Imaging in tempo reale senza etichettatura e analisi quantitativa della morfodinamica dei macrofagi utilizzando la tomografia a diffrazione ottica

Sommario

Questo protocollo descrive un flusso di lavoro basato su tomografia a diffrazione ottica senza etichette per l'imaging in tempo reale e l'analisi quantitativa della morfodinamica dei macrofagi. Il metodo consente un monitoraggio continuo della morfologia e della migrazione delle singole cellule, fornendo misurazioni risolte nel tempo dell'area proiettata, del perimetro e della velocità media di migrazione durante l'imaging a lungo termine delle cellule vive.

Abstract

Questo studio stabilisce un flusso di lavoro basato sulla tomografia di diffrazione ottica (ODT) senza marcatori per l'imaging e l'analisi delle cellule vive, al fine di osservare i cambiamenti morfologici dipendenti dal tempo nei macrofagi. Il metodo consente la registrazione continua della morfologia e del movimento delle singole cellule su lunghi periodi in condizioni ambientali stabili e consente l'estrazione di parametri quantitativi, inclusi l'area proiettata, il perimetro e la velocità media di migrazione. Questo flusso di lavoro offre un approccio pratico per catturare comportamenti cellulari dinamici a livello di singola cellula senza etichettatura esogena. Utilizzando i macrofagi RAW264.7 come modello, è stata eseguita l'imaging in time-lapse sotto stimolazione lipopolisaccaridica con pretrattamento di baicalina per catturare i cambiamenti cellulari dinamici in condizioni diverse. Sono state selezionate cellule rappresentative per il tracciamento e l'analisi quantitativa. I risultati mostrano che questo flusso di lavoro supporta un tracciamento stabile e a lungo termine di singola cellula e riflette cambiamenti temporali nella morfologia e motilità cellulare. Questo approccio fornisce un metodo senza etichettatura per osservare comportamenti cellulari dinamici in risposta a diversi stimoli e può fungere da utile complemento agli saghi convenzionali basati su endpoint. Potrebbe essere applicabile anche ad altri tipi cellulari aderenti per studi sulla morfodinamica cellulare.

Introduzione

I macrofagi svolgono un ruolo centrale nelle risposte immunitarie innate e nell'omeostasi tissutale, e i loro stati funzionali possono cambiare dinamicamente in risposta a stimoli microambientali. Tradizionalmente, i macrofagi sono stati descritti come adottanti fenotipi pro-infiammatori o antinfiammatori/associati alla^{riparazione 1,2}. Tuttavia, evidenze crescenti suggeriscono che l'attivazione dei macrofagi sia un processo continuo e plastico piuttosto che uno stato binario discreto3,4. Sotto stimoli diversi, i macrofagi subiscono cambiamenti graduali nel tempo, accompagnati da alterazioni nella morfologia cellulare e nel comportamento^{migratorio 5}. Pertanto, la caratterizzazione risolta nel tempo dei cambiamenti morfologici e migratori a livello di singola cellula fornisce un approccio importante per studiare le risposte cellulari dinamiche.

Gli approcci attuali per lo studio degli stati dei macrofagi si basano principalmente su immunocolorazione, citometria a flusso e analisi trascrittomiche^{o proteomiche 6}. Questi metodi si basano tipicamente su campioni fissi o punti temporali discreti, il che limita la loro capacità di tracciare cambiamenti continui nella stessa cella in condizioni di vita⁷. L'imaging a cellule vive basato su fluorescenza consente un'osservazione dinamica ma può essere influenzata dalla fototossicità e dal fotosbiancamento durante esperimenti a lungo^{termine 8,9}. La tomografia da diffrazione ottica (ODT) è una tecnica di imaging senza etichettatura che ricostruisce la distribuzione tridimensionale dell'indice di rifrazione delle cellule fornendo informazioni strutturali quantitative¹⁰. Poiché non richiede marcatura esogena, l'ODT è adatta per l'imaging a lungo termine di cellule vive e riduce la perturbazione del comportamento cellulare. Negli ultimi anni, la ODT è stata applicata a studi dinamici in vari modelli^{cellulari 11}, con studi precedenti che si sono concentrati principalmente sulla capacità di imaging e sulla caratterizzazione strutturale. Al contrario, il presente studio stabilisce un flusso di lavoro standardizzato e privo di etichette per l'analisi a lungo termine e risolta nel tempo della morfodinamica dei macrofagi sotto una condizione definita di stimolazione in vitro.

Il flusso di lavoro è dimostrato utilizzando un modello macrofagico in vitro RAW264.7 con stimolazione di lipopolisaccaridi (LPS) e pretrattamento di Baicalina (BAI). BAI è stato utilizzato come modulatore sperimentale rappresentativo per stabilire una condizione definita per dimostrare il flusso di lavoro. L'imaging continuo consente l'estrazione di parametri quantitativi di singola cellula, inclusi l'area proiettata, il perimetro e la velocità media di migrazione, consentendo la caratterizzazione temporale risolta di cambiamenti morfologici e comportamentali. Questo approccio è inteso a fornire un'analisi descrittiva dei cambiamenti fenotipici dinamici piuttosto che definire stati funzionali o polarizzazione, e può servire come metodo complementare agli saggi basati sugli endpoint fornendo informazioni temporali. Il flusso di lavoro è validato in questo sistema modello ed è potenzialmente applicabile ad altri tipi di cellule aderenti.

Protocollo

1. Cultura dei macrofagi

ATTENZIONE: Esegui tutte le procedure in un armadietto di biosicurezza indossando guanti da laboratorio e camice da laboratorio.

1. Prepara un mezzo di coltura completo (medium Eagle modificato di Dulbecco ad alto contenuto di glucosio (DMEM) integrato con siero fetale bovino al 10% (FBS) e 1% di penicillina–estreptomicina).
2. Scongelare una fiala di cellule macrofagiche RAW264.7 in un bagno d'acqua a 37 °C per meno di 1 minuto.
3. Trasferire la sospensione cellulare in DMEM ad alto contenuto di glucosio integrato con FBS al 10% e 1% di penicillina-estreptomicina.
4. Centrifuga a 300 × g per 5 minuti.
5. Scartate il soprannatante.
6. Risospendere le cellule in un mezzo fresco e completo.
7. Sfornare le cellule dei semi in piastre da 60 mm a 2–5 × 10⁵ cellule per piatto.
8. Incubare le cellule a 37 °C con il 5% di CO₂.
9. Non cambiare il substrato entro 12–24 ore dopo lo scongelamento.
10. Sostituisci il mezzo ogni 2–3 giorni.
11. Monitorare la morfologia cellulare utilizzando un microscopio invertito.
12. Cellule di passaggio a confluenza dell'80–90% tramite pipetazione delicata.
    NOTA: Evita di usare la tripsina. Usa le celle nei passaggi 6–18. Seleziona cellule con morfologia uniforme e senza vacuolizzazione per gli esperimenti. La linea cellulare è stata autenticata tramite profilazione STR e sottoposta a test di controllo qualità. Rapporti dettagliati e un riassunto in inglese sono forniti nei Fascicoli Supplementari.

2. Trattamento cellulare

1. Raccogli cellule nella fase di crescita logaritmica tramite pipetamento delicato.
2. Sospendere le cellule in un mezzo completo.
3. Misura la densità cellulare usando un contatore di cellule.
4. Regola la densità cellulare a 4 × 10⁴ cellule/mL.
5. Seminare 2 mL di sospensione cellulare in ogni piastra da 35 mm.
6. Assegnare le parabole a due gruppi: (i) gruppo LPS, (ii) gruppo BAI + LPS.
7. Incubare le cellule a 37 °C con il 5% di CO₂ per 12–16 ore.
8. Prepara una soluzione stock BAI da 50 mM in DMSO. Conserva la soluzione stock BAI a −20 °C.
9. Aggiungere BAI al gruppo BAI + LPS a una concentrazione finale di 100 μM. Diluire la soluzione stock BAI direttamente nel mezzo di coltura per ottenere la concentrazione finale di lavoro.
10. Aggiungi un volume uguale di DMSO al gruppo LPS.
11. Prepara la soluzione di stocco LPS (1 mg/mL) in mezzo intero.
12. Aggiungi LPS a entrambi i gruppi fino a una concentrazione finale di 1 μg/mL. Diluire la soluzione di stocco LPS direttamente nel mezzo di coltura per ottenere la concentrazione finale di lavoro.
13. Procedere immediatamente all'imaging e non cambiare il mezzo durante l'immagini.

3. Acquisizione della tomografia da diffrazione ottica

1. Accendi il sistema di imaging ODT e avvia il modulo di controllo ambientale.
2. Imposta la temperatura del palco a 37 °C.
3. Imposta la concentrazione di CO₂ al 5%.
4. Lascia che il sistema si equilibri per almeno 20 minuti.
5. Apri il software di acquisizione.
6. Metti il piatto di coltura sulla fase di imaging.
7. Usa un obiettivo 60x (NA = 1.42) per localizzare le celle.
8. Seleziona cellule isolate con confini chiari per l'imaging.
9. Imposta l'intervallo di imaging a 8 minuti.
10. Imposta il numero totale di fotogrammi a 181.
11. Abilita la funzione autofocus per mantenere la messa a fuoco durante l'imaging time-lapse.
12. Inizia l'acquisizione in time-lapse.
13. Monitorare la stabilità del sistema durante l'acquisizione.
    NOTA: La stabilizzazione autofocus è stata applicata durante tutto l'esperimento per minimizzare la deriva focale.

4. Ricostruzione dell'immagine e analisi quantitativa

1. Dopo l'acquisizione dell'immagine, il software esegue automaticamente la ricostruzione dell'immagine.
2. Utilizzando l'algoritmo standard integrato.
3. Aspetta che la barra di progresso sia completa.
4. Apri il software di analisi (Intellyseg, v2.1.0).
5. Importa il dataset grezzo selezionando Importa Dati grezzi.
6. Sto navigando verso la cartella target.
7. Scegli il file di destinazione e importa il dataset.
8. Clicca su "Cella" per eseguire la segmentazione automatica utilizzando impostazioni coerenti tra i dataset¹³.
9. Seleziona le celle in base ai seguenti criteri: (i) nessuna sovrapposizione con celle vicine, (ii) non a contatto con i confini dell'immagine, (iii) tracciabile continuamente durante tutta la serie temporale.
10. Seleziona un numero fisso di celle (n = 8) per campo visivo per un'analisi coerente tra i dataset.
11. Apri il modulo "Tracciamento a lungo termine".
12. Inserisci il frame di inizio e quello di fine.
13. Clicca su "Traccia" per avviare il tracciamento, che si basa sulla coerenza della posizione delle celle tra i frame^{consecutivi 14}.
14. Correggere manualmente gli errori di tracciamento se necessario per garantire la continuità della traiettoria: (i) Cliccare con il tasto destro sulle maschere errate e selezionare "Elimina elemento", (ii) Aprire "Segmentazione manuale", (iii) Selezionare "Cella" e cliccare su "Aggiungi", (iv) Usare "Clicca" o "Casella" per aggiungere le maschere corrette.
15. Clicca su "Esporta", poi seleziona "Esporta dati".
16. Seleziona "Esporta video" e scegli gli elementi di output.
17. Entrate i fotogrammi di inizio e fine.
18. Seleziona il percorso di salvataggio e il formato del file.
19. Clicca su "OK" per esportare il video.
20. Clicca su "Esporta", poi seleziona "Sistema di grafici".
21. Seleziona "Track Chart".
22. Scegli "Cella" come categoria di segmentazione.
23. Entra nel range di frame di tracciamento.
24. Seleziona i parametri di uscita (ad esempio, Area, Perimetro).
25. Clicca su "Esporta immagine o Excel" e salva il file.
26. Calcola la velocità media di migrazione (μm/h) per ogni cella in base allo spostamento del centroide lungo tutta la serie temporale.

5. Presentazione dei dati

1. Le misurazioni quantitative sono presentate in modo descrittivo. Non è stata effettuata alcuna inferenza statistica. Ogni gruppo di trattamento includeva cinque campioni indipendenti.
   Una panoramica del flusso di lavoro sperimentale è mostrata nella Figura 1. Reagenti chiave, strumenti e software sono elencati nella Tabella dei Materiali. Le condizioni di imaging sono riassunte nella Tabella 1.

Risultati

Per valutare le prestazioni del flusso di lavoro basato su ODT, sono state eseguite immagini time-lapse per due gruppi di trattamento (LPS e BAI + LPS), con cinque campioni indipendenti per gruppo. Tutti i campioni sono stati prelevati in condizioni di imaging identiche. A causa dell'elevato carico di lavoro associato al tracciamento a lungo termine di singola cellula e all'analisi quantitativa, è stato selezionato un campione rappresentativo per ogni gruppo per analisi e visualizzazione di singola cellula. I risultati s...

Discussione

Questo studio stabilisce un flusso di lavoro basato su ODT senza etichettatura per l'imaging continuo e l'analisi quantitativa della morfodinamica dei macrofagi a livello di singola cellula. L'approccio consente una misurazione risolta nel tempo dell'area proiettata, del perimetro e della velocità media di migrazione durante l'imaging a lungo termine delle cellule vive. La densità di semina delle celle è un fattore chiave che influenza la segmentazione e le prestazioni di tracciamento. A...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
ODT imaging system	Pellucid Optics	MH-PanoView	Usato per l'imaging di cellule vive senza etichetta
Software di acquisizione	Pellucid Optics	Lucida-Pano v2.1.0	Usato per l'acquisizione delle immagini
Software di analisi	Pellucid Optics	Intellyseg v2.1.0	Usato per la ricostruzione, segmentazione e tracciamento delle immagini
RAW264.7	Wuhan Zishan Biotechnology	STCC20020P	Linea cellulare di macrofagi murini utilizzata per esperimenti di polarizzazione e imaging in vitro.
Baicalin (BAI)	Shanghai Yuanye	JB246114	Usato per il pretrattamento cellulare
Lipopolisaccaride (LPS)	Solarbio	L8880	Usato per stimolare i macrofagi
Medio DMEM	Gibco	C11995500BT	Medio per la coltura cellulare
Siero bovino fetale	Procell	164210	Supplemento per la coltura cellulare
Penicillina–Streptomicina (100x)	Procell	PB180120	Antibiotici per la coltura cellulare
Piadina di coltura da 60 mm	Corning	CLS430166	Usato per la coltura cellulare
Piadina di fondo in vetro da 35 mm	Cellvis	D35-10-1.5-N	Usato per l'imaging ODT
Microscopio invertito	OLYMPUS	CKX53	Usato per l'osservazione di routine delle cellule e il monitoraggio durante la coltura.
Contatore cellulare	RWD Life Science	C100	Usato per la determinazione della densità cellulare