Un protocollo di montaggio su nastro per l'imaging Z-stack ad alta risoluzione degli occhi composti di Drosophila

Summary

L'obiettivo principale di questo protocollo è consentire l'imaging non distruttivo e l'analisi quantitativa degli occhi composti di Drosophila. Combina una strategia di montaggio su nastro con acquisizione stereomicroscopica Z-stack e ricostruzione a profondità di messa a fuoco estesa per produrre immagini ad alta risoluzione e prive di artefatti.

Abstract

Qui presentiamo un protocollo di montaggio e imaging non distruttivo per l'analisi fenotipica ad alta risoluzione dell'occhio composto di Drosophila. La fenotipizzazione accurata dell'occhio composto di Drosophila è spesso limitata dalla sua geometria convessa e dalla fragilità meccanica durante la manipolazione. Per affrontare questo problema, descriviamo un flusso di lavoro di imaging versatile e non invasivo che consente una visualizzazione ad alta risoluzione da più prospettive. Il protocollo utilizza una strategia di montaggio adesivo personalizzata su una piattaforma a nastro invertito, che fissa le mosche dal corpo e dalle ali lasciando la testa completamente intatta. In modo cruciale, questa configurazione flessibile supporta orientamenti di montaggio distinti: una posizione laterale per catturare la piena convessità dei singoli occhi e una posizione frontale per valutare la simmetria dell'intera testa. Questo metodo facilita anche l'organizzazione di array ad alta densità, permettendo l'elaborazione rapida di 20–30 campioni per sessione. Integrando la stereomicroscopia a luce riflessa con l'acquisizione dello stack Z e la ricostruzione a profondità estesa di messa a fuoco (EDF), il flusso di lavoro genera immagini composite quasi 3D uniformemente nitide. Questo approccio preserva la pigmentazione naturale e produce immagini ad alta fedeltà e ricche di contrasto, adatte all'analisi fenotipica quantitativa su scala d'organo.

Introduction

L'occhio composto di Drosophila melanogaster è un modello classico e potente per studiare la crescita, la modellazione e la robustezza degli organi durante lo sviluppo. Composto da circa 800 ommatidi altamente ordinati, l'occhio della mosca fornisce una lettura sensibile e quantificabile delle perturbazioni genetiche che influenzano proliferazione, differenziazione e organizzazione dei ^{tessuti 1,2,3}. La manipolazione genetica dello sviluppo oculare ha storicamente fornito intuizioni fondamentali sulle vie di segnalazione conservate. Studi fondamentali hanno dimostrato che l'espressione ectopica del fattore di trascrizione senza occhi è sufficiente a indurre la formazione oculare nei tessuti non retinici, stabilendo l'occhio come paradigma per la specificazione e plasticità degli^{organi 4}. Lavori successivi hanno identificato la via di segnalazione D. melanogaster Hippo come regolatore centrale della dimensione e del numero cellulare dell'occhio attraverso il controllo coordinato della proliferazione e dell'apoptosi ^5,6. Parallelamente, la segnalazione di Hedgehog e BMP è stata dimostrata di regolare la progressione morfogenetica, la precisione della crescita e la patterning spaziale all'interno della retina in^{via di} sviluppo ^7,8.

Tuttavia, catturare immagini ad alta fedeltà dell'occhio composto adulto presenta sfide ottiche significative a causa della sua geometria convessa ed emisferica. La microscopia standard a campo chiaro è limitata da una profondità di campo ridotta, rendendo impossibile mettere a fuoco simultaneamente il punto più dorsale (polo) e i bordi marginali (equatore) dell'occhio in un'unica esposizione⁹. Questa limitazione spesso porta a immagini in cui porzioni significative della superficie retinica sono sfocate, ostacolando l'applicazione di analisi immagini ad alta risoluzione e strumenti di apprendimento automatico progettati per quantificare fenotipi variegati. Per caratterizzare completamente la superficie retinica, è necessario visualizzare l'intera curvatura senza artefatti ottici. Pertanto, è necessario un metodo di imaging che preservi la morfologia oculare nativa consentendo al contempo una visualizzazione ad alta risoluzione dell'intera superficie retinica curva.

Inoltre, i metodi tradizionali di preparazione del campione per la microscopia spesso compromettono l'integrità strutturale della testa della mosca. Le tecniche di montaggio convenzionali si basano spesso su adesivi che possono oscurare i dettagli superficiali o richiedere una manipolazione fisica con pinzette che applica pressione sulla capsula cefala. Come osservato negli studi sulla morfogenesi retinica, l'integrità strutturale dell'occhio è fondamentale. La pressione diretta o la puntura provoca perdite di emolinfa, portando a perdita di pressione interna e al successivo collasso o "ammaccamento" della superficie oculare. Questi artefatti meccanici possono imitare fenotipi neurodegenerativi o difetti genetici, portando a risultati falsi positivi in screening su larga scala. L'obiettivo di questo protocollo è fornire un flusso di lavoro di montaggio e imaging non distruttivo per la visualizzazione ad alta risoluzione degli occhi composti intatti di Drosophila.

Qui presentiamo un flusso di lavoro di imaging rapido e riproducibile che consente la visualizzazione ad alta risoluzione degli occhi composti intatti di Drosophila e della morfologia dell'intera testa senza contatto diretto con la testa. In questo metodo, le mosche adulte vengono immobilizzate utilizzando una strategia di montaggio adesivo flessibile che fissa corpo e ali, permettendo una posizione stabile sia in orientamento laterale — per catturare la curvatura completa di un singolo occhio — sia in orientamento frontale — per valutare la simmetria dell'intera testa e le caratteristiche interoculari. Questa strategia di montaggio versatile minimizza i danni meccanici e preserva la geometria oculare nativa in tre dimensioni. Quando combinato con la stereomicroscopia a luce riflessa, l'acquisizione a Z-stack e^{la ricostruzione} estesa a profondità di fuoco, questo approccio genera immagini uniformemente nitite e di alta qualità da più prospettive, adatte sia all'ispezione qualitativa che all'analisi fenotipica quantitativa. Questo metodo è particolarmente adatto per studi su perturbazioni genetiche, fenotipi dello sviluppo e screening ad alto rendimento della morfologia oculare in Drosophila.

Protocol

1. Raccolta e sincronizzazione dei campioni

NOTA: Per garantire la comparabilità sperimentale, è necessario un rigoroso controllo della tempistica dell'eclosion. In condizioni di coltura standard a 25 °C, l'eclosione avviene tipicamente 10-12 giorni dopo la deposizione. Le pupe devono essere monitorate attentamente durante questa sera, poiché l'oscurimento della capsula pupale indica un'imminente eclosione.

1. Metodo del tap diretto (metodo standard)
   1. Tocca delicatamente la fiala standard di plastica 24 x 95 mm di Drosophila (sigillata con un tappo di schiuma) contro un tappeto morbido per spostare le mosche adulte verso il fondo.
   2. Rimuovi rapidamente il tappo e allinea la bocca di una fiala di raccolta fresca con la fiala di coltura.
   3. Inverti la configurazione in modo che la fiala di coltura sia sopra. Tocca delicatamente le pareti per trasferire le mosche nella fiala di raccolta.
      NOTA: Questo metodo non è raccomandato se il medio alimentare standard di farina di mais e agar è umido, poiché le mosche appena chiuse vengono facilmente intrappolate e uccise. Per minimizzare la mortalità, inizialmente raccogli le mosche in una fiala vuota di 24 x 95 mm. Dopo l'anestesia (Passo 3), trasferire le mosche sulla parete interna di una fiala da 24 x 95 mm contenente un mezzo alimentare fresco.
2. Metodo di trasferimento di geotassi negativa (metodo anti-adesione)
   1. Rimuovi il tappo da una fiala di raccolta nuova e invertilo sul piano di lavoro per impedire che le mosche randagi entrino.
   2. Tieni la fiala di coltura con l'apertura rivolta verso il basso. Le mosche si arrampiceranno verso il lato del cibo, lontano dall'apertura.
   3. Una volta che l'apertura è libera dalle mosche, stappa rapidamente la fiala di coltura e allineala con la fiala di raccolta 24 x 95 mm rovesciata e vuota sul banco.
   4. Tocca delicatamente il punto di connessione contro il piano di lavoro per far cadere le mosche nella fiala di raccolta.
      NOTA: Questo metodo riduce significativamente la mortalità causata dall'adesione alimentare, ma richiede più tempo rispetto al taglio diretto.
3. Metodo dell'anestesia CO₂ (Metodo ad alta efficienza)
   1. Inverti la fiala di coltura in modo che il tappo sia rivolto verso il basso.
   2. Inserisci con attenzione l'ago della pistola anestesica CO₂ tra il tappo e la parete della fiala.
   3. Aziona delicatamente il pedale e la valvola a mano per rilasciare il 100% di CO₂ a una portata bassa e delicata.
   4. Una volta che le mosche sono anestetizzate e sono cadute sul plug, posiziona la fiala della coltura orizzontalmente. Rimuovere il tappo, allinearlo con una fiala di raccolta vuota e toccare delicatamente la fiala di coltura per trasferire le mosche anestetizzate nella fiala di raccolta.
      NOTA: Un flusso d'aria eccessivo può soffiare le mosche sulla superficie del cibo, causando adesione e morte; mantenere rigorosamente un flusso di_CO2 delicato sufficiente ad anestetizzare le mosche senza spostarle fisicamente. Il monitor vola vicino per segnali precoci di guarigione, come sobbi spasmi o movimenti di ali e zampe.
4. Etichettatura e manutenzione
   1. Etichetta la fiala di raccolta con il sesso, la data di prelievo, la data di eclosione, il genotipo e le condizioni di coltura.
   2. Separazione tra i sessi: Se le mosche di imaging hanno più di 10 giorni, separare maschi e femmine in diverse fiale di coltura contenenti cibo per prevenire l'accoppiamento e l'emergere di una generazione F2, che potrebbe interferire con l'ambiente sperimentale.
      NOTA: Le mosche possono essere mantenute in queste fiale contenenti cibo in condizioni di coltura precedente (ad esempio, 25 °C) fino a raggiungere l'età desiderata per l'imaging di oggetto.

2. Preparazione della piastra di montaggio

1. Procura un vetrino di vetro standard pulito.
2. Taglia una striscia di nastro adesivo bianco di carta circa 2 cm più lunga rispetto al vetrino.
3. Posiziona il nastro sul carrello con il lato adesivo rivolto verso l'alto (lato non adesivo contro il vetro). Assicurati che il nastro sporga sulla slitta di circa 1 cm su entrambe le estremità.
4. Fissa le estremità sporgenti avvolgendo ben strette due strisce di nastro aggiuntive da ~5 mm attorno al retro del carrello.
5. Assicurati che la superficie adesiva sia piatta, rigida e priva di rughe.
6. Etichettatura: Segna gli indicatori di orientamento (ad esempio, "Top/Up" e "Bottom/Down") o gli identificatori di campioni sulle estremità non adesive del nastro per facilitare l'orientamento e il tracciamento del campione al microscopio.
   NOTA: Quando si selezionano le mosche per l'imaging, evita di scegliere individui con differenze significative di dimensioni corporee. Anche con lo stesso ingrandimento, variazioni di dimensioni corporee possono causare superfici oculari composte non comparabili.

3. Eutanasia e montaggio

1. Eutanasia
   1. Trasferire le mosche in una fiala di raccolta sigillata e vuota.
   2. Metti la fiala sigillata in un congelatore a -80 °C per 15–20 minuti.
      ATTENZIONE: Non forare o stringere mai la braguetta con le punte affilate di una pinzetta fine. Anche una lieve perdita di emolinfa provoca una rapida perdita di pressione idrostatica interna, portando a ammaccatura immediata e al collasso irreversibile dell'occhio composto, che danneggia la qualità dell'imaging.
2. Montaggio per la visuale laterale (Occhio composto singolo)
   1. Posizionamento: Sotto uno stereomicroscopio standard (ad esempio, Nikon SMZ745), si usano pinzette a punta fine per orientare la mosca eutanasiata in una posizione laterale (di lato).
   2. Trasferimento: Utilizzando pinzette a punta fine, afferra delicatamente la mosca per l'ala (mantenendo la postura laterale) e trasferiscila sulla piastra di montaggio adesiva preparata.
   3. Fissazione: Attacca un lato del corpo della mosca al nastro adesivo. Allarga le ali e attaccale piatte contro il nastro per aumentare la stabilità.
   4. Gestione dell'appendice: Durante il montaggio, assicurati che le gambe non ostruiscano l'occhio compound. Se le zampe anteriori bloccano il campo visivo, usa una pinzetta per tirarle via con cura dall'occhio e fissarle saldamente al nastro (ad esempio, estendendole verso il basso o infilandole sotto il torace).
   5. Fissazione: Inclina la pinzetta e usa il lato della punta (non la punta affilata) per premere delicatamente il corpo contro il nastro e garantire un legame sicuro.
   6. Regolazione fine: Controlla se la testa è orizzontale. Se l'occhio non è su un unico piano focale, usa una pinzetta per micro-regolare l'angolo del corpo.
3. Montaggio per la visuale frontale (Testa intera)
   1. Posizionamento: Sul pad anestesiale, orienta la mosca in posizione ventrale (prona).
   2. Trasferimento: Usa una pinzetta per afferrare un'ala e sollevare la mosca. Trasferiscilo sulla piastra di montaggio adesiva.
   3. Fissazione iniziale: Apri delicatamente entrambe le ali verso l'esterno (sinistra e destra) e premetile saldamente sulla superficie adesiva per ancorare la mosca.
   4. Stabilizzazione del corpo: Premere delicatamente sul torace per garantire un pieno contatto con la piastra adesiva. Usa una pinzetta per afferrare leggermente la parte posteriore dell'addome (coda) e tira delicatamente per raddrizzare l'asse del corpo prima di attaccare l'addome al nastro.
   5. Orientamento della testa: Regola l'angolo della testa usando pinzette sottili per assicurare che il piano frontale (faccia) sia parallelo alla superficie adesiva. Entrambi gli occhi composti dovrebbero essere in linea e visibili nello stesso piano focale.
4. Organizzazione
   1. Monta più mosche in file parallele o in una matrice a griglia sulla superficie adesiva. Assicurarsi che le singole mosche non si sovrappongano per prevenire interferenze tra gli Z-stack, anche se è consentito un compattamento ravvicinato per massimizzare la capacità di trasmissione (ad esempio, 20–30 mosche per diapositiva). Allinea tutte le mosche con la testa rivolta nella stessa direzione (come indicato dalle etichette nel passo 2.6) per facilitare l'imaging sistematico.
   2. Preparare array di campioni separati per l'imaging laterale e frontale utilizzando diversi set di mosche eutanasiate della stessa coorte. Una volta che una mosca è stata attaccata al nastro, non può essere rimossa o riposizionata in sicurezza senza causare gravi danni meccanici al campione; Pertanto, non è possibile visualizzare più viste in sequenza dallo stesso individuo.
      NOTA: È fortemente raccomandato di visualizzare i campioni immediatamente dopo l'eutanasia e il montaggio per prevenire la disidratazione dei tessuti.

4. Acquisizione di immagini

1. Avvio e inizializzazione del sistema di imaging stereomicroscopio motorizzato
   1. Accendi il PC, il monitor e l'unità del microscopio in sequenza.
   2. Avvia il software LAS X.
   3. Quando appare il prompt "Inizializza/Auto-test", assicurati che lo spazio sotto l'obiettivo sia libero da ostacoli e clicca su Conferma. Lascia che il microscopio completi l'intero movimento di calibrazione sull'asse Z.
      NOTA: I seguenti passaggi sono ottimizzati per uno stereomicroscopio con il sistema software LAS X.
2. Posizionamento del campione e illuminazione
   1. Trasferire la piastra di montaggio preparata sulla piattaforma base dello stereomicroscopio motorizzato, posizionandola manualmente per centrare il primo campione nell'array sotto l'obiettivo della fotocamera digitale.
   2. Accendi le sorgenti di Luce Trasmessa (base) e Luce Incidente (superiore). Per l'imaging oculare composto, usa principalmente la luce riflessa. Regola l'apertura per garantire un'illuminazione uniforme.
3. Configurazione software
   1. Imposta la modalità acquisizione su Z-stack. Nelle impostazioni del progetto, imposta la priorità del movimento multidimensionale su 'Z-first' per garantire un funzionamento continuo e stabile della trasmissione motorizzata.
   2. Imposta la modalità imaging su Luce Riflessa.
   3. Abilita la Profondità di Messa a Fuoco Estesa (EDF) per consentire la sintesi di un'immagine completamente messa a fuoco.
   4. Nelle impostazioni avanzate dell'immagine, attiva l'Alta Gamma Dinamica (HDR). Questo è fortemente raccomandato per mitigare le luci speculari e la sovraesposizione comunemente causate dalla superficie altamente riflettente e chitinosa dell'occhio composto.
4. Posizionamento e bilanciamento del bianco
   1. Regolare la manopola di ingrandimento al livello appropriato (ad esempio, un fattore di zoom di 16x per la visuale laterale a occhio singolo e 12,5x per la visuale frontale a tutta la testa), assicurandosi che la regione specifica di interesse occupi da metà a 2/3 del campo visivo.
   2. Posiziona manualmente la piastra di montaggio per portare il torace della mosca al centro del campo visivo.
   3. Esegui la calibrazione del bilanciamento del bianco usando il torace per correggere la temperatura di colore.
5. Parametri di esposizione e imaging (valori di riferimento)
   Esposizione: 60–80 ms.
   Guadagno: 0–5 (Tieni basso per minimizzare il rumore).
   Intensità: 60%–80%.
   Dimensione del passo Z-stack: Standard: 8–12 μm.
   NOTA: Per occhi composti lisci e sani (ad esempio, w¹¹¹⁸ × GMR-GAL4), possono essere sufficienti scale fino a 15 μm, poiché la curvatura continua e regolare richiede meno sezioni ottiche. Tuttavia, per fenotipi oculari ruvidi o irregolari caratterizzati da cambiamenti topologici bruschi, sono necessarie dimensioni di passo più piccole (fino a 5 μm) per catturare dettagli strutturali fini e migliorare significativamente la precisione della ricostruzione EDF.
6. Definizione e cattura dello Z-Stack
   1. Per la Visuale Laterale: Imposta l'intervallo Z-stack dal bordo orbitale (Start) all'ommatidia centrale (End) usando una dimensione di passo di 8–12 μm.
   2. Per la visuale frontale: regola la manopola di messa a fuoco finché il contorno esterno degli occhi composti non è appena a fuoco (Start). Regola la messa a fuoco nella direzione opposta finché gli ocelli centrali (occhi semplici gialli) sulla parte superiore della testa sono appena messi a fuoco (End). Clicca su Imposta Fine.
   3. Clicca su Ferma Live per bloccare l'anteprima.
   4. Clicca su Avvia acquisizione. Il sistema cattura automaticamente i piani focali definiti e sintetizza un'immagine ad alta risoluzione e completamente messa a fuoco.
7. Salvataggio file:
   1. Al termine della ricostruzione dell'EDF, clicca sull'icona Salva nell'interfaccia software (oppure naviga su File > Salva come).
   2. Seleziona la cartella di destinazione, inserisci il nome del file designato e clicca su Salva.
   3. Si noti che ogni acquisizione genera tre file immagine distinti: a. Immagine raw/canale (scala di grigi); b. Immagine di anteprima a colori; c. Immagine composita EDF (con il suffisso "_Composite")
      NOTA: Sia l'immagine raw/canale che l'immagine composita EDF devono essere conservate per analisi e documentazione

Results

L'intera pipeline sperimentale, dalla raccolta dei campioni all'acquisizione delle immagini, è riassunta nella Figura 1. L'efficienza del protocollo modificato è dimostrata attraverso la creazione di array di campioni ad alta densità. Come mostrato nella Figura 2A, 20–30 mosche anestetizzate possono essere disposte in un motivo a griglia su una singola piattaforma a nastro invertito. I marcatori di orientamento scritti sulle est...

Discussion

L'occhio composto di Drosophila funge da potente lettura fenotipica per lo screening genetico, dove cambiamenti osservabili nella dimensione dell'occhio, nella rugosità o nella^{pigmentazione 2,3,8} spesso indicano perturbazioni nelle vie fondamentali di segnalazione come Hippo ^5,6 o^{Hedgehog 7}. Tuttavia, l'e...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bombola di gas di anidride carbonica (CO2)	Fornitore locale	N/A
CO2 aspiratore anestesia	T& L	DG-08
Fotocamera digitale per microscopio	Leica	DMC6200
Pinzette pregiate	VETUS	MOS-167B
Tappi in schiuma	Dongpeng	N/A
Software per acquisizione immagini (LAS X)	Leica	3.7.1
Software di elaborazione immagini (FIJI/ImageJ)	NIH	Open source
Illuminatore a cupola LED	Leica	LED5000 HDI
Illuminatore LED Gooseneck	cossim	LG-10
Stereomicroscopio motorizzato	Leica	M205 FCA
Obiettivo	Leica	PlanApo NA0.2 1.0x
Valvola pneumatica a pedale	DELIXI	FV-320
Fiale standard per colture di Drosophila	LAIBOER	2424951
Mezzo alimentare standard per Drosophila	N/A	Farina di mais-agar-melassa
Vetri standard per microscopio in vetro	Citotest	10127101P-G
Stereomicroscopio standard	Nikon	SMZ745
Nastro adesivo bianco di carta	UBWIN	Larghezza 25mm