Un protocollo di montaggio su nastro per l'imaging Z-stack ad alta risoluzione degli occhi composti di Drosophila

Summary

L'obiettivo principale di questo protocollo è consentire l'imaging non distruttivo e l'analisi quantitativa degli occhi composti di Drosophila. Combina una strategia di montaggio su nastro con acquisizione stereomicroscopica Z-stack e ricostruzione a profondità di messa a fuoco estesa per produrre immagini ad alta risoluzione e prive di artefatti.

Abstract

Qui presentiamo un protocollo di montaggio e imaging non distruttivo per l'analisi fenotipica ad alta risoluzione dell'occhio composto di Drosophila. La fenotipizzazione accurata dell'occhio composto di Drosophila è spesso limitata dalla sua geometria convessa e dalla fragilità meccanica durante la manipolazione. Per affrontare questo problema, descriviamo un flusso di lavoro di imaging versatile e non invasivo che consente una visualizzazione ad alta risoluzione da più prospettive. Il protocollo utilizza una strategia di montaggio adesivo personalizzata su una piattaforma a nastro invertito, che fissa le mosche dal corpo e dalle ali lasciando la testa completamente intatta. In modo cruciale, questa configurazione flessibile supporta orientamenti di montaggio distinti: una posizione laterale per catturare la piena convessità dei singoli occhi e una posizione frontale per valutare la simmetria dell'intera testa. Questo metodo facilita anche l'organizzazione di array ad alta densità, permettendo l'elaborazione rapida di 20–30 campioni per sessione. Integrando la stereomicroscopia a luce riflessa con l'acquisizione dello stack Z e la ricostruzione a profondità estesa di messa a fuoco (EDF), il flusso di lavoro genera immagini composite quasi 3D uniformemente nitide. Questo approccio preserva la pigmentazione naturale e produce immagini ad alta fedeltà e ricche di contrasto, adatte all'analisi fenotipica quantitativa su scala d'organo.

Introduction

L'occhio composto di Drosophila melanogaster è un modello classico e potente per studiare la crescita, la modellazione e la robustezza degli organi durante lo sviluppo. Composto da circa 800 ommatidi altamente ordinati, l'occhio della mosca fornisce una lettura sensibile e quantificabile delle perturbazioni genetiche che influenzano proliferazione, differenziazione e organizzazione dei ^{tessuti 1,2,3}. La manipolazione genetica dello sviluppo oculare ha storicamente fornito intuizioni fondamentali sulle vie di segnalazione conservate. ....

Protocol

1. Raccolta e sincronizzazione dei campioni

NOTA: Per garantire la comparabilità sperimentale, è necessario un rigoroso controllo della tempistica dell'eclosion. In condizioni di coltura standard a 25 °C, l'eclosione avviene tipicamente 10-12 giorni dopo la deposizione. Le pupe devono essere monitorate attentamente durante questa sera, poiché l'oscurimento della capsula pupale indica un'imminente eclosione.

1. Metodo del tap diretto (metodo standard)
   1. Tocca delicatamente la fiala standard di plastica 24 x 95 mm di Drosophila (sigillata con un tappo di schiuma) con....

Results

L'intera pipeline sperimentale, dalla raccolta dei campioni all'acquisizione delle immagini, è riassunta nella Figura 1. L'efficienza del protocollo modificato è dimostrata attraverso la creazione di array di campioni ad alta densità. Come mostrato nella Figura 2A, 20–30 mosche anestetizzate possono essere disposte in un motivo a griglia su una singola piattaforma a nastro invertito. I marcatori di orientamento scritti sulle est.......

Discussion

L'occhio composto di Drosophila funge da potente lettura fenotipica per lo screening genetico, dove cambiamenti osservabili nella dimensione dell'occhio, nella rugosità o nella^{pigmentazione 2,3,8} spesso indicano perturbazioni nelle vie fondamentali di segnalazione come Hippo ^5,6 o^{Hedgehog 7}. Tuttavia, l'e.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bombola di gas di anidride carbonica (CO2)	Fornitore locale	N/A
CO2 aspiratore anestesia	T& L	DG-08
Fotocamera digitale per microscopio	Leica	DMC6200
Pinzette pregiate	VETUS	MOS-167B
Tappi in schiuma	Dongpeng	N/A
Software per acquisizione immagini (LAS X)	Leica	3.7.1
Software di elaborazione immagini (FIJI/ImageJ)	NIH	Open source
Illuminatore a cupola LED	Leica	LED5000 HDI
Illuminatore LED Gooseneck	cossim	LG-10
Stereomicroscopio motorizzato	Leica	M205 FCA
Obiettivo	Leica	PlanApo NA0.2 1.0x
Valvola pneumatica a pedale	DELIXI	FV-320
Fiale standard per colture di Drosophila	LAIBOER	2424951
Mezzo alimentare standard per Drosophila	N/A	Farina di mais-agar-melassa
Vetri standard per microscopio in vetro	Citotest	10127101P-G
Stereomicroscopio standard	Nikon	SMZ745
Nastro adesivo bianco di carta	UBWIN	Larghezza 25mm