Profilazione multiomica integrata a singola singola e risolta spazialmente del trascricroma e dei bersagli epigenomici nelle sezioni di tessuto congelato

Summary

Questo studio presenta un protocollo multioma spaziale Trekker–CUT&Tag che combina il codice a barre spaziale diretto di una sezione tissutale con l'analisi multioma a singola cellula. Questo approccio consente contemporaneamente la profilazione spaziale dell'espressione genica a singola cellula e la modifica dell'istone H3K27ac, offrendo intuizioni meccanicistiche sulla regolazione genica nel contesto della microanatomia tissutale.

Abstract

Le tecnologie multiomiche spaziali combinate con la profilazione a singola cellula offrono opportunità senza precedenti per chiarire l'architettura molecolare e cellulare dei tessuti complessi. Combinare il codice a barre spaziale dei nuclei all'interno di singole criosezioni preparate da blocchi tissutali incorporati in un mezzo di congelamento a temperatura ottimale di taglio (OCT) con saggi multiomici a singola cellula in un flusso di lavoro semplice ed efficiente può facilitare l'annotazione e l'analisi molecolare risolta spazialmente delle cellule nei tipi di tessuto. Questo studio riporta un approccio multioma spaziale under target & tagmentation (CUT&Tag) che profila contemporaneamente la modifica dell'istone H3K27ac e l'espressione genica in una singola sezione cerebrale congelata. Dopo il codice a barre spaziali, i singoli nuclei vengono isolati e sottoposti a CUT&Tag, la cattura combinata di DNA, RNA e codici a barre taggati, alla preparazione della libreria e al sequenziamento. Il flusso di lavoro genera profili epigenomici e trascritomici spazialmente annotati dagli stessi nuclei, consentendo l'assegnazione delle informazioni multiomiche alle coordinate anatomiche. L'integrazione delle informazioni epigenomiche con i dati trascritomici spaziali aumenta la fedeltà dell'identificazione dei tipi cellulari e rivela programmi regolatori spazialmente organizzati e interazioni cellulari-cellule all'interno dei tessuti intatti.

Introduction

La biologia spaziale è un campo in rapida evoluzione che mappa la posizione, l'organizzazione e le interazioni di molecole, cellule e tessuti nei loro ambienti ^{nativi 1,2,3}. A differenza dei metodi monocellulari o convenzionali che richiedono dissociazione tissutale e causano perdita di informazioni posizionali, gli approcci spaziali preservano le coordinate fisiche degli analiti o delle cellule/nuclei, consentendo un'indagine diretta su come l'architettura tissutale influenzi l'identità cellulare, la comunicazione intercellulare e la funzione^biologica 4,5,6,7 . Sebbene la trascritomica spaziale e la proteomica spaziale siano attualmente le modalità più ampiamente adottate, il campo si sta rapidamente espandendo verso la profilazione multi-omica^{spaziale 3,8,9}. La co-profilazione dell'espressione genica e degli stati epigenomici all'interno dello stesso tessuto è particolarmente potente, poiché collega direttamente l'output trascrizionale ai meccanismi regolatori—come l'accessibilità alla cromatina e le modifiche agli istoni—che regolano l'attività genica e sono noti per variare tra domini^spaziali 10,11,12 . Pertanto, l'analisi integrata dell'epigenoma spaziale e del trascristoma fornirà approfondimenti fondamentali su come i programmi regolatori modellano l'identità cellulare e l'organizzazione dei tessuti.

Sono state sviluppate diverse strategie multiomiche spaziali per consentire una profilazione epigenomica e trascrictomica simultanea. Il codice a barre deterministico nel sequenziamento tissutale (DBiT-seq) impiega canali microfluidici per consegnare codici a barre spaziali direttamente o indirettamente, tramite stampatura con lastre di gel, alle sezioni di tessuto, permettendo l'annotazione spaziale degli aliti. Questo approccio facilita la co-profilazione spazialmente risolta di caratteristiche epigenomiche e^{trascrictomiche} 12,13,14,15. Il metodo Slide-tag, commercializzato come piattaforma Takara Trekker, introduce direttamente codici a barre spaziali nel tessuto intatto prima della dissociazione, permettendo di processare nuclei indicizzati spazialmente utilizzando flussi di lavoro standard a singola cellula e proiettare computazionalmente di nuovo alle loro coordinate tessutali^{originali 16}. Al contrario, il saggio spaziale per cromatina accessibile, linee cellulari ed espressione genica con sequenziamento (SPACE-seq) impiega una strategia target-out in cui bersagli epigenetici a coda poli(A) e mRNA vengono catturati su una sequenza di cattura poli-dT nelle tessere di trascritomica^{spaziale 17}.

Cliavage under target & tagmentation (CUT&Tag) è uno strumento potente per mappare le interazioni tra DNA e proteine di istone o non itoniche da campioni di input estremamente^{bassi 18}. CUT&Tag si basa sulla frammentazione della cromatina mediata dalla transposasi Tn5 e sul marcaggaggio del DNA (tagmentazione), impiegando Tn5 proteico coniugato con proteina A guidato da anticorpi per la clivagatura specifica del loco e il marcaggaggio molecolare. Mentre il saggio convenzionale CUT&Tag prevede molteplici fasi di incubazione e lavaggio, è stato utilizzato un flusso di lavoro semplificato e snello per migliorare l'efficienza CUT&Tag nelle applicazioni multioma a singola cella a^{valle 19}.

Figura 1: Panoramica del flusso di lavoro e del controllo qualità del multioma spaziale Trekker–CUT&Tag. (A) Diagramma schematico del flusso di lavoro spaziale Trekker–CUT&Tag multiome. Una sezione coronale di tessuto cerebrale di topo fresco e congelato viene montata su una piastrella spaziale Trekker e sottoposta a codice a barre spaziali. Dopo la lisi tissutale, i nuclei vengono isolati e valutati per resa e qualità. Circa 50.000 nuclei sono utilizzati per H3K27ac CUT&Tag, e i nuclei etichettati sono sottoposti a barcoding a singola cellula utilizzando 10x perle di gel Genomics Chromium Multiome dopo il conteggio. Il DNA a barre a singola cellula viene preamplificato e diviso in due frazioni. La libreria indicizzata CUT&Tag viene generata direttamente tramite PCR indicizzato. Per l'espressione genica e le librerie di codici a barre spaziali, il DNA preamplificato viene ulteriormente amplificato e selezionato per dimensione. Frammenti corrispondenti alle dimensioni tipiche del cDNA sono utilizzati per la preparazione della libreria di espressione genica, mentre frammenti di DNA più corti vengono utilizzati per generare la libreria di codici a barre spaziali. Le librerie sono sequenziate e mappate seguendo le linee guida 10x di Genomics e Curio Trekker. La timeline sperimentale prevista è indicata a sinistra. (B) Checkpoint chiave di controllo qualità (QC) e considerazioni critiche durante tutto il flusso di lavoro. La QC dei nuclei include la valutazione della ressa, della integrità, dell'aggregazione e del contenuto di detriti. Il controllo qualità pre-sequenziamento include la valutazione delle distribuzioni dimensionali del DNA e la contaminazione da dimeri primer per tutte le librerie. La specificità della libreria CUT&Tag viene valutata tramite PCR quantitativa (qPCR), che misura l'arricchimento delle regioni genomiche target sul fondo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Questo studio presenta un saggio multioma spaziale Trekker CUT&Tag che profila simultaneamente la modifica degli istoni H3K27ac associata a elementi cis-regolatori attivi e all'espressione genica in sezioni di tessuto fresco congelato. Questo protocollo fornisce procedure passo dopo passo per il codice a barre spaziale Takara Trekker, la dissociazione dei tessuti e l'isolamento dei nuclei, il conteggio e il controllo qualità dei nuclei, il profiling CUT&Tag a basso input della modifica H3K27ac, la cattura di bersagli molecolari su 10x perle di gel multicellulare singole Genomics e la preparazione delle librerie. Il flusso di lavoro è stato dimostrato utilizzando una sezione coronale di tessuto cerebrale di topo. A differenza del flusso di lavoro standard 10x Genomics Multiome, in cui l'accessibilità alla cromatina viene misurata tramite test per cromatina accessibile alla transposasi con sequenziamento ad alto rendimento (ATAC-seq), questo protocollo sostituisce frammenti di DNA derivati da CUT&Tag a frammenti ATAC, consentendo l'interrogazione diretta dei paesaggi di modifica degli istoni a risoluzione di singola cellula. Per collegare i codici a barre spaziali Trekker con codici a barre singola 10x Genomics, codici a barre spaziali con coda poli(A) e trascritti mRNA vengono catturati dalle sequenze poli-dT delle perle di gel Multiome, mentre i frammenti di DNA CUT&Tag vengono catturati dalle sequenze spaziatori. Questa strategia di doppia cattura consente il recupero simultaneo di informazioni epigenomiche, trasscrittomiche e spaziali dallo stesso singolo nucleo. Per quanto ne sappiamo, questo è il primo flusso di lavoro multiomico spaziale che integra direttamente l'annotazione spaziale Trekker con codice a barre con un saggio multioma a singola cellula per co-profilare la distribuzione genomica a livello genomico di un segno istonico e il trascritoma. I paesaggi multiomici risolti spazialmente risultanti, che integrano l'occupazione di H3K27ac e i dati di espressione genica, permettono la proiezione dei profili cellulari singoli alle coordinate tessutali originali e forniscono un collegamento diretto tra i meccanismi regolatori epigenomici e i programmi trascrizionali in relazione all'architettura tissutale intatta.

Protocol

I topi adulti sono stati eutanasiati per inalazione di CO₂ (IACUC #: A48315-15-R24) prima del prelievo dei tessuti. I cervelli sono stati rimossi completamente dopo una craniotomia sagittale e la rimozione della calvaria a metà. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Montare una sezione di tessuto sulla tessera del codice a barre Trekker per il codice a barre spaziale

1. Prepara quanto segue prima di iniziare.
   1. Bilanciare il blocco tessutale ottimale incorporato nella temperatura di taglio (OCT) in un criostato prima della sezionazione. Preparare i tamponi per la clivatura UV, la dissociazione tissutale e l'isolamento dei nuclei.
      NOTA: La temperatura ottimale per la sezionamento può variare a seconda del tipo di tessuto.
   2. Per l'isolamento dei nuclei, preraffreddare la centrifuga con secchi oscillanti per tubi da 1,5 mL a 4 °C. Preraffredda una piastra a 12 pozzi con un O-ring Trekker su freddo.
   3. Imposta il misuratore UV al limite massimo di corrente (1,2 A) e alla potenza massima.
2. Registra l'ID della piastrella con codice a barre spaziale (ad esempio, U0001_001) della tessera Trekker da utilizzare.
   NOTA: Ogni tessera Trekker contiene coordinate uniche di codice a barre. L'ID della tile è necessario per recuperare il file corretto per la mappatura spaziale del codice a barre dei dati di sequenziamento.
3. Taglia il tessuto in sezioni. La sezione coronale di spessore 25 μm nella posizione approssimativa del bregma -1 mm è stata eseguita a −18 °C (Figura 1A).
   NOTA: Lo spessore può essere aumentato fino a 30 μm quando si lavora con tessuti a bassa cellularità.
4. Posiziona la sezione (o la regione di interesse) sulla piastrella spaziale e fondila posando delicatamente un dito sul fondo del vetro a scorrimento.
   ATTENZIONE: Se necessario, verifica le procedure tramite le misurazioni di controllo qualità dei nuclei utilizzando la casella di addestramento Trekker.
5. Usa una pinzetta per rimuovere le piastrelle dall'adesivo trasparente e posizionarle in un pozzo di una piastra di coltura tessutale a 12 pozzi sul ghiaccio sopra l'anello O-Ring Trekker. Immediatamente pipetta 30 μL di buffer di taglio UV Trekker sulla piastrella, assicurandoti che tutto il tessuto sia coperto da tamponamento.
6. Posiziona la lampada UV (impostazione 1,2 A) sulla piastra direttamente sopra il pozzo. Illumina per 1 minuto per liberare i codici a barre mantenendo tutto sul ghiaccio.
   ATTENZIONE: Indossa occhiali UV protettivi quando lavori con la lampada UV.
7. Spegni la lampada UV e incuba la piastrella sul ghiaccio per 7,5 minuti. Durante l'incubazione, estrai una camera di lavaggio Trekker 10 x 10 e riempi le camere 1 e 2 con 400 μL di tampone di lavaggio a nuclei freddi Trekker per un campione su ghiaccio.
8. Raccogli con cura le piastrelle con una pinzetta senza toccare le perline e lava le piastrelle nella camera 1 per 5 secondi. Lava le piastrelle nella camera 2 per 5 secondi. Posiziona con cura le piastrelle in un pozzo nella piastra a 12 pozzi sul ghiaccio. La sezione di tessuto dovrebbe essere tinta di blu e facilmente visibile.

2. Dissociazione tissutale e isolamento dei nuclei

1. Somministrare 175 μL di buffer Minuto A Invent puntando al tessuto. Ripeti altre 3 volte per ottenere un totale di 700 μL. Ad ogni dispensazione, mira a diverse parti della piastrella per staccare l'intero tessuto dalla piastrella.
   NOTA: Evita che le perline si contaminino da graffi sulle piastrelle o da perline che cadano.
2. Continuare a dissociare il tessuto dalla piastrella aspirando il tampone dal lato del pozzo e distribuendolo sulle regioni della piastrella coperte da tessutino, mantenendo la piastra sul ghiaccio il più possibile. Ripeti finché non rimane più un fazzoletto sulle piastrelle. Una volta rimosso tutto il tessuto dalle piastrelle, usa con attenzione una pinzetta per trasferire la piastrella in un pozzo vuoto.
3. Usa una pipetta P1000 per dissociare meccanicamente i nuclei con triturazioni ripetute nello stesso pozzo. Ripeti finché non rimangono più pezzi di tessuto visibili.
4. Trasferire con cura la sospensione dei nuclei su una cartuccia filtrante con un tubo di raccolta del kit di isolamento a nucleo singolo Invent Minute per tessuti/cellule neuronali. Incubare il tubo con il tappo aperto a –20 °C per 10 minuti. Tappa la cartuccia del filtro e centrifuga immediatamente a 13.000 x g per 30 secondi in una microcentrifuga refrigerata.
5. Scartare la cartuccia filtrante e sospendere il pellet pipettando delicatamente 10–20 volte. Fai girare il tubo nella centrifuga pre-raffreddata con secchi oscillanti a 600 x g per 5 minuti. Rimuovere con attenzione il sovrantantante e risospendere il pellet in 200 μL di buffer Trekker C.
6. Aggiungi 1 mL di buffer Minute B freddo Invent a un tubo Eppendorf a basso legame da 1,5 mL e sovrapponi con cura 200 μL di sospensione dei nuclei sopra il buffer Minute B espellendo lentamente contro la parete del tubo per evitare la mescolanza degli strati. Fai girare il tubo nella centrifuga preraffreddata con secchi oscillanti a 500 x g per 10 minuti. Rimuovi con attenzione lo strato lattiginoso e il surnadante.
7. Risospendere delicatamente i nuclei con 24 μL di buffer Trekker C e procedere con misurazioni di controllo qualità dei nuclei isolati.

Figura 2: Valutazione del controllo qualità dei nuclei isolati. Immagini rappresentative in campo chiaro di nuclei isolati dal tessuto cerebrale del topo. I nuclei sono stati colorati con blu di tripano allo 0,4% e fotografiati a un ingrandimento di 40x per valutare l'integrità nucleare e la presenza di detriti. La preparazione dei nuclei mostrata a sinistra mostra nuclei intatti di alta qualità adatti ai saggi a valle, mentre la preparazione mostrata a destra illustra nuclei di scarsa qualità con aggregati tissutali parzialmente lisati. I nuclei danneggiati o rotti sono indicati da punte di freccia riempite. La barra della scala è di 100 μm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

3. Conteggio e misurazioni QC dei nuclei isolati

1. Per il conteggio dei nuclei, si prelevano 2 μL della sospensione dei nuclei in 8 μL di tampone Trekker C. Miscela 10 μL della sospensione diluita dei nuclei con 10 μL di soluzione di colorazione AO/PI. Contare i nuclei secondo le istruzioni del produttore.
2. Per valutare la qualità dei nuclei isolati, diluire 2 μL della sospensione dei nuclei in 8 μL di soluzione blu di tripano al 4%. Esaminare i nuclei al microscopio a fluorescenza a un ingrandimento di 40X, verificando la morfologia intatta della membrana nucleare e del contenuto di detriti non nucleari (Figura 2).
3. Procedere immediatamente al test multioma CUT&Tag a nucleo singolo (CUT&Tag su H3K27ac + espressione genica).
   ATTENZIONE: Procedere ai passaggi successivi se vengono recuperati almeno 30.000 nuclei di alta qualità.

4. Etichettatura CUT&Tag su nuclei isolati

1. Prepara il buffer di incubazione CUT&Tag I. Mettilo sul ghiaccio.
2. Preparare anticorpi primari e trasposasi attivati tramite il coniugato enzimatico guida (TAG).
   1. Aggiungere 46,23 μL di buffer di incubazione CUT&Tag I e 1,33 μL di enzima TAG in un tubo PCR su ghiaccio. Aggiungi una quantità ottimizzata di anticorpi primari alla tuba. Mescola lentamente pipettando 10 volte.
      NOTA: 2,43 μL di anticorpo anti-H3K27ac sono stati aggiunti alla reazione. Il lotto di anticorpi è stato convalidato per test CUT e tag in bulk e in situ . Ottimizzare la quantità di anticorpi per la coniugazione dell'enzima TAG tramite test di massa. L'anticorpo ottimale è stato definito come la concentrazione più bassa che ha raggiunto il massimo rapporto segnale-rumore, determinato dalla qPCR sia nei loci bersagli positivi che negativi.
   2. Fai una breve rotazione e posiziona il tubo su un rotatore a 18 giri/min. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora. La miscela risultante può essere pre-preparata e posta sul ghiaccio per un massimo di 5 ore.
      NOTA: L'incubazione antibody-TAG può essere eseguita contemporaneamente o prima dell'isolamento dei nuclei.
3. Incubazione di nuclei isolati con coniugato enzimatico anticorpi-TAG.
   1. Fai girare il tubo (Passo 2.7) dei nuclei isolati nella centrifuga preraffreddata con secchi a rotazione a 500 x g per 10 minuti. Rimuovere il soprantantante senza disturbare il pellet e lasciare ~5 μL di surnatante.
   2. Aggiungi 25 μL di buffer di incubazione CUT&Tag I (Passo 4.1) e risospedi pipettando delicatamente 10 volte. Trasferire i nuclei al tubo (Passo 4.2.2) contenente il coniugato anticorpi-TAG utilizzando la stessa punta della pipetta. Mescola delicatamente pipettando 10 volte e posiziona il tubo su un rotatore delicato.
   3. Incubare durante la notte a 4 °C.
4. Il giorno successivo (giorno 2), preparare 1X CUT&Tag nuclei buffer e metterlo sul ghiaccio.
5. Taglatura CUT&Tag
   1. Recupera il tubo di reazione (Passo 4.3.3) dal rotatore. Aggiungi 5 μL di attivatore CUT&Tag e trasferisci la miscela in un nuovo tubo da 1,5 mL. Incubare per 1 ora a 37 °C sul ThermoMixer a 550 giri/min.
   2. Recupera il tubo, aggiungi 20 μL di tampone di tempra CUT&Tag e mescola delicatamente la reazione pipettando 10 volte. Centrifuga il tubo nella centrifuga preraffreddata con secchi oscillanti a 500 x g per 10 minuti. Rimuovere il sovrantantante senza disturbare il pellet dei nuclei, lasciando ~5 μL di sovrantantante sul fondo del tubo.
   3. Aggiungi 100 μL di buffer per nuclei 1X CUT&Tag e risospensi i nuclei pipettando delicatamente 10 volte. Fai girare il tubo nella centrifuga preraffreddata con secchi oscillanti a 500 x g per 10 minuti. Rimuovere 85 μL del sovrantante, lasciando ~15 μL. Risospendere i nuclei pipettando delicatamente e lentamente 10 volte.
6. Conteggio dei nuclei etichettati e determinazione del numero di targeting
   1. Aggiungere 1 μL della sospensione dei nuclei marcati in 9 μL di soluzione salina tamponata con fosfato e mescolare con 10 μL di soluzione di colorazione AO/PI. Contare i nuclei etichettati come descritto nello Step 3.1.
   2. Utilizzare 1,6 volte il numero target di nuclei per la generazione di GEM a singola cellula per ottenere il numero desiderato di nuclei catturati.
   3. Fai girare il tubo nella centrifuga preraffreddata con secchi a 500 x g per 10 minuti e rimuovi con cura il soprantantante, lasciando un volume finale di 8 μL.

5. Codice a barre a singola cellula dei nuclei etichettati e pre-amplificazione di DNA con codice a barre

1. Aggiungi 7 μL di buffer ATAC B a 8 μL dei nuclei marcati con il numero atteso di nuclei di riferimento per il tuo esperimento.
   NOTA: Vedi maggiori dettagli sulle configurazioni di reazione e sul funzionamento dello strumento Chromium X nel protocollo "GEM Generation & Barcoding" della guida utente Chromium Next GEM Single-Cell Multiome ATAC + Gene Expression Kit (CG000338 Rev G).
2. Generazione GEM e codice a barre utilizzando lo strumento Chromium X.
   1. Aggiungere 60 μL di master mix GEM al tubo contenente nuclei etichettati. Mescola delicatamente tramite pipetto e carica sulla prima fila del chip Chromium Next GEM.
   2. Prepara le perline in gel multioma a singola e carica 50 μL di perle in gel sulla seconda fila. Dispensare 45 μL di olio di suddivisione nei pozzi della fila 3.
   3. Inserire il chip assemblato J con la guarnizione nel vassoio dello strumento Chromium X e far girare lo strumento.
   4. Aspirare lentamente 100 μL di GEM dai punti più bassi dei pozzi di recupero nella fila superiore 3. Distribuire lentamente i GEM nel nuovo tubo PCR su ghiaccio con le punte della pipetta contro le pareti laterali dei pozzi.
   5. Incubare le GEM raccolte in un termociclatore (temperatura del coperchio a 50°C) seguendo il seguente protocollo: un ciclo a 37 °C per 45 minuti, un ciclo a 25 °C per 30 minuti e 4 °C per la conservazione.
   6. Aggiungi 5 μL di agente temprante e mescola lentamente pipettando 10 volte.
3. Pulizia dell'incubazione post-GEM e purificazione del DNA
   NOTA: Vedi maggiori dettagli nel protocollo "Post GEM Incubation Cleanup" della guida utente Chromium Next GEM Single-Cell Multiome ATAC + Gene Expression Kit (CG000338 Rev G).
   1. Aggiungi 125 μL di agente recuperativo rosa al tubo a temperatura ambiente e inverti delicatamente il tubo 10 volte. Centrifuga brevemente. Rimuovere lentamente e scartare 125 μL di agente di recupero/olio di partizione (rosa) dal fondo del tubo.
   2. Aggiungi 200 μL di miscela puliziora Dynabeads al tubo e mescola pipettando 10 volte. Incubare 10 minuti a temperatura ambiente. Metti il tubo sul supporto magnetico finché la soluzione non si risolve. Rimuovi il soprannatante.
   3. Aggiungi 300 μL di etanolo all'80% appena preparato al pellet. Incuba 30 secondi e rimuovi il soprantantante. Aggiungi 200 μL di etanolo all'80% al pellet, incuba 30 secondi e rimuovi il soprantantante. Fai girare brevemente il tubo e posizionalo sul magnete. Rimuovi il soprandanante rimasto.
   4. Rimuovi il tubo dal magnete. Aggiungi immediatamente 50,5 μL di soluzione eluzione I. Mescola tramite pipettaggio e incuba per 1 minuto a temperatura ambiente. Gira brevemente e posiziona il tubo sul magnete finché la soluzione non si dissolve. Trasferire 50 μL di soluzione libera a una nuova provetta.
   5. Purificazione del DNA tramite perle paramagnetiche
      1. Aggiungi 90 μL di sfere paramagnetiche (1,8X) a ogni campione e mescola pipettando accuratamente. Incubare 5 minuti a temperatura ambiente. Gira brevemente e posiziona il tubo sul magnete finché la soluzione non si dissolve. Rimuovi il soprannatante.
      2. Aggiungi 200 μL di etanolo all'80% al pellet. Incubare per 30 secondi. Rimuovi l'etanolo. Ripeti questa cosa ancora una volta.
      3. Gira brevemente e posiziona il tubo sul magnete. Rimuovi il soprandanante rimasto.
      4. Rimuovi il tubo dal magnete. Aggiungi 46,5 μL di EB tampone e mescola tramite pipetta. Incubare 2 minuti a temperatura ambiente. Fai girare e posizionare la soluzione sul magnete finché la soluzione non si dissipa.
      5. Trasferire 46 μL di DNA purificato in un nuovo tubo.
4. Pre-amplificazione di DNA con codice a barre.
   1. Aggiungi 54 μL di miscela di preamplificazione a ciascun campione. Miscela per pipette e centrifuga brevemente.
   2. Incubare in un termociclatore (temperatura del coperchio a 105 °C) seguendo il seguente protocollo: un ciclo a 72 °C per 5 minuti; un ciclo a 98 °C per 3 minuti; un totale di 7 cicli a 98 °C per 20 secondi, 63 °C per 30 secondi, 72 °C per 1 minuto; un ciclo di 72 °C per 1 minuto; e una tenuta a 4 °C. Conserva a 4 °C durante la notte.
   3. Il giorno successivo (Giorno 3), purificare il DNA preamplificato con perle paramagnetiche (1,6X) come descritto nello Passo 5.3.5. Aggiungi 80,5 μL di EB tampone al tubo e mescola pipettando. Incubare 2 minuti a 22 °C (temperatura ambiente). Gira brevemente e posiziona il tubo sul magnete finché la soluzione non si dissolve.
   4. Trasferire 80 μL di DNA preamplificato in un nuovo tubo. Usa 40 μL per generare la libreria CUT&Tag. Conservare i DNA preamplificati rimanenti a 4 °C.
      NOTA: 40 μL dei DNA preamplificati rimanenti saranno utilizzati successivamente per l'espressione genica e le librerie di codici a barre spaziali.

6. Preparazione della libreria per CUT&Tag, espressione genica e codici a barre spaziali

1. Preparazione della libreria scCUT&Tag
   1. Trasferire 40 μL di DNA preamplificati in una nuova valvola e aggiungere 60 μL di miscela PCR a indice del campione. Mescola tramite pipetto e centrifuga brevemente.
   2. Incubare in un termociclatore (temperatura del coperchio a 105 °C) seguendo il seguente protocollo: un ciclo a 98 °C per 45 secondi; un totale di 12 cicli di 98 °C per 20 s, 67 °C per 30 s, 72 °C per 20 s; un ciclo di 72 °C per 1 minuto; 4 °C per la conservazione).
      NOTA: Il numero ottimale del ciclo dipende dal numero iniziale di nuclei e dal segno degli istoni da profilare. Dodici cicli di amplificazione sono stati utilizzati per il marchio H3K27ac nell'esperimento.
   3. Doppia selezione della dimensione e purificazione del DNA tramite sfere paramagnetiche (0,6X, 1,55X)
      1. Aggiungi 60 μL di sfere paramagnetiche (0,6X) a ogni campione e mescola pipettando accuratamente. Incubare 5 minuti a temperatura ambiente. Gira brevemente e posiziona il tubo sul magnete finché la soluzione non si dissolve.
      2. Trasferire 150 μL di soprantantante in un nuovo tubo. Aggiungi 95 μL di sfere paramagnetiche (1,55X) a ciascun campione (surnatante) e mescola pipettando. Incubare 5 minuti a temperatura ambiente. Posiziona il tubo sul magnete finché la soluzione non si risolve. Rimuovi il soprannatante.
      3. Aggiungi 300 μL di etanolo all'80% al pellet. Aspetta 30 secondi. Rimuovi l'etanolo. Ripetilo ancora una volta. Gira brevemente e posiziona il tubo sul magnete. Rimuovi il soprandanante rimasto.
      4. Rimuovi il tubo dal magnete. Aggiungi 20,5 μL di EB tampone al tubo e mescola tramite pipetta. Incubare 2 minuti a temperatura ambiente. Fai girare e posizionare la soluzione sul magnete finché la soluzione non si dissipa.
      5. Trasferire 20 μL di librerie CUT&Tag purificate e indicizzate su nuovi tubi.
2. Controllo QC per la libreria CUT&Tag
   1. Analisi della distribuzione delle dimensioni del DNA nella biblioteca
      1. Mescola 1 μL di DNA della biblioteca purificato con 1 μL di tampone a basso TE.
      2. Mescola il DNA diluito con il buffer di lavoro Fragment Analyzer e esegui sullo strumento il kit di frammenti HS NGS ad alta sensibilità (1-6000bp) (Figura 3A).
   2. Valutare l'arricchimento di un locus genomico positivo a H3K27ac prima del sequenziamento e della mappatura.
      1. Mescola 1 μL di DNA della biblioteca purificata con 4 μL di acqua priva di nucleasi. Utilizzare 1 μL di DNA di biblioteca diluito per le misurazioni qPCR di tre loci genomici.
         NOTA: Per H3K27ac CUT&Tag, l'innesco positivo è stato progettato dal locus Actb-TSS, mentre gli innesco che mirano al T1-TSS e un locus intergenico hanno servito come controlli^{negativi 20} (Tabella 1). Il DNA genomico del topo è stato utilizzato come controllo di input per normalizzare l'efficienza della PCR (Figura 3B).
      2. Prepara un totale di 20 μL della miscela di reazione come segue: 1 μL di DNA della biblioteca diluita, 2 μL di miscela primer da 10 μM, 10 μL di 2X SYBR Green Master Mix e 7 μL di acqua priva di nucleasi.
      3. Eseguire la piastra qPCR preparata sul sistema CFX Opus Real-Time PCR utilizzando il programma di ciclaggio appropriato per il rilevamento SYBR Green.
3. Amplificazione di cDNA e DNA di codici a barre spaziali.
   1. Trasferire 35 μL di DNA preamplificati (Passo 5.4.4) in un nuovo tubo e aggiungere 65 μL di miscela di reazione di amplificazione del cDNA. Mescola tramite pipetto e centrifuga brevemente. Il primer utilizzato per l'amplificazione del DNA cDNA e del codice a barre spaziale è il Feature cDNA Primers 2.
   2. Incubare in un termociclatore (temperatura del coperchio a 105 °C) seguendo il seguente protocollo: un ciclo a 98 °C per 45 secondi; un totale di 8 cicli a 98 °C per 20 secondi, 63 °C per 30 secondi, 72 °C per 1 minuto; un ciclo di 72 °C per 1 minuto; 4 °C per trattenere.
      NOTA: Il numero ottimale del ciclo deve essere determinato in base al tipo cellulare, al contenuto di RNA e al numero iniziale di nuclei. In questo esperimento sono stati eseguiti 8 cicli di amplificazione.
   3. Purificazione dei cDNA amplificati
      1. Doppia selezione della dimensione e purificazione del DNA tramite perle paramagnetiche (0,6X, 2,0X) come descritto nel Passo 6.1.3. Aggiungere 60 μL di sfere paramagnetiche (0,6X) a ciascun campione e mescolare tramite pipetta. Incubare 5 minuti a temperatura ambiente. Metti il magnete sulla soluzione finché non si risolve.
      2. Trasferire e conservare 75 μL di sovrantantante in un nuovo tubo senza disturbare il pellet. Manteni a temperatura ambiente.
         ATTENZIONE: Non scartare il sovrantante, poiché contiene DNA arricchito per frammenti più brevi che verranno utilizzati per generare la libreria di codici a barre spaziali.
      3. Rimuovi il soprantantante residuo dal pellet. Lavare con etanolo all'80% due volte come descritto nel Passaggio 6.1.3.
      4. Aggiungi 40,5 μL di EB tampone al tubo e mescola tramite pipetta. Incubare 2 minuti a temperatura ambiente. Gira brevemente e posiziona sul magnete finché la soluzione non si dissipa.
      5. Trasferire 40 μL di cDNA amplificato in un nuovo tubo. Lascialo sul ghiaccio per preparare una libreria di espressione genica indicizzata.
         NOTA: Questa frazione arricchisce i DNA per la dimensione tipica dei cDNA.
   4. Purificazione dei DNA amplificati a codice a barre spaziali
      1. Aggiungi 70 μL di sfere paramagnetiche (2,0X) a 75 μL del sovrantantante precedentemente salvato (Passo 6.3.3.2). Mescola tramite pipetto e centrifuga brevemente. Incuba per 5 minuti a temperatura ambiente. Posiziona il tubo sul magnete finché la soluzione non si risolve. Rimuovi il soprannatante.
      2. Lavare con etanolo all'80% due volte come descritto nel Passaggio 6.1.3.
      3. Aggiungi 40,5 μL di EB tampone al tubo e mescola tramite pipetta. Incubare 2 minuti a temperatura ambiente. Gira brevemente e posiziona sul magnete finché la soluzione non si dissipa.
      4. Trasferire 40 μL di DNA a codice a barre spaziali amplificati e purificati in un nuovo tubo. Conservare a −20 °C per la successiva generazione della libreria di codici a barre spaziali indicizzata.
   5. Analisi delle dimensioni del cDNA tramite l'Analizzatore di Frammenti. Mescola 1 μL di cDNA amplificato con 1 μL di tampone a basso TE. Eseguire i DNA diluiti tramite Fragment Analyzer come descritto nello Passo 6.2.1.
   6. Preparazione della libreria di espressione genica indicizzata
      1. Trasferire 10 μL di cDNA amplificati (Passaggio 6.3.3.5) in una nuova valvola. Aggiungere 25 μL di EB tampone e 15 μL di miscela di frammentazione. Mescola pipettando sul ghiaccio. Gira brevemente e trasferisci il tubo nel termociclatore pre-raffreddato a 4 °C.
      2. Incubare in un termociclatore (temperatura del coperchio a 65 °C) avviando il seguente protocollo: un ciclo a 32 °C per 5 minuti; un ciclo a 65 °C per 30 minuti; 4 °C per trattenere.
      3. Doppia selezione della dimensione e purificazione del DNA tramite perle paramagnetiche (0,6X, 0,8X) come descritto nel Passo 6.1.3. Aggiungi 50,5 μL di EB tampone e mescola pipettando. Incubare 2 minuti a temperatura ambiente. Gira brevemente e posiziona sul magnete finché la soluzione non si dissipa.
      4. Trasferire 50 μL di campione in una nuova provetta. Aggiungi 50 μL di miscela per legatura adattatore e mescola tramite pipetta. Gira brevemente. Incubare in un termociclatore (temperatura del coperchio a 30 °C) seguendo il seguente protocollo: un ciclo di 20 °C per 15 minuti e 4 °C per la tenuta.
      5. Purificazione del DNA tramite sfere paramagnetiche (0,8X) come descritto nel Passo 5.3.5. Aggiungi 30,5 μL di EB tampone e mescola pipettando. Incubare 2 minuti a temperatura ambiente. Gira brevemente e posiziona sul magnete finché la soluzione non si dissipa. Trasferire 30 μL del campione in un nuovo tubo.
      6. Indice PCR della libreria di espressione genica. Aggiungi 50 μL di mix di ampere e aggiungi 20 μL di un singolo set A a doppio indice TT a ciascun campione.
      7. Incubare in un termociclatore (temperatura del coperchio a 105 °C) seguendo il seguente protocollo: un ciclo a 98 °C per 45 secondi; un totale di 11 cicli di 98 °C per 20 s, 54 °C per 30 s, 72 °C per 20 s; un ciclo di 72 °C per 1 minuto; 4 °C per trattenere.
         NOTA: Il numero ottimale del ciclo deve essere determinato in base al tipo cellulare, al contenuto di RNA e al numero iniziale di nuclei. In questo esperimento sono stati utilizzati in totale 11 cicli di amplificazione.
      8. Doppia selezione della dimensione e purificazione del DNA tramite perle paramagnetiche (0,6X, 0,8X) come descritto nel Passo 6.1.3. Aggiungi 35,5 μL di EB del tampone al tubo e mescola pipettando. Incubare 2 minuti a temperatura ambiente. Gira brevemente e posiziona sul magnete finché la soluzione non si dissipa.
      9. Trasferire 35 μL di libreria di espressione genica purificata e indicizzata in un nuovo tube.
4. Analisi della distribuzione della dimensione del DNA nella libreria di espressione genica. Mescola 1 μL di DNA della biblioteca con 1 μL di tampone a basso TE. Esegui i DNA diluiti come descritto nello Passo 6.2.1. (Figura 3A).
5. Preparazione di una libreria di codici a barre spaziali indicizzati
   1. Prepara un totale di 100 μL della miscela PCR con indice del campione come segue: 50 μL di miscela Amp (dal GEM-X Single-Cell 3' Feature Bar Kit, 25 μL di Buffer EB, 20 μL di primer dal Dual Index Plate TT Set A e 1 μL di DNA a codice a barre spaziali purificati (Passo 6.3.4.4) diluiti in 4 μL di buffer EB.
   2. Incubare in un termociclatore (temperatura del coperchio a 105 °C) seguendo il seguente protocollo: un ciclo a 98 °C per 45 secondi; un totale di 7 cicli di 98 °C per 20 s, 54 °C per 30 s, 72 °C per 20 s; 72 °C per 1 minuto; 4 °C per trattenere.
   3. Purificazione del DNA tramite perle paramagnetiche (1,2X) come descritto nel Passo 5.3.5. Aggiungi 35,5 μL di buffer EB al tubo e mescola tramite pipetta. Incubare 2 minuti a temperatura ambiente. Posiziona il tubo sul magnete finché la soluzione non è pulita.
   4. Trasferire 35 μL di DNA purificati e indicizzati della libreria di codici a barre spaziali in un nuovo tubo. Conservare a 4 °C per un massimo di 72 ore o a −20 °C per conservazione a lungo termine.
6. Controlla la distribuzione delle dimensioni del DNA nella libreria di codici a barre spaziali indicizzata. Mescola 1 μL di DNA della biblioteca purificato con 1 μL di tampone a basso TE. Eseguire i DNA diluiti tramite Analizzatore di Frammenti come descritto nel Passaggio 6.2.1 (Figura 3A).

Figura 3: Valutazioni di controllo qualità delle biblioteche indicizzate. (A) Profili di dimensione in DNA amplificati e librerie indicizzate. Il DNA viene analizzato da un Analizzatore di Frammenti per valutare la qualità e la distribuzione delle dimensioni del DNA. Sono mostrati profili rappresentativi per la libreria indicizzata CUT&Tag, il DNA amplificato utilizzato per la preparazione dell'espressione genica e della libreria di codici a barre spaziali, la libreria di espressione genica indicizzata e la libreria di codici a barre spaziali indicizzata. (B) La libreria CUT&Tag viene analizzata tramite qPCR per valutare l'arricchimento di una regione genomica positiva a H3K27ac (ovvero ACTB) rispetto al segnale di fondo negativo per H3K27ac (cioè T1 e un locus intergenico). La differenza di pieghe tra regioni positiva/negativa si calcola come^{arricchimento 21}. Un arricchimento di pieghe superiore a 10 è considerato ideale in questo saggio²⁰. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

7. Sequenziamento delle librerie

1. Sequenziare la libreria di codici a barre spaziali Trekker a una profondità di 5.000 coppie di lettura per ogni nucleo catturato.
2. Sequenziare la libreria CUT&Tag H3K27ac a una profondità di 25.000 coppie di lettura per nucleo catturato.
3. Sequenziare la libreria di espressione genica a una profondità di almeno 20.000 coppie di lettura per ogni nucleo catturato.

8. Bioinformatica e analisi dei dati

1. Processa l'espressione genica e le letture CUT&Tag usando Cell Ranger ARC v2.0.2 con --min-atac-count=100 e --min-gex-count=1000. Integrare gli output ARC di Cell Ranger con le informazioni sui codici a barre di Trekker utilizzando la pipeline Trekker v1.3.0 con parametri predefiniti per assegnare le posizioni spaziali.
2. Esegui il controllo qualità tramite Signac. Le celle che soddisfano uno qualsiasi dei seguenti criteri sono state rimosse dall'analisi a valle: per CUT&Tag, conteggio totale dei frammenti ≥ 1.000.000 o ≤ 100, e arricchimento TSS ≤ 2; per l'espressione genica, il conteggio totale dell'UMI ≥ 100.000 o ≤ 1.000, e il numero totale di geni rilevati ≥ 10.284 o ≤ 200.
3. Rimuovere i doppietti usando scDblFinder per l'espressione genica e AMULET per CUT&Tag. Le cellule che soddisfacevano uno qualsiasi dei seguenti criteri erano classificate come doppietti: (1) punteggio scDblFinder ≥ 0,6; (2) punteggio scDblFinder ≥ 0,3 e AMULET ≤ 0,01; e (3) in ammassi con un'alta percentuale di doppietti.
4. Normalizzare i dati di espressione genica utilizzando dati LogNormalize e CUT&Tag usando TF-IDF. Calcolare gli embeddings RNA PCA e CUT&Tag LSI, utilizzando le dimensioni LSI 2–50 per la modalità della cromatina. Costruisci un grafo del vicino più prossimo pesato usando FindMultiModalNeighbors e genera embedding UMAP basati sul grafo multimodale dei vicini.
5. Annota i dati post-QC Trekker utilizzando il trasferimento di etichette Seurat basato su FindTransferAnchors e una strategia di mappatura di proiezione PCA con parametri predefiniti. I dati scRNA-seq dell'ABC Atlas (versione 20230630) venivano utilizzati come riferimento. Le previsioni di tipo cellulare incompatibili con l'anatomia tissutale nota sono state rimosse durante la cura manuale.
   NOTA: Gli script per l'analisi bioinformatica sono disponibili su GitHub: https://github.com/Liuy12/Mouse_Brain_Trekker_Multiome_Cuttag

Results

Utilizzando una sezione coronale (spessore 25 μm, copertura di circa il 70% di una piastrella spaziale di 10 × 10 mm) di tessuto cerebrale di topo fresco congelato, il flusso di lavoro descritto qui ha prodotto costantemente 50.100 nuclei di alta qualità (SD = 12.200, n = 8), sufficienti per la profilazione multiomica a singola cellula a valle (Figura 1). Seguendo il codice a barre spaziale Trekker della sezione tissutale, i nuclei sono stati isolati tramite dissociazione tissutale delicata e ulteriormente purificati con il kit di isolamento a nucleo singolo Invent. Questa procedura ha portato a detriti minimi e a bassi livelli di aggregazione nucleare, producendo preparazioni di nuclei adatte per saggi a singola cellula. Immagini rappresentative dei nuclei isolati sono mostrate nella Figura 2.

Per saghi a singolo nucleo a valle, inclusi il profiling multioma CUT&Tag (CUT&Tag + espressione genica), circa 50.000 nuclei venivano tipicamente processati qui. Per massimizzare il recupero nucleare, è stato implementato un protocollo semplificato e semplificato a basso input CUT&Tag, utilizzando il targeting diretto anticorpi–pA/Tn5 e la tagmentazione, minimizzando così i tempi di incubazione e i wash step¹⁹. Con questo approccio, sono stati recuperati circa 25.000 nuclei etichettati, corrispondenti a una resa media del 48,3% (SD = 6,1, n = 3). Questi nuclei furono successivamente utilizzati per il barcoding a singola cellula con le 10x Genomics Chromium Multiome per le perle di gel. Per la generazione di GEM, sono stati presi di mira circa 15.000 nuclei con l'aspettativa di recuperare ~10.000 nuclei indicizzati spazialmente dopo il filtraggio di qualità. Sulla base della decodifica a barre spaziale Trekker, l'81,3% dei nuclei (SD = 9, n = 3) del dataset a singola cella poteva essere assegnato con sicurezza a posizioni spaziali all'interno della piastrella.

Il flusso di lavoro multioma spaziale Trekker–CUT&Tag genera tre librerie indicizzate: CUT&Tag, librerie di espressione genica e librerie di codici a barre spaziali. Il DNA preamplificato con codice a barre è stato suddiviso in due frazioni, ciascuna utilizzata per la preparazione della biblioteca secondo la chimica di cattura dei bersagli sulle sfere di gel. Le librerie CUT&Tag sono state amplificate direttamente da DNA preamplificato e hanno mostrato distribuzioni di dimensione dei frammenti caratteristiche della taglatura CUT&Tag corrispondenti al DNA privo di nucleosomi e nucleosomici (Figura 3A). La libreria ha mostrato un buon arricchimento del locus Actb positivo per H3K27ac rispetto ai loci genomici negativi per H3K27ac^20,21 (ovvero una differenza di 68 volte, superando il cutoff di 10 volte precedentemente stabilito per l'analisi di immunoprecipitazione e sequenziamento della cromatina di H3K27ac²⁰) (Figura 3B). Per l'espressione genica e le librerie di codici a barre spaziali, il DNA preamplificato è stato inizialmente amplificato seguendo il protocollo di amplificazione del cDNA 10x Genomics e poi separato in due frazioni in base alla dimensione del frammento tramite purificazione con perle paramagnetiche. La libreria di codici a barre spaziali indicizzata è stata preparata dalla frazione arricchita per frammenti più brevi e ha mostrato un picco netto alla dimensione attesa del frammento. Le librerie di espressione genica hanno mostrato una distribuzione caratteristica delle dimensioni centrata su frammenti di cDNA amplificati (Figura 3A).

Figura 4: Rappresentazione a singola cellula e spaziale del saggio spaziale Trekker–CUT&Tag multioma nel tessuto cerebrale del topo. (A) Identificazione dei tipi cellulari tramite analisi a singola cellula. I grafici uniform manifold approximation and projection (UMAP) mostrano popolazioni cellulari annotate derivate da H3K27ac CUT&Tag, solo dall'espressione genica e dal dataset integrato multiome (CUT&Tag + espressione genica). (B) Rappresentazione spaziale dei dati spaziali del multioma Trekker–CUT&Tag. I nuclei del dataset integrato multioma vengono assegnati a coordinate spaziali tramite codici a barre Trekker, rivelando distribuzioni anatomicamente organizzate dei tipi cellulari nella sezione del tessuto cerebrale del topo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il sequenziamento e la mappatura delle librerie CUT&Tag e di espressione genica sono stati eseguiti utilizzando Cell Ranger ARC v2.0.2 seguendo 10 linee guida genomics, mentre le librerie di codici a barre spaziali sono state processate utilizzando Trekker v1.3.0 secondo le raccomandazioni di Takara Trekker. Le opzioni di mappatura ATAC-seq a cella singola suggerite furono applicate alle librerie CUT&Tag. Sono stati generati dataset a nucleo singolo per CUT&Tag, solo per l'espressione genica e per il multioma combinato (CUT&Tag + espressione genica). Le cellule con UMI totali per CUT&Tag (≥ 1.000.000 o ≤ 100) o espressione genica (≥ 100.000 o ≤ 1000) sono state filtrate utilizzando Signac²². La previsione del doppio è stata effettuata utilizzando una combinazione di scDblFinder²³ per l'espressione genica e AMULET²⁴ per CUT&Tag. Le celle che soddisfano uno dei seguenti criteri sono state rimosse: 1) scDblFinder.score > 0,6; 2) scDblFinder.score tra 0,3 e 0,6, e amulet.score < 0,01. L'annotazione dei tipi cellulari è stata eseguita utilizzando FindTransferAnchors²⁵ di Seurat, basandosi sui dati di riferimento²⁶ dell'Allen Brain Cell Atlas. Per la libreria di espressione genica in questo studio, il conteggio mediano di UMI per cellula era di 15.378, e il numero mediano di geni per cellula era di 4.378. Per la libreria CUT&Tag, sono state rilevate 11.860 celle, con una mediana di 6.631 frammenti di alta qualità per cella e un punteggio di arricchimento TSS di 7,66. Per la libreria di codici a barre spaziali Trekker, al 92,43% dei nuclei sono state assegnate posizioni spaziali e al 51,54% è stato assegnato a un'unica posizione spaziale. I dati grezzi di sequenziamento e i dati processati dalle analisi secondarie sono disponibili tramite GEO con il numero di accesso GSE327406. L'ultimo oggetto Seurat annotato post-QC è disponibile su Zenodo con il numero di accessione 19475899. Gli embedding rappresentativi UMAP con annotazioni di tipo di cellula sono mostrati nella Figura 4A. Collegando codici a barre di singola cellula con codici a barre spaziali, i singoli nuclei sono stati assegnati alle loro posizioni spaziali all'interno del tessuto per generare una mappa spaziale (Figura 4B). Questa mappa corrisponde strettamente alle caratteristiche anatomiche osservate nelle sezioni adiacenti e si allinea con una sezione cerebrale coronale nell'Allen Brain^{Atlas 27}, un riferimento standard per l'anatomia cerebrale dei topini. L'analisi congiunta dell'espressione genica spaziale e dei profili H3K27ac a risoluzione unicellulare ha permesso l'identificazione dei principali tipi di cellule cerebrali e ha rivelato modelli anatomicamente organizzati della distribuzione cellulare nella sezione tissutale.

Discussion

Questo protocollo descrive un flusso di lavoro multioma spaziale Trekker–CUT&Tag che integra il codice a barre spaziali, il profiling CUT&Tag a basso input di H3K27ac, la cattura simultanea di più bersagli molecolari sulle 10x sfere multiome monocellulari Genomics e la preparazione a valle delle librerie per il sequenziamento Illumina. Accoppiando l'indicizzazione spaziale con le letture epigenomiche e trastrascrittomiche di singola cellula, questo approccio affronta una limitazione fondamentale dei saggi multioma convenzionali a singola cellula, che mancano di contesto tissutale nativo. Questo studio dimostra con successo la fattibilità del profiling multioma spaziale CUT&Tag (H3K27ac CUT&Tag + espressione genica) e stabilisce le basi per la co-profilazione spaziale di bersagli di espressione genica e regolatori come i segni degli istoni e le proteine associate alla cromatina.

Un rigoroso controllo qualità in molteplici fasi del flusso di lavoro è essenziale per l'implementazione di successo di questo flusso di lavoro (Figura 1). Sebbene la procedura descritta qui inizi con i passaggi post-sezionamento, la qualità stessa della sezione tissutale è fondamentale per ottenere risultati ottimali. Lo spessore della sezione deve essere regolato in base al tipo di tessuto e alla cellularità attesa. Durante la dissociazione tissutale e l'isolamento dei nuclei, massimizzare la resa dei nuclei preservando l'integrità nucleare è fondamentale per le prestazioni complessive degli saggi multioma a singola cellula basati su Trekker. Una bassa resa dei nuclei può derivare da dissociazione tissutale subottimale, isolamento inefficiente dei nuclei o spessore di sezione insufficiente. La scarsa integrità nucleare può derivare da eccessivi disturbi meccanici, tempi di elaborazione prolungati o iperlisi. L'isolamento dei nuclei rappresenta un punto chiave di risoluzione dei problemi per l'implementazione con successo del flusso di lavoro multioma a singola cella basato su Trekker. Pertanto, è fortemente raccomandata l'ottimizzazione specifica per tessuto del protocollo di isolamento dei nuclei prima di avviare il saggio multioma a singola cellula basato su Trekker. I nuclei isolati devono essere valutati quantitativamente e qualitativamente. Il conteggio dei nuclei utilizzando coloranti nucleari fornisce una stima della ressa, mentre l'esame microscopico consente di valutare l'integrità della membrana nucleare, l'aggregazione e la presenza di detriti non nucleari. Dopo la preparazione della biblioteca, tutte le librerie dovrebbero essere valutate per la distribuzione della dimensione dei frammenti e l'assenza di dimeri adattatori. Per le librerie CUT&Tag, l'arricchimento delle regioni genomiche target sul fondo dovrebbe essere valutato tramite PCR quantitativa, fornendo un'indicazione precoce della specificità del saggio e della qualità complessiva della libreria prima del sequenziamento. Il controllo qualità post-sequenziamento è altrettanto importante per un'interpretazione accurata dei dati multioma spaziali. Metriche come tassi di mappatura, conteggio dei frammenti per nucleo, arricchimento del sito di inizio della trascrizione, punteggi di frammento nel picco per CUT&Tag, complessità genica e profondità di lettura per cellula dovrebbero essere valutate seguendo le linee guida raccomandate da 10x Genomics e Takara Trekker. La valutazione congiunta di queste metriche sia tra le modalità epigenomiche che trascritomiche consente l'identificazione di artefatti tecnici e garantisce un'integrazione affidabile delle informazioni spaziali, epigenomiche e trascrizionali.

Sebbene in questo studio venga dimostrata la fattibilità dell'approccio a codice a barre basato su Trekker combinato con un saggio multioma CUT&Tag a singola cella, anche l'approccio descritto presenta delle limitazioni. Ad esempio, il metodo è attualmente limitato a tessuti freschi congelati, e la sua fattibilità è stata dimostrata solo per la profilazione di una singola modifica degli istoni (H3K27ac) in un singolo tipo di tessuto (cervello del topo) senza repliche biologiche. Inoltre, l'approccio si basa su due piattaforme commerciali proprietarie (Takara Trekker e 10x Genomics Next GEM Chromium Single Cell Multiome). Saranno necessarie ulteriori valutazioni su diversi tipi di tessuto e segni epigenetici aggiuntivi per valutare l'applicabilità, le prestazioni, la generalizzabilità e la riproducibilità più ampia di questa tecnologia.

In sintesi, il protocollo multioma spaziale Trekker–CUT&Tag presentato qui dimostra la capacità di co-profiling a singola cellula risolta spazialmente di caratteristiche epigenomiche e trascridentiche. Combinando il codice a barre spaziale con la chimica multioma a singola cellula consolidata, consente un'indagine meccanicistica della regolazione genica all'interno dell'architettura tissutale intatta e offre una piattaforma potente per future applicazioni di biologia spaziale. Utilizzi potenziali più rilevanti includono la valutazione dell'impatto di vari stimoli sperimentali e ambientali sul controllo epigenetico dell'espressione genica in specifici tipi cellulari—ad esempio, gli effetti delle stimolazioni nervose potrebbero essere analizzati in tipi specifici di neuroni nei sistemi nervosi centrali e periferici, oppure l'impatto sulle cellule vicine delle cellule immunitarie pro- e antinfiammatorie infiltranti potrebbe essere rivelato in malattie infiammatorie e tumori.