, convertendo lesioni altrimenti non rilevabili in rotture di filo rilevabili. L'intensità risultante della coda della cometa riflette il livello di danno al^{DNA 16}˒¹⁷.
Per valutare l'efficienza del BER, la formamidopirimidina glicosilasi del DNA (FPG) o il suo omologo mammifero 8-osoxanina glicosilasi del DNA (OGG1) viene utilizzata per convertire lesioni di base ossidate in rotture a singolo filamento, che vengono successivamente analizzate utilizzando il saggio^{Comet 18}.
Test per incisione
Il test per incisione è un approccio in vitro fondamentale per valutare l'attività del BER. I substrati di DNA contenenti siti AP vengono incubati con enzimi purificati o estratti cellulari, e la proporzione di substrati di DNA spezzati viene quantificata. Questo saggio riflette direttamente l'attività incisiva mediata da APE1 e fornisce alta specificità e sensibilità, minimizzando al contempo l'interferenza dall'ambiente^{intracellulare 19}.
Tuttavia, il saggio di incisione non riproduce completamente l'attività della BER nelle cellule vive perché non può valutare la regolazione dinamica dell'intero processo di riparazione, inclusi il riconoscimento delle lesioni, l'escissione delle basi, la clivagatura del sito AP, la sintesi del DNA e la legatura²⁰.
Sistema di riparazione ricostituito
Il sistema di riparazione ricostituito è una piattaforma sperimentale in vitro che ricostruisce le vie di riparazione del DNA utilizzando proteine purificate di riparazione. Questo sistema consente un'analisi dettagliata delle funzioni molecolari e delle interazioni delle singole proteine di riparazione ed è ampiamente utilizzato per studi meccanicistici e screening farmacologico.
Per valutare l'efficienza del BER, glicosilasi purificate, endonucleasi AP, DNA polimerasi e ligasi vengono incubate sequenzialmente con substrati di DNA danneggiati per ricostituire il riconoscimento delle lesioni, l'escissione, la sintesi e la legazione. I prodotti di riparazione vengono analizzati tramite elettroforesi su gel, marcatura a fluorescenza o spettrometria^{di massa 21}. Sebbene questo approccio consenta studi meccanicistici altamente controllati, non tiene conto della struttura della cromatina né della regolazione cellulare globale dell'attività di^{riparazione 22}.
Saggio di riparazione basato su plasmidi
I saghi di riparazione basati su plasmidi prevedono l'introduzione di plasmidi contenenti lesioni definite del DNA nelle cellule ospiti o l'incubazione con estratti cellulari contenenti enzimi di riparazione, seguita da una valutazione dell'efficienza della riparazione tramite saghi reporter, citometria di flusso o analisi della formazione^{delle colonie 23}.
Per valutare l'efficienza del BER, i plasmidi contenenti danni ossidanti al DNA vengono incubati con estratti cellulari e successivamente trasformati in ceppi batterici carenti di riparazione, come Escherichia coli. L'efficienza della riparazione viene poi stimata dai tassi di formazione delle colonie.
Test genico del reporter
I saghi sui geni reporter valutano indirettamente l'efficienza della riparazione del DNA o l'attività regolatoria dei geni misurando il ripristino dell'espressione genica^{reporter 24}. In questi saggi, lesioni del DNA o elementi regolatori vengono incorporati nelle strutture del segnalatore, e l'efficienza della riparazione viene quantificata attraverso cambiamenti nell'attività del segnalatore dopo la riparazione.
Per l'analisi BER, una lesione 8-oxoG può essere inserita nella regione codificante di un gene reporter della luciferasi. Se la lesione rimane non riparata, la traslazione viene interrotta; La riparazione di successo ripristina l'espressione proteica a piena lunghezza del reporter. I plasmidi non danneggiati, come i vettori luciferasi di Renilla pRL-TK, sono comunemente utilizzati come controlli interni.
Riattivazione delle cellule ospiti (HCR)
La riattivazione delle cellule ospiti (HCR) è un saggio classico che valuta indirettamente l'efficienza della riparazione del DNA misurando la capacità delle cellule ospiti di ripristinare l'espressione dai plasmidi reporter^{danneggiati 25}. I plasmidi che portano lesioni definite, come i dimeri pirimidinici indotti dai raggi UV o i reticuli indotti chimicamente, vengono trasfettati nelle cellule ospiti. L'efficienza della riparazione viene successivamente quantificata misurando l'espressione genica dei reporter.
I saggi HCR forniscono un'elevata sensibilità e permettono di valutare l'attività di riparazione verso tipi specifici di lesioni. Tuttavia, è necessaria una trasfezione efficiente e la preparazione di plasmidi danneggiati di alta qualità. Una delle principali limitazioni dell'HCR convenzionale è che il trattamento dei plasmidi con agenti danneggianti del DNA spesso genera popolazioni lesioniste eterogenee in tutto il plasmide, complicando così l'interpretazione^{meccanicistica 26}.
Per affrontare queste limitazioni, sono stati sviluppati saggi di riattivazione delle cellule ospiti basati su citometria di flusso (FM-HCR) utilizzando plasmidi a lesione singola specifici per il sito. FM-HCR consente un'analisi quantitativa rapida dell'attività di riparazione nelle cellule viventi, sebbene il test richieda strumenti specializzati e abbia limitazioni per l'analisi meccanicistica simultanea di più vie^{BER 27}.
Sono stati sviluppati anche saggi di riattivazione delle cellule ospiti della placca (PL-HCR) basati su substrati BER specifici per lesioni per indagare i meccanismi BER nelle cellule viventi (Figura 1)²⁸. In questo approccio, plasmidi contenenti una singola lesione di^1,N 6-etenoadenina (εA) vengono introdotti nelle cellule dei mammiferi. Dopo la riparazione, il DNA plasmidico viene recuperato, digerito con enzimi di restrizione, trasformato in E. coli e quantificato tramite analisi della formazione della placca. I plasmidi completamente riparati diventano lineari dopo la digestione di restrizione e non riescono a generare placche, mentre i plasmidi non riparati o incompletamente riparati rimangono circolari e formano placche. L'efficienza del BER è quindi determinata dalla quantificazione della placca.
Rilevamento assistito dei danni tramite riparazione
La rilevazione assistita da riparazione dei danni (RADD) è un metodo a singola molecola per rilevare e quantificare danni al DNA²⁹. In questo approccio, gli enzimi di riparazione specifici per lesione riconoscono ed eliminano le basi danneggiate, dopodiché le DNA polimerasi incorporano nucleotidi marcati fluorescenti nelle lacune risultanti. Le molecole di DNA vengono successivamente visualizzate tramite microscopia a fluorescenza, permettendo la rilevazione diretta e la quantificazione delle lesioni del DNA (Figura 2)³⁰.
RADD fornisce un'analisi qualitativa e quantitativa altamente sensibile del danno al DNA a livello di singola molecola. Tuttavia, il metodo misura principalmente il carico di danno al DNA piuttosto che valutare direttamente la cinetica di riparazione o l'efficienza complessiva della riparazione nelle popolazioni cellulari.

figure-protocol-1
Figura 1: Riattivazione della cellula ospite della placca (PL-HCR). Il DNA circolare monofilatore M13mp18 contenente una lesione definita viene trasfetato in cellule competenti. Dopo la trasfezione, le cellule vengono coltivate su piastre agar per permettere la formazione della placca. Il DNA replicativo di M13 viene successivamente isolato dalle placche, digerito con enzimi di restrizione e analizzato tramite elettroforesi su gel per distinguere i prodotti mutanti e quelli selvatici e determinare se la riparazione della lesione sia avvenuta. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Rilevamento assistito da riparazione dei danni (RADD). I vuoti a singolo filamento generati durante la riparazione del DNA sono riempiti con nucleotidi marcati con biotina. Avidina o streptavidina marcate fluorescenti vengono poi utilizzate per rilevare nucleotidi incorporati, consentendo una valutazione quantitativa dei livelli di danno al DNA tramite analisi di fluorescenza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Riparazione da escissione di nucleotidi (NER)

La riparazione da escissione di nucleotidi (NER) è una delle principali vie di riparazione del DNA responsabile della rimozione di ingombranti lesioni del DNA che distorcono la doppia elica³¹ del DNA. I substrati NER includono ciclobutano pirimidinico (CPD) indotti da UV, fotoprodotti pirimidina-pirimidone 6-4 (6-4PP), lesioni ossidative purine, ingombranti addotti chimici e collegamenti intrastrand indotti dal^{cisplatino 32}. I difetti nella NER sono associati a disturbi come la xeroderma pigmentosa, caratterizzata da una sensibilità estrema ai raggi UV e una maggiore suscettibilità al cancro.

NER è composto da due principali sottopercorsi: il genoma globale NER (GG-NER⁾³³ e il NER ACCOPPIATO ALLA TRASCRIZIONE (TC-NER⁾³⁴. GG-NER esamina l'intero genoma per rilevare lesioni che distorcono l'elica, sopprimendo così mutagenesi e carcinogenesi. Al contrario, il TC-NER rimuove selettivamente lesioni bloccanti la trascrizione dai geni trascritti attivamente ed è essenziale per mantenere l'integrità trascrizionale. I difetti nel TC-NER contribuiscono a disturbi come la sindrome di Cockayne e la sindrome sensibile ai raggi^{UV 35}.

Metodi per rilevare l'efficienza del NER

Test per incisione
Il saggio a incisione valuta l'efficienza del NER rilevando le incisioni nel filo introdotte nei siti di danno del DNA dalle proteine di riparazione. In questo saggio, i substrati di DNA danneggiati, come il DNA irradiato UV contenente CPD, vengono incubati con proteine di riparazione o estratti cellulari, e successivamente vengono rilevati prodotti di^{incisione 36}.
La radiomarcatura o la marcatura a fluorescenza possono essere utilizzate per migliorare la sensibilità e permettere un monitoraggio preciso dell'attività^{incisiva 37}. Il saggio misura direttamente l'attività delle proteine chiave del NER responsabili del riconoscimento e dell'escissione del danno. Tuttavia, un'implementazione di successo richiede la preparazione di substrati danneggiati di alta qualità ed estratti proteici attivi.
Saggio della cometa per la riparazione enzimatica
L'efficienza del NER può essere valutata anche utilizzando saghi Comet modificati con enzimi. In questo approccio, l'endonucleasi T4 V viene incubata con cellule danneggiate per convertire i dimeri pirimidinici in rotture a filamento singolo rilevabili, che vengono successivamente analizzate utilizzando il test della^{Cometa 38}.
PCR quantitativa a fluorescenza in tempo reale (qPCR)
La PCR quantitativa in tempo reale (qPCR) valuta indirettamente l'efficienza della riparazione del DNA misurando gli effetti inibitori delle lesioni del DNA sull'amplificazione^{PCR 39}. Durante l'analisi NER, l'irradiazione UV viene utilizzata per la prima volta per indurre i dimeridi pirimididi. Queste lesioni ostacolano la progressione della DNA polimerasi e riducono l'efficienza dell'amplificazione, con conseguente aumento dei valori della soglia ciclica (Ct). Dopo la riparazione da parte della via NER, l'integrità del DNA viene ripristinata e l'efficienza dell'amplificazione migliora, portando a valori di Ct più bassi. L'efficienza della riparazione può quindi essere quantificata confrontando l'amplificazione prima e dopo la riparazione rispetto a una regione di controllo^{interna 40} non danneggiata.
Inoltre, la qPCR può essere utilizzata per valutare i livelli di espressione dei geni coinvolti nella segnalazione e nelle vie di riparazione del danno al DNA, inclusi ATM, ATR, BRCA1, CDKN1A ed XPC, riflettendo così indirettamente la capacità di riparazione^{del DNA 41}.
Riattivazione della cellula ospite basata su citometria di flusso (FM-HCR)
I saggi FM-HCR utilizzano plasmidi locali contenenti lesioni trasfettati nelle cellule ospiti e quantificano l'efficienza di riparazione tramite analisi citometrica a flusso dell'intensità di fluorescenza e della proporzione di cellule fluorescenti (Figura 3)⁴²˒⁴³. L'aumento dell'intensità della fluorescenza generalmente riflette una maggiore capacità di riparazione del DNA⁴⁴˒⁴⁵.
Sequenziamento della riparazione da escissione (XR-seq)
Il sequenziamento per riparazione dell'escissione (XR-seq) è una tecnica a livello genomico per mappare l'attività del NER a risoluzione a singolo nucleotide. Questo metodo arricchisce e sequenzia selettivamente gli oligonucleotidi contenenti danni eliminati durante il NER, generando così mappe ad alta risoluzione dell'attività di riparazione in tutto il genoma. XR-seq consente un'analisi quantitativa dell'efficienza di riparazione e dei modelli di distribuzione associati sia ai percorsi GG-NER che TC-NER e rappresenta un importante progresso tecnologico nella ricerca NER.
Poiché la NER è composta da due sottovie meccanicisticamente distinte e coinvolge numerose proteine di riparazione, sono necessari molteplici metodi complementari per una valutazione completa dell'attività di^{riparazione 46}˒⁴⁷. Oltre ai metodi sopra descritti, l'efficienza del NER può essere valutata anche utilizzando Western blotting, saghi di immunofluorescenza, saggi di riparazione basati su plasmidi e saggi sul gene reporter.

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Figura 3: Principio di rilevamento della riattivazione delle cellule ospiti basata su citometria di flusso (FM-HCR). I plasmidi contenenti quattro distinti tipi di danno al DNA vengono co-trasfettati in cellule di mammiferi coltivate. La capacità di riparazione del DNA (DRC) viene successivamente quantificata tramite citometria di flusso basata sull'intensità di fluorescenza del reporter. DRC, capacità di riparazione del DNA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Riparazione di disadattamento (MMR)

La riparazione delle discorrispondenze (MMR) è una via postreplicativa di correzione degli errori responsabile della riparazione delle discorrispondenze di base, come le discoppie G-T e A-C, così come piccoli cicli di inserimento-delezione generati durante la replicazione^{del DNA 48}. L'MMR viene attivato quando MutS riconosce basi disadattate, dopodiché MutL recluta fattori di riparazione a valle ed esonucleasi per attivare il processo^{di riparazione 49}. Un passaggio cruciale nell'MMR è la discriminazione tra il DNA genitore e quello appena^{sintetizzato 50}.

Nei procarioti, la discriminazione dei filamenti avviene tramite la metilazione del DNA, che segna il filamento parentale. Negli eucarioti, l'identità del filamento è determinata tramite incisioni transitorie nel DNA appena sintetizzato e interazioni con l'antigene nucleare cellulare proliferante (PCNA). La MMR migliora sostanzialmente la fedeltà della replicazione e svolge un ruolo essenziale nel mantenimento della stabilità^{genomica 51}. I difetti nella MMR sono fortemente associati a molteplici tumori, inclusa la sindrome di Lynch.

Metodi per valutare l'efficienza dell'MMR

Test di instabilità dei microsatelliti
Un MMR difettoso comporta il mancato corretto degli errori di scivolamento della replicazione nei loci dei microsatelliti, portando a instabilità microsatellitare (MSI). Il test MSI prevede l'amplificazione PCR di marcatori rappresentativi di microsatelliti seguita da un'analisi dei frammenti basata su elettroforesi capillare. L'instabilità su più loci indica una diminuzione dell'attività MMR, mentre i profili stabili dei microsatelliti indicano una funzione MMR intatta. Il test MSI fornisce alta sensibilità e specificità per identificare la carenza MMR; tuttavia, rimane una misura indiretta della funzione MMR e non valuta quantitativamente l'efficienza della riparazione.
Plasmidi reporter contenenti discorrispondenze definite o anelli di inserimento-delezione possono essere utilizzati per valutare l'efficienza MMR tramite saghi genici reporter. Inoltre, i saggi di Western blotting e immunofluorescenza che mirano alle proteine associate alla MMR possono fornire una valutazione indiretta dell'attività delle vie di sicurezza.

5. Riparazione a doppia rottura (DSB)

Le rotture a doppio filamento (DSB) sono tra le forme più citotossiche di danno al DNA. Il mancato riparare accuratamente i DSB può portare a mutazioni, delezioni cromosomiche, traslocazioni, instabilità genomica e tumorigenesi. La riparazione del DSB avviene principalmente tramite ricombinazione omologa (HR) e unzione non omologa (NHEJ), che operano preferenzialmente durante le diverse fasi del ciclo^{cellulare 52}.

Metodi per valutare l'efficienza della riparazione DSB

Saggio dei fochi gamma-H2AX
Il saggio dei focus γ-H2AX è uno dei metodi più utilizzati per rilevare indirettamente i DSB. Dopo la formazione del DSB, l'istone H2AX viene rapidamente fosforilata a Ser139 per generare focolai γ-H2AX. Il numero di fochi γ-H2AX è correlato con l'entità della formazione di DSB, e l'efficienza della riparazione può essere dedotta monitorando la velocità di scomparsa dei fochi nel tempo tramite microscopia a immunofluorescenza.
Questo saggio offre diversi vantaggi, tra cui alta sensibilità, risoluzione a singola cellula e protocolli sperimentali consolidati, rendendolo un metodo centrale nella ricerca sulla risposta al danno al DNA (DDR).
BEDIZIONE FELICITÀ
BLESS (Breaks Labeling, Enrichment on Streptavidin and Sequencing) e BLISS (Breaks Labeling In Situ and Sequencing) sono metodi di mappatura DSB a livello genomico basati su marcatura in situ e sequenziamento ad alta produttività. Entrambi gli approcci identificano i siti DSB tramite la legazione diretta di adattatori di sequenziamento alle estremità del DNA rotto, consentendo una localizzazione e quantificazione precisa a livello genomico dei DSB. Questi metodi possono anche essere utilizzati per valutare la cinetica complessiva di riparazione del DSB.
Inoltre, i saghi genetici reporter specifici per DSB possono valutare quantitativamente l'efficienza della riparazione DSB e distinguere la riparazione mediata dalla frequenza cardiaca da quella mediata da quella mediata da NHEJ (Figura 4). Tuttavia, sebbene i sami γ-H2AX, BLESS e BLISS midino efficacemente il carico globale del DSB e la cinetica della riparazione, non possono determinare se la riparazione sia avvenuta specificamente attraverso i percorsi HR o NHEJ.

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Figura 4: Test genetico del reporter per la riparazione della rottura a doppio filamento (DSB). I plasmidi dei reporter DSB vengono introdotti nelle cellule target. Dopo un periodo di riparazione adeguato dopo la trasfezione, la fluorescenza del gene reporter viene monitorata tramite microscopia a fluorescenza per valutare l'efficienza della riparazione del DSB. DSB, rottura a doppio filo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

6. Riparazione da ricombinazione omologa (HR)

La ricombinazione omologa (HR) è una via di riparazione del DNA ad alta fedeltà che funziona principalmente durante le fasi S e G2 del ciclo cellulare, quando una cromatide sorella non danneggiata è disponibile come modello di^{riparazione 53}. Dopo la formazione del DSB, il complesso MRE11-RAD50-NBS1 (MRN) riconosce le estremità del DNA e avvia la resezione delle estremità del DNA in collaborazione con CtIP⁵⁴. Questo processo genera sporgenze di DNA singolo filamento (ssDNA) a 3′.

Il DNA ssDNA risultante è inizialmente rivestito dalla proteina di replicazione A (RPA), che protegge il DNA dalla degradazione della nucleasi e impedisce la formazione di strutture^{secondarie 55}. Successivamente, BRCA2 media la sostituzione della RPA con la ricombinasi RAD51, portando alla formazione di un filamento nucleoproteico^{RAD51 56}. Questo filamento cerca sequenze di DNA omologhe sulla cromatide gemella e promuove l'invasione del filamento nel modello omologo duplex del DNA, generando una struttura a loop di spostamento (D-loop)⁵⁷˒⁵⁸. La sintesi del DNA e lo scambio di filamenti procedono poi al completamento della riparazione.

L'efficienza della frequenza cardiaca può essere valutata quantitativamente utilizzando i sistemi di reporter DR-GFP negli saggi sui geni reporter. In alternativa, può essere effettuata una valutazione indiretta utilizzando saggi di Western blotting o immunofluorescenza che mirano alle proteine associate alla frequenza cardiaca.

7. Unzione finale non omologa del DNA (NHEJ)

L'unzione non omologa delle estremità (NHEJ) ripara i DSB senza richiedere un'estesa omologia di sequenza tra le estremità⁵⁹ del DNA. Invece, le estremità rotte del DNA vengono direttamente processate e legate, rendendo NHEJ una via di riparazione intrinsecamente soggetta a errori. Poiché le estremità del DNA possono subire degradazione prima della ligatura e le estremità di DSB non correlate possono essere unite, NHEJ può portare a mutazioni, delezioni e riarrangiamenti^{cromosomici 60}.

Sono riconosciute tre principali forme di riparazione non omologa: NHEJ classica, ricottura a singolo filamento (SSA) e giunzione terminale mediata da microomologia (MMEJ).

NHEJ classico
La NHEJ classica opera durante tutto il ciclo cellulare. L'eterodimero Ku70/Ku80 riconosce e lega prima le estremità DSB⁶¹. Questo complesso recluta la subunità catalitica proteinica chinasi dipendente dal DNA (DNA-PKcs), portando all'attivazione della segnalazione delle chinasi e all'inizio della NHEJ. Gli enzimi di elaborazione finale, inclusi nucleasi e fosfatasi, processano successivamente i terminali del DNA danneggiati prima che il complesso XRCC4-DNA ligasi IV medi la ligatura del DNA^{alle estremità 62}. Poiché il processamento terminale spesso porta a perdita di nucleotidi o a ricongiunzioni imprecise, NHEJ è considerato una via di riparazione^{mutagenica 63}˒⁶⁴.
Ricottura a singolo filo (SSA)
Il ricottura a singolo filamento (SSA) ripara i DSB che avvengono tra sequenze omologhe ripetute. Dopo la formazione del DSB, le nucleasi resezionano le estremità del DNA 5′, generando sporgenze estese di ssDNA a 3′. RAD52 media il ricottura tra ripetizioni omologhe complementari⁶⁵. Successivamente, il complesso endonucleasi XPF-ERCC1 rimuove i lembo di DNA non accoppiati, e il complesso SLX1-SLX4 può partecipare anche al processamento terminale. La DNA ligasi quindi sigilla le restanti lacune. Poiché le sequenze situate tra ripetizioni omologhe vengono eliminate durante la riparazione, la SSA è considerata un meccanismo di riparazione rapido ma intrinsecamente^{mutagenico 66}.
Unzione estrema mediata da microomologia (MMEJ)
Il collegamento terminale mediato dalla microomologia (MMEJ), noto anche come NHEJ alternativo (Alt-NHEJ), è un altro percorso di riparazione DSB soggetto a^{errori 67}. Nel MMEJ, sequenze microomologhe brevi situate vicino alle estremità di rottura del DNA vengono utilizzate per allineare i terminali rotti del DNA prima della riparazione. Dopo il riconoscimento di queste regioni microomologhe, le estremità del DNA vengono unite tramite un processo simile alla^{ricombinazione 68}. Poiché la MMEJ si basa su sequenze omologhe molto brevi, le delezioni e i riarrangiamenti genomici si verificano comunemente durante la riparazione.
L'efficienza NHEJ può essere valutata quantitativamente utilizzando sistemi reporter EJ5-GFP nei saggi sui geni reporter. In alternativa, l'attività di riparazione può essere valutata indirettamente tramite Western blotting e analisi di immunofluorescenza delle proteine associate al NHEJ.

8. Riparazione interstrand crosslink (ICL)

I reticuli interstrand (ICL) sono lesioni del DNA altamente tossiche che collegano covalentemente i due filamenti della doppia elica del DNA, bloccando così la replicazione e la trascrizione del DNA. La riparazione dell'ICL è meccanicisticamente complessa e coinvolge principalmente il percorso dell'anemia di Fanconi (FA) e il percorso^{NEIL3 69}.

Nel percorso FA, FANCM riconosce le lesioni ICL e promuove la monoubiquitinazione del complesso FANCI-FANCD2, attivando così le proteine di riparazione a^{valle 70}. Le nucleasi specifiche della struttura incidono successivamente il DNA vicino al collegamento incrociato per separare i due filamenti di DNA, e i DSB risultanti vengono riparati tramite vie HR o NHEJ.

Nel percorso NEIL3, la glicosilasi del DNA NEIL3 divide i legami glicosidici associati alla lesione ICL, generando siti AP che vengono successivamente^{bypassati dalle} polimerasi 71 della sintesi di translesione (TLS). Poiché le ICL impediscono la separazione dei filamenti necessaria per la replicazione e la trascrizione, queste lesioni sono altamente citotossiche e contribuiscono all'invecchiamento, alla neurodegenerazione e al cancro⁷²˒⁷³.

L'efficienza della riparazione ICL può essere valutata utilizzando saggi di riparazione basati su plasmidi, saghi sul gene del reporter, saggi di riattivazione delle cellule ospiti e sistemi di riparazione ricostituiti in vitro .

9. Sintesi della translesione (TLS)

La sintesi della translesione (TLS) è un meccanismo di tolleranza al danno al DNA che consente la replicazione di continuare attraverso lesioni del DNA^{non riparate 74}. La TLS coinvolge principalmente DNA polimerasi specializzate, tra cui le polimerasi κ, η, ι e ζ. Quando la replicazione del DNA si blocca nei siti danneggiati, le polimerasi TLS bypassano la lesione e permettono alla replicazione di procedere, mantenendo così la stabilità del^{genoma 75}.

A differenza di BER, NER, MMR, HR e NHEJ, che rimuovono o riparano direttamente le lesioni del DNA, TLS non elimina i danni al DNA. Invece, bypassa lesioni non riparate durante la replicazione del DNA ed è quindi classificato come un meccanismo di tolleranza al danno piuttosto che come una via canonica di riparazione^{del DNA 76}.

TLS può essere suddiviso in percorsi di bypass senza errori e soggetti a errori. Il TLS senza errori inserisce il nucleotide corretto opposto alla lesione, mentre il TLS soggetto a errori introduce frequentemente nucleotidi errati e contribuisce alla mutagenesi. La TLS soggetta a errori è considerata un meccanismo principale attraverso cui i cancerogeni ambientali inducono mutazioni genomiche. Di conseguenza, la modulazione delle vie TLS soggette a errori potrebbe rappresentare una strategia potenziale per la prevenzione e la terapia^{del cancro 77}.

Metodi per valutare l'efficienza di TLS

Isolamento delle proteine su DNA nascente (iPOND)
L'isolamento delle proteine su DNA nascente (iPOND) è una tecnica utilizzata per analizzare proteine associate al DNA appena sintetizzato presso forchette di replicazione bloccate. Poiché l'attività TLS avviene frequentemente in fork bloccati, iPOND consente un'analisi dinamica del reclutamento e dell'assemblaggio di polimerasi TLS e proteine di risposta al danno del DNA (DDR) durante lo stress di replicazione. Questo metodo può quindi essere utilizzato per valutare l'attività TLS e i processi di riparazione accoppiata alla replicazione.
L'efficienza del TLS può anche essere valutata utilizzando plasmidi reporter contenenti lesioni DNA specifiche TLS negli ssays genici reporter. Inoltre, i saggi di Western blotting e immunofluorescenza che mirano alle proteine associate a TLS possono fornire una valutazione indiretta dell'attività delle vie di sicurezza.

10. Considerazioni sul controllo qualità e sulla riproducibilità nella progettazione sperimentale

Replicazione biologica e replicazione tecnica
Una chiara distinzione tra replicate biologiche e repliche tecniche è essenziale per garantire affidabilità e riproducibilità negli studi di riparazione del DNA. In generale, dovrebbero essere inclusi almeno tre repliche biologiche indipendenti per ogni esperimento, mentre il numero di repliche tecniche dovrebbe essere determinato in base alla variabilità della piattaforma di rilevamento.
Per saggi a singola cellula, come il test della cometa e l'analisi dei focus basati su immunofluorescenza, dovrebbero essere analizzati almeno 50–100 cellule per ogni replica biologica per minimizzare il bias di campionamento. Nei saggi di segnalazione basati su citometria di flusso, inclusi i saghi DR-GFP e FM-HCR, dovrebbero essere raccolti almeno 10.000 eventi di cellule vive per campione per garantire la robustezza statistica.
Strategia di standardizzazione
Un confronto quantitativo accurato dell'efficienza della riparazione tra diversi campioni o lotti sperimentali richiede procedure di normalizzazione rigorose per minimizzare la variazione sistematica derivante dalle differenze nell'efficienza della trasfezione, nella vitalità delle cellule, nel carico del campione e nelle prestazioni dello strumento. Le strategie di normalizzazione più comuni includono le seguenti:
1. Co-trasfezione dei plasmidi di normalizzazione
  Negli saggi HCR, nei saggi di riparazione basati su reporter e nei saggi di riparazione basati su plasmidi, si raccomanda la co-trasfezione con un plasmide di normalizzazione non influenzato da danni al DNA. I controlli comunemente utilizzati includono plasmidi di luciferasi di Renilla o vettori GFP espressi costitutivamente. L'efficienza di riparazione viene normalizzata calcolando il rapporto tra il segnale sperimentale del reporter e quello del controllo.
2. Normalizzazione tramite proteine di mantenimento o colorazione totale delle proteine
  Nelle analisi Western blot che valutano l'espressione proteica di riparazione o i livelli residui di CPD, la normalizzazione dovrebbe essere effettuata utilizzando proteine di mantenimento, come GAPDH, β-actina o istone H3, oppure tramite metodi di colorazione proteica totale, inclusa la colorazione Ponceau S o REVERT.
3. Comandi non danneggiati
  Nei saggi di riparazione basati su qPCR, le regioni genomiche non danneggiate dovrebbero essere co-amplificate come controlli interni e i livelli di danno relativo dovrebbero essere calcolati utilizzando il metodo ΔCt. Analogamente, i saggi HCR dovrebbero includere controlli plasmidiali non danneggiati che rappresentano l'espressione massima del reporter, consentendo di esprimere l'efficienza di riparazione rispetto ai plasmidi di riferimento non danneggiati.
4. Normalizzazione dei numeri di celle
  Negli saggi basati su citometria di flusso, inclusi i saggi FM-HCR e DR-GFP, dovrebbero essere analizzati un numero uguale di cellule vitali tra i campioni. L'efficienza della riparazione dovrebbe quindi essere riportata come percentuale di cellule positive o variazioni relative nell'intensità di fluorescenza.
Misurazione dell'efficienza di riparazione della dimensione cinetica
La riparazione del DNA è un processo dinamico, e le misurazioni ottenute da un singolo punto temporale possono non distinguere tra riparazione ritardata e carenza completa del percorso. Pertanto, i disegni sperimentali basati sul corso temporale sono fortemente raccomandati.
Dopo l'induzione del danno al DNA, i campioni devono essere raccolti in più momenti temporali sequenziali, come 0, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12 e 24 ore, per monitorare l'accumulo e la rimozione di marcatori di danno o prodotti di riparazione. La cinetica della scomparsa del segnale fornisce informazioni importanti riguardo al tasso di riparazione, all'integrità del percorso e all'efficienza complessiva della riparazione.
Correzione della prova di ipotesi multiple:
Gli approcci ad alta produttività e multiplexati spesso coinvolgono l'analisi simultanea di più vie di riparazione o condizioni sperimentali, aumentando così il rischio di risultati falsi positivi dovuti a confronti statistici multipli. Esempi includono la valutazione simultanea delle attività BER, NER, HR e NHEJ utilizzando i saghi FM-HCR; analisi DSB a livello genomico utilizzando BLESS o BLISS; e analisi basata su array qPCR dell'espressione genica della riparazione del DNA.
Di conseguenza, i metodi di correzione statistica per il test di ipotesi multipla dovrebbero essere predefiniti durante la progettazione sperimentale. I metodi di correzione selezionati e le soglie di significatività aggiustate dovrebbero essere chiaramente riportati nelle sezioni Materiali e Metodi e nelle sezioni di analisi statistica.

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Conclusioni

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Una rilevazione accurata e un'analisi quantitativa dei processi di riparazione dei danni al DNA sono essenziali per comprendere i meccanismi molecolari alla base della riparazione del DNA, valutare gli effetti biologici delle esposizioni ambientali e valutare le risposte^{terapeutiche 78}. Pertanto, un'indagine approfondita sulle vie di riparazione dei danni al DNA e sull'efficienza della riparazione ha un'importanza significativa sia nella ricerca di base che nelle ...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano che non sono stati interessati finanziari o relazioni personali in conflitto che possano aver influenzato il lavoro riportato in questo studio.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato dal Centro di Ricerca Ingegneristica della Provincia del Jiangsu per lo Sviluppo e la Traduzione delle Tecnologie Chiave per la Prevenzione e il Controllo delle Malattie Croniche; il Team di Ricerca Innovativa per la Scienza e la Tecnologia dell'Istituto di Istruzione Superiore del Jiangsu (2021); il Programma del Centro di Ricerca in Tecnologia dell'Ingegneria del College, Professionale del Jiangsu (2023); la Natural Science Key Foundation delle Istituzioni di Istruzione Superiore del Jiangsu in Cina (Grant n. 24KJA310008); il Programma Chiave del Suzhou Vocational Health College (Grant No. szwzy202406); e il Laboratorio Chiave Statale di Medicina e Protezione delle Radiazioni, Università di Soochow (Grant n. GZK1202506).

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