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Articolo di ricerca
Questo studio integra farmacologia di rete ed esperimenti in vivo per indagare i potenziali effetti della pillola di Yougui nel trattamento della prostatite. L'analisi della farmacologia di rete e il trattamento con YGP in un modello di prostatite nel ratto hanno suggerito che gli effetti terapeutici della YGP potrebbero essere associati alla regolazione delle risposte infiammatorie, indicando che la YGP esercita effetti antinfiammatori nella prostatite.
La prostatite è un disturbo urologico comune con opzioni di trattamento limitate. La pillola Yougui (YGP) ha dimostrato potenziale valore terapeutico, in particolare nelle condizioni legate all'infiammazione. Questo studio mirava a valutarne gli effetti ed esplorare i possibili meccanismi sottostanti. I componenti attivi dello YGP sono stati selezionati da TCMSP utilizzando i criteri di biodisponibilità orale (OB ≥ 30%) e di somiglianza farmacologica (DL ≥ 0,18), e sono stati raccolti i target corrispondenti. Bersagli correlati alla prostatite sono stati ottenuti da GeneCards, e bersagli sovrapposti sono stati analizzati utilizzando reti di interazione proteina-proteina (PPI) e l'arricchimento dell'enciclopedia di geni e genomi di Kyoto (KEGG). Sono stati identificati in totale 126 composti attivi e 208 potenziali bersagli, con 180 bersagli sovrapposti associati alla prostatite. L'analisi PPI ha identificato TP53, IL6, AKT1, TNF e IL1B come geni hub chiave. L'arricchimento KEGG ha suggerito il coinvolgimento di vie correlate all'infiammazione, inclusi i percorsi di segnalazione IL-17, TNF, MACK e PI3K-Akt. Un modello ratto di prostatite è stato stabilito tramite iniezione intraprostatica di carragenina. Sono stati eseguiti esame istologico e misurazione del fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α) e interleucina-6 (IL-6) per valutare gli effetti terapeutici. Il trattamento YGP ha migliorato l'istopatologia prostatica e ridotto i livelli di TNF-α e IL-6 sia a livello di proteina che di mRNA. Questi risultati suggeriscono che la YGP esercita effetti antinfiammatori nella prostatite, mentre i meccanismi molecolari specifici restano da approfondire.
La prostatite è una condizione in cui la ghiandola prostatica si infiamma con gonfiore eirritazione 1. Rappresenta circa il 25% degli incontri clinici urologici globali2. I National Institutes of Health (NIH) hanno stratificato la prostatite in quattro classificazioni: batterica acuta, batterica cronica, prostatite cronica/sindrome da dolore pelvico cronico (CP/CPPS) e prostatiteasintomatica 3. Tra queste, CP/CPPS è la forma più diffusa ed è strettamente associata a infiammazione persistente e disregolazione immunitaria. Nonostante i progressi nella comprensione della natura infiammatoria della prostatite, le strategie terapeutiche attuali restano limitate, in particolare per i sottotipi nonbatterici 4,5. Gli antibiotici sono comunemente utilizzati nella pratica clinica; tuttavia, la loro efficacia nella prostatite non batterica è altamentecontroversa 6. Altri trattamenti, che vanno dai α-bloccanti ai farmaci antinfiammatori non steroidei (FANS), mirano principalmente al sollievo dei sintomi ma spesso mostrano risultati subottimali, con rischi non trascurabili di disturbi gastrointestinali, ipotensione ortostatica ecosì via 7,8,9,10. Queste limitazioni evidenziano la necessità di approcci terapeutici alternativi che possano modulare efficacemente l'infiammazione nella prostatite.
La medicina tradizionale cinese (MTC) può offrire una gamma più ampia di benefici terapeutici con un profilo di sicurezza e tollerabilità piùfavorevole 11. La pillola Yougui (YGP), una formula classica documentata nel Jingyue Quanshu, è stata usata empiricamente per secoli per reintegrare il yang renale e alleviare disturbicorrelati 12. Studi precedenti hanno riportato che alcuni dei suoi componenti possiedono attivitàantinfiammatorie 13,14,15,16. Le evidenze cliniche suggeriscono che la YGP possa alleviare efficacemente i sintomi della prostatite, anche se il meccanismo sottostante rimane pocochiaro 17. La farmacologia di rete rappresenta un approccio potente e integrativo che combina biologia dei sistemi e farmacologia per scoprire i complessi meccanismi della medicinatradizionale 18. È stato ipotizzato che la YGP potesse esercitare effetti antinfiammatori modulando molteplici bersagli e vie correlate all'infiammazione. Queste previsioni sono state ulteriormente valutate utilizzando un modello di prostatite in vivo, in cui la prostatite è stata indotta tramite iniezione di carragenina. Dopo l'istituzione del modello, gli animali sono stati trattati con YGP. I tessuti prostatici sono stati raccolti per l'esame istopatologico tramite colorazione di ematossilina ed eosina (HE), nonché per la valutazione quantitativa dei marcatori infiammatori tramite il saggio immunosorbente legato agli enzimi (ELISA) e la reazione a catena della polimerasi in tempo reale quantitativa (qRT-PCR).
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Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato per la Cura e l'Uso Istituzionale degli Animali dell'Università di Medicina Cinese di Pechino (BUCM-2024110107-4103).
Raccolta di costituenti attivi e bersagli
YGP è composto da Rehmannia glutinosa, Aconitum carmichaelii, Cinnamomum cassia, Dioscorea opposita, Cornus officinalis, Cuscuta chinensis, Angelica sinensis, Eucommia ulmoides, Cervi Cornus Colla e Lycium barbarum. Questi nomi di erbe sono stati inseriti nel database e nella piattaforma di analisi dei sistemi di farmacologia tradizionale cinese (TCMSP) per recuperare i loro composti. I composti attivi sono stati selezionati utilizzando i criteri di biodisponibilità orale (OB ≥ 30%) e di somiglianza farmacologica (DL ≥ 0,18) 19,20,21. I bersagli corrispondenti di ciascun composto sono stati ottenuti da TCMSP e standardizzati in simboli genici utilizzando il database UniProt. I target correlati alla prostatite sono stati recuperati dal database GeneCards utilizzando "prostatite" come parola chiave, e sono stati selezionati geni con un punteggio di rilevanza superiore alla media per l'inclusione nello studio.
Costruzione della rete regolatoria della YGP contro la prostatite
L'intersezione tra bersagli legati alla YGP e quelli legati alla prostatite è stata identificata e definita come un insieme di potenziali bersagli terapeutici. Questi target sono stati importati in Cytoscape (versione 3.9.1) per costruire una rete composto-bersaglio-malattia. L'analisi topologica della rete è stata effettuata utilizzando il plugin CytoHubba e i componenti chiave sono stati identificati in base ai valori di centralità massima della clique (MCC) 22.
Analisi della rete di interazione proteina-proteina (PPI)
I bersagli sovrapposti venivano importati nel database STRING (versione 11.5), con l'organismo impostato su Homo sapiens. Il punteggio minimo richiesto per l'interazione era impostato a ≥ 0,7, e i nodi disconnessi eranonascosti 23. I dati di interazione sono stati esportati in formato TSV e visualizzati in Cytoscape. I geni hub sono stati ulteriormente identificati utilizzando il plugin CytoHubba in base alla centralità dei gradi.
Analisi dell'arricchimento del percorso KEGG e GO
I target condivisi sono stati caricati sulla piattaforma Metascape per l'analisi dei percorsi dell'enciclopedia di geni e genomi di Kyoto (KEGG). Le specie di input e analisi sono state impostate su Homo sapiens. È stata condotta un'analisi di arricchimento delle vie KEGG. I percorsi sono stati ulteriormente filtrati in base alla loro rilevanza per la prostatite, come determinato dalla letteratura pubblicata e dalle annotazioni del database. I percorsi rimanenti sono stati classificati in base ai loro valori Log P. I percorsi KEGG arricchiti in alto sono stati visualizzati utilizzando grafici a bolle.
Aggancio molecolare
I target chiave sono stati selezionati dalla rete PPI in base alla centralità del grado, e i composti attivi sono stati identificati dalla rete regolatoria YGP-prostatite sulla base dei valori MCC per analisi successive di attracco. Le strutture proteiche sono state ottenute dall'AlphaFold Protein Structure Database in formato PDB, e le strutture dei liganti sono state scaricate da TCMSP nel formatomol2 24. L'aggancio molecolare è stato eseguito utilizzando la piattaforma online25 di CB-Dock2. Prima dell'aggancio, le strutture proteiche venivano automaticamente preprocessate rimuovendo molecole d'acqua, aggiungendo atomi di idrogeno e completando i residui mancanti. Le affinità di binding venivano registrate e le heatmap venivano generate utilizzando GraphPad Prism (versione 10.1.2). Le strutture tridimensionali dei complessi ligando-proteina con i punteggi Vina più bassi sono state visualizzate utilizzando ChimeraX, e diagrammi di interazione bidimensionale sono stati generati con LigPlus.
Preparazione dell'estratto acquoso YGP
I componenti erboristici della YGP sono stati preparati secondo il rapporto di formulazione tradizionale, inclusi 24 g della radice lavorata di Rehmannia glutinosa (Shudihuang), 6 g della radice laterale lavorata di Aconitum carmichaelii (Fuzi), 6 g della corteccia di Cinnamomum cassia (Rougui), 12 g del rizoma di Dioscorea opposto (Shanyao), 9 g del frutto di Cornus officinalis (Shanzhuyu), 12 g del seme di Cuscuta chinensis (Tusizi), 12 g della gelatina di corna lavorata di Cervi Cornus Colla (Lujiaojiao), 12 g del frutto di Lycium barbarum (Gouqi), 9 g della radice di Angelica sinensis (Danggui) e 12 g della corteccia di Eucommia ulmoides (Duzhong). Tutte le erbe eccetto Aconitum carmichaelii e Cervi Cornus Colla sono state immerse in 6 volte il loro peso totale di acqua distillata per 30 minuti, mentre Aconitum carmichaelii è stata immersa separatamente in 6 volte il suo peso di acqua distillata. Aconitum carmichaelii è stato decotato prima con un dispositivo di riscaldamento elettrico per 1 ora, dopo di che le erbe rimanenti, escluso Cervi Cornus Colla, sono state aggiunte e decoctate due volte per 1 ora per ogni ciclo. Cervi Cornus Colla veniva successivamente fuso in un bagno d'acqua a 60–70 °C fino a discioltosi completamente e incorporato nell'estratto. Dopo il raffreddamento, il decocto veniva filtrato attraverso una garza a doppio strato, allicitato, congelato a -20 °C per 48 ore e liofilizzato per ottenere un estratto in polvere.
Modello animale e progettazione sperimentale
I maschi di ratti Sprague-Dawley (8 settimane, 200–220 g) sono stati alloggiati in condizioni specifiche prive di patogeni, con un ciclo di 12 ore luce/buio e libero accesso a cibo e acqua. Dopo 1 settimana di acclimatazione, i ratti sono stati divisi casualmente in tre gruppi (n = 6 per gruppo): gruppi controllo, gruppo modello e gruppo YGP. La prostatite cronica è stata indotta tramite iniezione intraprostatica di soluzione26 di carrageninana al 3%. Per un breve periodo, i ratti sono stati anestetizzati con isoflurano (3–4% per l'induzione e 1,5–2% per il mantenimento), e è stata praticata un'incisione addominale mediana per esporre la prostata. Un totale di 25 μL di soluzione di carragenina al 3% è stato iniettato in ciascun lobo ventrale della prostata. Il gruppo di controllo ha ricevuto un'iniezione intraprostatica solo di soluzione fisiologica fisiologica soluta. La penicillina postoperatoria (2,5 × 105 U/kg) è stata somministrata intramuscolare per 3 giorni.
La polvere estratto liofilizzato YGP è stata preparata dal decoction e ricostituita allo 0,9% di soluzione salina normale sterile per ottenere una sospensione uniforme per la gavage orale (10,54 g/kg/giorno). I ratti del gruppo YGP hanno ricevuto la somministrazione orale di estratto YGP (10 mL/kg), mentre i gruppi di controllo e modello hanno ricevuto un volume equivalente dello 0,9% di soluzione salina normale sterile. Dopo 4 settimane, i ratti sono stati anestetizzati con pentobarbital sodio (50 mg/kg, iniezione intraperitoneale) e i tessuti prostatici sono stati prelevati dopo essere stati sacrificati secondo le linee guida etiche.
Esame istopatologico
I tessuti prostatici sono stati fissati con paraformaldeide al 4% per 24 ore, disidratati tramite etanolo graduato (75% alcol per 4 ore, 85% alcol per 2 ore, 90% alcol per 2 ore, 95% per 1 ora, etanolo assoluto per 1 ora), eliminati nello xilene e incorporati in paraffina. Le sezioni (4–5 μm) sono state poi sottoposte a colorazione con HE secondo le procedurestandard 27. Per un breve periodo, le sezioni sono state deparaffinizzate, reidratate, colorate con ematossilina, differenziate e controcolorate con eosina. Dopo la disidratazione e il montaggio, le sezioni sono state osservate al microscopio luminoso per una valutazione istopatologica.
L'infiammazione istopatologica è stata valutata utilizzando un sistema di punteggio semi-quantitativo basato sull'infiltrazione delle cellule infiammatorie, la proliferazione dei fibroblasti, la morfologia acinar e lo stato della secrezione. L'infiltrazione infiammatoria delle cellule è stata valutata come 0 (nessuna infiltrazione), 2 (infiltrazione lieve), 4 (infiltrazione moderata) e 6 (infiltrazione grave). La proliferazione dei fibroblasti è stata classificata come 0 (assente), 1 (lieve), 2 (moderata) e 3 (grave). La morfologia acinar è stata valutata come 0 (lumen acinar grande), 1 (dimensione del lumen moderatamente ridotta), 2 (dimensione del lumen marcatamente ridotta) e 3 (occlusione o scomparsa acinare). Lo stato della secrezione è stato valutato come 0 (secrezione abbondante), 1 (secrezione moderata), 2 (secrezione scarsa) e 3 (secrezione assente). Il punteggio istopatologico totale è stato calcolato come la somma di tutti e quattro i parametri, con punteggi più alti che indicano una lesione del tessuto prostatico più gravee infiammazione 28.
ELISA
I tessuti prostatici (100 mg) sono stati risciacquati con soluzione salina fosfatata (PBS) fredda come ghiaccio e omogeneizzati in tampone di lisi integrato con inibitori della proteasi. Gli omogeneati sono stati incubati a 4 °C per 30–120 minuti e centrifugati a 5000 × g per 15 minuti a 4 °C per raccogliere i soprannatanti. I livelli proteici di TNF-α e IL-6 sono stati misurati utilizzando kit ELISA secondo le istruzioni del produttore. Standard e campioni sono stati aggiunti a piastre a 96 pozzi e incubati a 37 °C, seguiti da un'incubazione sequenziale con anticorpi biotinilati e coniugati enzimatici. Dopo il lavaggio, veniva aggiunta la soluzione di substrato per lo sviluppo del colore e la reazione veniva terminata con la soluzione di stop. L'assorbanza è stata misurata a 450 nm utilizzando un lettore di microplacche. Le concentrazioni di citochine sono state calcolate sulla base di curve standard.
qRT-PCR
L'RNA totale è stato estratto dai tessuti prostatici utilizzando un metodo a colonna e quantificato misurando l'assorbanza a 260 e 280 nm per valutarne la purezza. I campioni di RNA sono stati trascritti inversamente in cDNA a 42 °C per 15 minuti utilizzando un kit di trascrizione inversa. qRT-PCR è stata eseguita utilizzando un termociclatore nelle seguenti condizioni: denaturazione iniziale a 95 °C per 3 minuti, seguita da 40 cicli a 95 °C per 10 secondi e 60 °C per 30 secondi. Le sequenze di primer utilizzate in questo studio sono elencate nella Tabella Supplementare 1. I segnali di fluorescenza sono stati raccolti durante la fase di ricottura/estensione. I livelli di espressione di TNF-α e IL-6 sono stati normalizzati al gene di riferimento interno GAPDH. L'espressione genica relativa è stata calcolata utilizzando il metodo 2−ΔΔCt .
Analisi statistica
Tutti i dati sono presentati come media ± deviazione standard (SD). Le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando il software GraphPad Prism (versione 10.1.2). La distribuzione dei dati è stata valutata per la normalità prima dell'analisi. Le differenze tra più gruppi sono state analizzate utilizzando l'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA), seguita dal test post hoc di Tukey per confronti multipli. Un valore di p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
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Identificazione di componenti bioattivi e geni bersaglio
Sono stati identificati in totale 126 componenti bioattivi nello YGP che soddisfano i criteri (OB ≥ 30% e DL ≥ 0,18). corrispondenti a 208 geni target previsti. Il database GeneCards ha fornito 9.845 geni associati alla prostatite. L'analisi di Venn ha rivelato 180 geni sovrapposti tra i bersagli previsti della YGP e quelli correlati alla prostatite, suggerendo che questi bersagli condivisi possano mediare gli e...
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La prostatite è patologicamente definita da una maggiore presenza di cellule infiammatorie all'interno del parenchima prostatico omesenchima 28,29. In uno studio condotto su oltre 5 milioni di uomini coreani per nove anni, Kim et al. hanno confermato tramite analisi multivariate che la prostatite aumenta significativamente il rischio di sviluppare il cancro alla prostata30. Tuttavia, la gestione clinica at...
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Gli autori riportano che non ci sono conflitti di interesse in quest'opera.
Gli autori ringrazionano con gratitudine il sostegno finanziario dei Fondi di Ricerca Fondamentale per le Università Centrali (2022-JYB-JBZR-037).
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 4% paraformaldeide | Beyotime | P0099-3L | |
| Database della struttura delle proteine AlphaFold | Database della struttura delle proteine AlphaFold | https://alphafold.ebi.ac.uk/ | |
| BeyoFast SYBR Mix verde qPCR (2X) | Beyotime | D7260 | |
| Piattaforma online di bioinformatica | Piattaforma online di bioinformatica | http://www.bioinformatics.com.cn/ | |
| Carrageenan | OriLeaf | S30559 | |
| CB-DOCK2 | CB-DOCK2 | http://183.56.231.194:8001/cb-dock2/php/blinddock.php | |
| Cytoscape | Cytoscape | https://cytoscape.org/ | |
| GeneCards | GeneCards | https://www.genecards.org/ | |
| Ematossilina ed eosina (H&; E) Kit per la Tintura | Beyotime | C0105S | |
| Metascape | Metascape | https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1 | |
| Balsamo Neutrale | Servicebio | WG10004160 | |
| Cera di paraffina (per l'incastonamento) | Servicebio | RP-15 | |
| Cocktail di inibitori di proteasi (100X) | Epizima | GRF101 | |
| Kit IL-6 ELISA per ratti | Beyotime | PI328 | |
| Ratto TNF-α Equipaggiamento | Pechino 4A Biotech Co., Ltd | CRE0003 | |
| Kit di isolamento di RNA lungo per animali RNAeasy con colonna spin | Beyotime | R0026 | |
| STRING | STRING | https://string-db.org/ | |
| TCMSP | TCMSP | https://www.tcmsp-e.com/#/database | |
| Uniprot | Uniprot | https://www.uniprot.org/ |