Finestra HOTS (Cranio Otticamente Trasparente Montata sulla Testa) per l'imaging transcranico profondo della corteccia del topo

Sommario

Questo protocollo descrive una finestra del cranio otticamente trasparente (HOTS) montata sulla testa, basata su una procedura ottimizzata di pulizia del cranio in due fasi. Questo approccio produce un cranio altamente trasparente, permettendo l'imaging a due fotoni della corteccia cerebrale adulta del topo fino a profondità fino a ~800 μm.

Abstract

L'imaging ad alta risoluzione a due fotoni della corteccia cerebrale adulta del topo è fortemente limitato dalla diffusione della luce proveniente dal cranio, che attenua i segnali e limita la profondità di imaging in vivo. Sebbene siano stati sviluppati metodi di pulizia del cranio per fornire accesso ottico alla corteccia attraverso il cranio intatto, le loro prestazioni pratiche sono limitate dal tempo di pulizia limitato e da cocktail di pulizia subottimale. Qui presentiamo un protocollo dettagliato per implementare una finestra a cranio otticamente trasparente (HOTS) montata sulla testa. In questo approccio, veniva utilizzato un berretto montato sulla testa per mantenere soluzioni di pulizia sul cranio, evitando così anestesia prolungata o contenzione fisica e permettendo una pulizia prolungata del cranio (diverse ore) nei topi svegli e che si comportavano liberamente. Inoltre, è stata eseguita una procedura di clearing in due fasi utilizzando reagenti (HOTS-S1: 10% in peso/v EDTA, 15% in peso/v D-mannosio, 10% in peso/v solfolano, 0,5% in peso/v Tween 20; HOTS-S2: 70% in peso/v D-mannosio, 5% in peso/v solfolano, 0,5% in peso/v Tween 20) ottimizzato tramite screening chimico sistematico. Forniamo un protocollo passo dopo passo che include l'esposizione e la stabilizzazione del cranio, la creazione e il montaggio del cappuccio montato sulla testa, la somministrazione e il rinfresco dei reagenti di pulizia e la successiva preparazione per l'imaging. Nei topi di 6 settimane (~20 g), il protocollo HOTS produce regolarmente un cranio altamente trasparente che supporta l'imaging a due fotoni delle strutture corticali fino a profondità fino a ~800 μm sotto il pia, avvicinandosi alle prestazioni delle finestre a cranio aperto. La finestra HOTS consente l'imaging strutturale nei topi Thy1-GFP-M e l'imaging funzionale del calcio nei topi Thy1-GCaMP6. Crediamo che, come approccio comodo e minimamente invasivo, la finestra HOTS faciliterà significativamente l'imaging transcranico profondo e le manipolazioni optogenetiche, fotofarmacologiche e altre basate sulla luce in vivo.

Introduzione

Il monitoraggio intravitale dei neuroni corticali è essenziale per comprendere la struttura e la funzione^{cerebrale 1}. La microscopia a due fotoni (TPM) è uno strumento chiave per studi in vivo^{di questo tipo 2,3}. Tuttavia, la qualità e la profondità dell'imaging sono fortemente limitate dalla forte diffusione della luce proveniente dal cranio opaco che sovrasta la^{corteccia 4,5}.

Le finestre a cranio^{aperto 6} e le finestre a cranio assottigliato ^7,8 hanno notevolmente migliorato l'accesso ottico alla corteccia e sono ampiamente utilizzate, ma entrambi gli approcci presentano limitazioni intrinseche. Le finestre aperte del cranio possono indurre gravi lesioni cerebrali e risposte^{infiammatorie 9,10}, mentre il diradamento cranio è tecnicamente impegnativo e difficile da raggiungere con uno spessore uniforme^11,12.

Le tecniche di pulizia ottica del cranio in vivo offrono un'alternativa minimamente invasiva che consente l'imaging a due fotoni a risoluzione assonale nei topi adulti. Tuttavia, la profondità di imaging raggiungibile rimane limitata (tipicamente 150–400 μm sotto il pia⁾12,13,14,15. In pratica, il clearing cranio è solitamente limitato a un breve periodo sotto anestesia con fissazione rigida della testa, e l'ottimizzazione sistematica dei cocktail di clearing per la composizione ossea del cranio è rimasta poco^esplorata 12,13,14,15.

Per superare queste limitazioni, abbiamo precedentemente sviluppato una finestra del cranio otticamente trasparente (HOTS) montata sulla testa che supporta una pulizia prolungata e offline del cranio nei topi che si comportano liberamente (Figura 1A)¹⁶. Questo approccio impiega una procedura di clearing in due fasi utilizzando reagenti (S1 e S2), ottimizzati tramite screening chimico sistematico nel nostro lavoro^{precedente 16}. L'ottimizzazione sistematica dei reagenti di eliminazione e la caratterizzazione dell'efficacia, reversibilità, biosicurezza e performance di imaging in vivo della finestra HOTS sono state riportate nei nostri lavori^{precedenti 16}, che hanno anche dimostrato una risposta astrogliale favorevole dopo il trattamento HOTS. Qui presentiamo un protocollo passo dopo passo per stabilire la finestra HOTS al fine di consentire l'imaging profondo transcranico a due fotoni nei topi adulti. Nelle preparazioni rappresentative, le profondità di imaging raggiungono ~800 μm sotto il pia, quasi corrispondenti a quelle raggiungibili con finestre a cranio aperto. La finestra HOTS consente l'imaging strutturale profondo nei topi Thy1-GFP-M e l'imaging funzionale del calcio nei topi Thy1-GCaMP6 svegli.

Protocollo

Tutte le procedure di cura degli animali e sperimentali sono state approvate dal Comitato Provinciale per la Cura e l'Uso degli Animali del Guangdong e sono state svolte in conformità con le linee guida del Comitato Etico per la Sperimentazione Animale dell'Istituto di Tecnologia Avanzata di Shenzhen, Accademia Cinese delle Scienze. I reagenti e le attrezzature utilizzate in questo protocollo sono elencati nella Tabella dei Materiali.

NOTA: Questo protocollo è ottimizzato per topi di 6 settimane (peso corporeo ~20 g), che hanno uno spessore cranio di circa 100 μm.

1. Preparazione di soluzioni per la pulizia del teschio

1. Preparare la soluzione di pulizia del cranio S1 (10% peso/v EDTA, 15% peso/v D-mannosio, 10% peso/v solfolano, 0,5% wt/v Tween 20; RI: 1,38; pH finale: 7.0-7.4)
   1. Peso 0,35 g di idrossido di sodio (NaOH). Aggiungete 20 mL di acqua deionizzata in un becher e mescolatelo fino a disciolto. Questo aumenta il pH della soluzione, facilitando la successiva dissoluzione dell'EDTA.
      NOTA: NaOH è corrosivo. Indossa l'attrezzatura di protezione personale adeguata (guanti, camice da laboratorio, protezione per gli occhi) e maneggia una cappa chimica.
   2. Aggiungi 4 g di acido etilendediaminatetraacetico (EDTA) alla soluzione di NaOH. Mettere il becher in un bagno d'acqua a 40 °C e mescolare continuamente finché l'EDTA non si dissolve completamente.
   3. Raffredda la miscela a temperatura ambiente. Aggiungi 6 g di D-mannosio, 4 g di solfolano e 0,2 g di Tween 20 alla soluzione. Mescola a temperatura ambiente finché tutti i componenti non sono completamente disciolti.
   4. Aggiungi acqua deionizzata per portare il volume finale a 40 mL. Mescola accuratamente per ottenere S1.
      NOTA: S1 può essere conservato a temperatura ambiente per diversi mesi.
2. Preparare la soluzione di pulizia del cranio S2 (70% peso/v D-mannosio, 5% peso/v solfolano, 0,5% peso /v Tween 20; RI finale: 1,44; pH finale: 7,0-7,4)
   1. Pesa 28 g di D-mannosio, 2 g di solfolane e 0,2 g di Tween 20 e trasferiscili in un becher pulito.
   2. Aggiungere acqua deionizzata a circa 30 mL e mescolare a temperatura ambiente finché tutti i componenti non saranno completamente dissolti.
   3. Aggiungi acqua deionizzata per portare il volume finale a 40 mL e mescola accuratamente per ottenere S2.
      NOTA: Un riscaldamento delicato (25–30 °C) e una mescolare continua accelerano la dissoluzione del D-mannosio. S2 può essere conservato a temperatura ambiente per diversi mesi.

2. Preparazione all'intervento chirurgico

1. Autoclave di tutti gli strumenti chirurgici e sterilizza accuratamente lo spazio di lavoro con alcol al 75%.
2. Anestetizzare il topo con iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodio al 1% (w/v) (150–200 μL per 20 g di peso corporeo).
   NOTA: Altri anestetici reversibili possono essere utilizzati come alternative al pentobarbital sodico.
3. Monitorare la profondità dell'anestesia utilizzando il test del riflesso del pizzicotto del piede e assicurarsi che il topo sia completamente anestetizzato prima di iniziare l'intervento.
4. Metti il mouse in una cornice stereotassica e fissa la testa con delle barre per le orecchie.
5. Mantieni la temperatura corporea a 37 °C usando una borsa riscaldante.
6. Applica unguenti oftalmici su entrambi gli occhi per prevenire la secchezza corneale.
   NOTA: Monitorare attentamente la respirazione e i riflessi per evitare overdose da anestetici e depressioni respiratorie.

3. Chirurgia e montaggio della piastra frontale

1. Esposizione e pulizia del cranio (Figura 1Ba)
   1. Rimuovere il cuoio capelluto su tutta la superficie dorsale del cranio utilizzando pinze sottili e forbici chirurgiche. Taglia la pelle lateralmente per esporre i bordi dei muscoli temporali e posteriormente verso i muscoli del collo.
   2. Rimuovere delicatamente il periosto dalla superficie del cranio usando pinze sottili.
   3. Pulisci la superficie del cranio con un applicatore umido con punta di cotone e asciuga il cranio con un leggero getto d'aria.
   4. Se è necessaria una localizzazione precisa delle aree funzionali della corteccia cerebrale, segnare i punti di riferimento distanziati di 1 mm sulla superficie del cranio utilizzando un apparato stereotattico.
2. Applicazione di cemento dentale e piastra frontale (Figura 1Bb)
   1. Prepara il cemento dentale secondo le istruzioni del produttore. Si raccomandano cementi dentali con forte adesione e buona durata, adatti alla fissazione a lungo termine per garantire un attacco stabile.
   2. Applicare uno strato sottile di cemento dentale sulla superficie esposta del cranio e sui tessuti circostanti per protezione, lasciando la zona designata per la finestra di libera senza rivestimento.
      NOTA: Dopo aver miscelato i componenti in polvere e liquido del cemento dentale in un rapporto di volume 1:1, attendi circa 10 secondi affinché il cemento aderisca alla punta di uno stuzzicadenti prima dell'applicazione. Questo ne riduce la fluidità e migliora la tenuta di strada. Durante l'applicazione, applicare il cemento dalla periferia verso la finestra di radura designata e mantenere l'area della finestra completamente libera dal cemento. La regione liberata è definita dal confine del sigillante dentale (cemento dentale e materiale morbido di rivestimento) sulla superficie del cranio. Pertanto, la sua dimensione può essere regolata, ma è limitata dalle suture craniche o dalla dimensione del cappuccio. Per applicazioni comuni in un emisfero, la regione liberata ha solitamente un diametro di ~3–5 mm.
   3. Fissa una piccola piastra frontale in titanio (da fissare su un supporto personalizzato durante le immagini successive) al cranio usando cemento dentale.
      NOTA: Per la fissazione della testa possono essere utilizzati diversi design di piastre frontali. In questo studio, sono state utilizzate con successo sia piastre frontali commercialmente disponibili sia piastre di titanio personalizzate a due fori. Indipendentemente dal design, la piastra frontale dovrebbe fornire sufficiente stabilità meccanica per le immagini successive e non dovrebbe ostacolare la finestra di liberazione/imaging prevista.

4. Creazione di una finestra HOTS

1. Sigilla il cranio con materiale morbido dentale auto-polimerizzante (Figura 1Bc)
   1. Dopo che il cemento dentale ha completamente polimerizzato per circa 5 minuti, si copre lo strato di cemento, escludendo la zona della finestra di libera, con uno strato sottile di rivestimento dentale morbido autopolimerizzante per formare una sigillatura continua sul cranio.
      NOTA: Il materiale morbido del rivestimento migliora la sigillatura e riduce le perdite durante esposizioni prolungate ai reagenti di ripulimento.
   2. Modella il materiale morbido auto-polimerizzante del rivestimento dentale in modo uniforme attorno al margine previsto della finestra di liberazione, creando una superficie piatta di sigillatura per il cappuccio.
2. Montaggio del cappuccio (Figura 1Bd)
   1. Taglia la testa di una pipetta di plastica usa e getta (polietilene, PE) per creare un piccolo cappuccio cilindrico con la parte superiore chiusa e il fondo aperto. Il PE mostra una buona stabilità chimica e non mostra degradazione o reazione visibile con le soluzioni di purificazione S1 o S2 durante la procedura di clearing.
      NOTA: Il tappo tagliato dalla testa di una lampadina a pipetta di trasferimento da 1 mL è tipicamente di ~12 mm di diametro e ~10–14 mm di altezza.
   2. Posiziona il tappo sopra la zona designata per la finestra di pulizia e premiscilo delicatamente sul materiale morbido del rivestimento.
      NOTA: Il cappuccio è più grande della regione liberata e una parte del cranio sotto il cappuccio che non viene utilizzata per la zona liberata può essere applicata con sigillante dentali per proteggere il cranio dal liberamento.
   3. Fissa il cappuccio in posizione usando materiale di rivestimento morbido aggiuntivo intorno alla base, assicurandoti che la giunzione tra cappuccio e cranio sia completamente sigillata.
   4. Usa una siringa da 1 mL con un ago da 26 G per perforare uno o più piccoli fori nella parete del tappo che fungano da porte per iniettare e prelevare soluzioni di eliminazione.
   5. Lascia che il materiale morbido del rivestimento sia completamente indurito. Verifica che il cappuccio sia ben attaccato e che non rimangono spazi visibili all'interfaccia.
   6. Rimuovi il topo dalla struttura stereotassica e mettilo in una gabbia calda fino al recupero completo dall'anestesia.
      NOTA: Questo è un punto di sosta adatto. Esegui la procedura di pulizia del cranio dopo che il cemento dentale e il materiale morbido del rivestimento si sono completamente induriti. Nel nostro studio, la finestra HOTS può essere installata nel pomeriggio, seguita dalla pulizia del cranio la mattina successiva, una volta che il topo si è completamente ripreso dall'intervento. In alternativa, la pulizia del teschio può iniziare circa 15 minuti dopo l'installazione della finestra HOTS. Durante l'installazione della finestra HOTS, il cranio rimane strutturalmente intatto, anche se il periosteo viene rimosso.

5. Schiarimento del teschio nei topi svegli e liberi

NOTA: Durante la fase di disboscamento, il topo rimane sveglio e si comporta liberamente nella gabbia di casa. Usa solo brevi anestesie isoflurano per l'iniezione della soluzione e la sostituzione attraverso il tappo montato sulla testa.

1. Caricamento iniziale della S1
   1. Mettere il topo in una camera di induzione e indurre un'anestesia breve con isoflurano al 3–4% nell'aria a una portata di 300–500 mL/min finché il topo non diventa immobile. Non è stata applicata alcuna anestesia di mantenimento.
   2. Immobilizza delicatamente il mouse e stabilizza a mano il cappuccio montato sulla testa.
   3. Usa una siringa da 1 mL con un ago da 26 G per iniettare lentamente circa 1 mL di S1 nel tappo montato sulla testa.
   4. Riporta il topo in una gabbia di casa e lascia che S1 agisca sul cranio per 2 ore.
      NOTA: Durante l'incubazione S1 e S2, ospita il topo singolarmente in una gabbia standard.
2. Aggiornamento della S1
   1. Alle 2 ore dopo il caricamento iniziale di S1, anestesiare brevemente nuovamente il topo con isoflurano.
   2. Aspira S1 dal tappo usando una siringa da 1 mL.
   3. Riempi il tappo con S1 fresco usando una siringa da 1 mL.
   4. Riporta il mouse nella gabbia e lascia che S1 agisca per altre 2 ore.
   5. Ripeti i passaggi 5.2.1–5.2.4 a 4 ore dopo il caricamento iniziale per effettuare una seconda sostituzione di S1.
   6. Dopo la seconda sostituzione, lasciare che S1 continui ad agire fino a raggiungere un tempo di esposizione totale di S1 di 6 ore.
      NOTA: Questo protocollo (1 mL S1 per 6 ore) è ottimizzato per topi di 6 settimane (~20 g). Per animali più anziani con crani più spessi, il tempo di incubazione di S1 può essere progressivamente esteso. Qualsiasi aggiustamento deve essere accompagnato da un attento monitoraggio del benessere animale e da un aspetto finale di imaging per evitare un ammorbidimento eccessivo del cranio.
3. Applicazione di S2
   1. Dopo 6 ore di trattamento S1, anestesiare brevemente il topo con isoflurano.
   2. Aspira S1 dal tappo con una siringa da 1 mL e sostituiscila con 0,7 mL di S2.
   3. Riporta il topo nella gabbia e lascia che S2 agisca sul cranio per 1 ora per aumentare ulteriormente la trasparenza e fornire l'adattamento dell'indice di rifrazione.
      NOTA: In queste condizioni, la fase combinata di bonifica S1 e S2 viene solitamente completata entro 7 ore (6 ore S1 + 1 ora S2). Una pulizia riuscita è indicata da una superficie cranica visibilmente trasparente senza sanguinamento. Il cranio può ammorbidirsi leggermente dopo la liberazione; Quando toccata delicatamente con una pinza fine, dovrebbe mostrare una lieve flessibilità ma rimanere strutturalmente intatta. Evita una pressione eccessiva sulla superficie del cranio.

6. Preparazione per l'imaging

1. Anestesia e fissazione della testa per l'imaging
   1. Al termine dell'incubazione di S2, anestetizzare il topo con iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodio all'1% (w/v) a 150–200 μL per 20 g di peso corporeo.
   2. Confermare un'anestesia adeguata utilizzando il test del riflesso del pizzicotto del dito del piede.
   3. Fissa la testa del mouse avvitando la piastra frontale in titanio a un portatesta progettato su misura.
   4. Applicare unguenta oftalmica su entrambi gli occhi per evitare la secchezza durante l'imaging (imaging).
   5. Mantieni la temperatura corporea a ~37 °C usando una borsa riscaldante.
2. Esposizione della superficie del cranio liberata (Figura 1Be,Bf)
   1. Aspira la soluzione di S2 dal tappo usando una siringa.
   2. Taglia con cura il cappuccio di plastica con forbici fini e rimuovilo usando la pinza, evitando una forza eccessiva sul cranio.
   3. Togli delicatamente il materiale morbido del rivestimento che circonda la finestra della radura per esporre completamente la zona del cranio liberata.
   4. Applicare una piccola goccia di soluzione S2 direttamente sul cranio liberato per fungere da mezzo d'immersione che corrisponde all'indice di rifrazione durante l'imaging.
      NOTA: In questo studio sono stati utilizzati obiettivi standard per immersione in acqua, inclusi un obiettivo 16×/NA 0,8 (N16XLWD-PF, Nikon) e un obiettivo 25×/NA 1,1 (N25X-APO-MP, Nikon). Quando si utilizza S2 come mezzo d'immersione, si regola il collare correttivo dell'obiettivo, se disponibile, all'impostazione appropriata per l'indice di rifrazione di S2 per ridurre le aberrazioni sferiche. Negli esperimenti qui, il cranio liberato ha mantenuto una chiarezza ottica sufficiente per circa 2 ore di imaging a due fotoni, senza evidenti degradi della qualità dell'immagine durante l'osservazione della spina dorsale dendritica. Dopo circa 2 giorni, era necessario un nuovo ricontrollo per ulteriori ricerche di imaging, e il tempo di riqualificazione era sostanzialmente più breve rispetto al primo ritiro, permettendo immagini ripetute e efficienti dallo stesso animale.
3. Imaging con testa fissa e sveglio (opzionale)
   NOTA: Per l'imaging sveglio, abitua il topo alla fissazione della testa prima dell'esperimento. Anestesia brevemente il topo con isoflurano, poi fissa la piastra frontale impiantata al supporto per 15–30 minuti per sessione, ripetendo per 2–3 giorni.
   1. Usa una breve anestesia isoflurana per facilitare la manipolazione. Fissare solo la piastra frontale impiantata al supporto, permettendo al corpo di muoversi liberamente sulla ruota o sulla piattaforma.
   2. Segui i passaggi 6.2.1–6.2.4 per esporre la superficie del cranio libera e applicare S2 prima dell'immagini.

7. Recupero

1. Dopo l'imaging, aspirare delicatamente e rimuovere eventuali residui di soluzione di S2 dalla superficie cranica.
2. Risciacquare la regione del cranio liberata con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) più volte per favorire il graduale ripristino dello stato opaco nativo del cranio.
3. Asciugare delicatamente il liquido residuo dal cranio e dai tessuti circostanti con cotton cotton cotton sterili, evitando danni meccanici all'osso.
4. Se l'animale viene mantenuto in vita per esperimenti successivi, applica uno strato del sigillante biocompatibile Kwik-Cast (WPI) sulla finestra del cranio per proteggere l'osso durante il periodo di sopravvivenza.
5. Lascia che lo strato protettivo si indurisca completamente.
6. Stacca il topo dal supporto per la testa e mettilo in una gabbia calda. Monitora l'animale finché non si riprende completamente dall'anestesia, poi riportalo nella sua gabbia di casa.

Risultati

Seguendo il protocollo, la finestra HOTS (Head-mounted Optically Transparent Skull S) consente l'imaging profondo transcranico a due fotoni nei topi adulti, preservando l'integrità del cranio. Una preparazione di successo è indicata da due risultati chiave: (1) la vascolatura corticale diventa chiaramente visibile attraverso il cranio al momento della pulizia (Figura 1Bf), e (2) il cranio liberato mostra una leggera incavazione sotto una pre...

Discussione

Il metodo HOTS utilizza una finestra di cranio otticamente trasparente (HOTS) montata sulla testa che combina un tappo contenente reagenti di pulizia con una procedura di pulizia del cranio in due fasi per migliorare la trasparenza del cranio nei topi adulti, preservando al contempo l'integrità cranica. Secondo il protocollo standard (6 ore in S1 e 1 ora in S2 per topi di 6 settimane), la finestra risultante supportava in modo affidabile l'imaging profondo transcranico a due fotoni e per...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1 mL di pipetta usa e getta	Beijing Biotopped  Science   & Tecnologia  Co., Ltd.	N/A
Cemento dentale	Shanghai Rongxiang Dental Materials Co., Ltd.	N/A
D-mannosio	Macklin	D813082
EDTA	Aladdin	El 16428
Isoflurano	RWD	N/A
Kwik-Cast	WPI	N/A	Un sigillante biocompatibile
NaOH	Macklin	S832169
Auto-polimerizzante        odontoiatria & nbsp;         Materiale morbido del rivestimento	Yangmahu Biotechnology (Hebi) Co., Ltd.	N/A
Pentobarbital sodico	Biopike	N/A
Apparecchiatura stereotassica	RWD	N/A
Siringa sterile usa e getta	Minank	N/A	1 mL; Ago da 26 G
Solfolano	Macklin	S817950
Topi Thy1-GFP-M		N/A	Fornito  del Prof. Yang Zhan
Thyl-GCaMP6s  topi	Laboratorio Jackson
Preadolescenti 20	Sigma-Vetec	V900548
Obiettivo di immersione in acqua	Nikon	N25X-APO-MP	25×/NA 1.1 obiettivo
Obiettivo di immersione in acqua	Nikon	N16XLWD-PF	16×/NA 0,8 obiettivo