Trasferimento mitocondriale esogeno negli adipociti marroni differenzianti e nei preadipociti carenti di AGPAT2

Sommario

I mitocondri esogeni di origine umana e murina possono essere interiorizzati differenziando i preadipociti e monitorati durante la differenziazione adipogenica utilizzando strumenti di imaging e genetici. Sebbene questi mitocondri interagiscano fisicamente con la rete mitocondriale endogena, non aumentano l'espressione dei marcatori associati agli adipociti bruni maturi.

Abstract

I mitocondri sono centri chiave di segnalazione; tuttavia, resta una questione aperta se l'espansione di massa mitocondriale sia meccanicisticamente necessaria per la differenziazione. AGPAT2 catalizza la conversione dell'acido lisofosfatidico in acido fosfatidico, e la sua carenza porta a una carenza di tessuto adiposo e a una compromessa dell'adipogenesi associata alla riduzione della massa mitocondriale. L'impatto dell'espansione della massa mitocondriale sull'adipogenesi è stato valutato trasferendo mitocondri esogeni in adipociti marroni differenzianti. È stato inoltre indagato se il trasferimento mitocondriale potesse salvare l'addipogenesi compromessa delle cellule carenti di AGPAT2. I mitocondri umani e murini sono stati trasferiti con successo e incorporati nella rete mitocondriale endogena dei preadipociti topini differenzianti e sono persistiti durante tutta l'adipogenesi bruna. Era necessaria la differenziazione adipogenica per la ritenzione dei mitocondri trasferiti. Il trasferimento mitocondriale non ha modificato l'espressione dei marcatori molecolari degli adipociti bruni maturi o del contenuto di gocce lipidiche, sebbene abbia influenzato la distribuzione relativa della dimensione delle gocce lipidiche in modo dipendente dalla specie. Nei preadipociti ^Agpat2-/- il trasferimento mitocondriale non è riuscito a salvare l'adipogenesi, indicando che l'espansione della massa mitocondriale da sola non è sufficiente a invertire i meccanismi che portano alla lipodistrofia in questo modello. Questi risultati indicano che, sebbene i mitocondri umani e murini esogeni possano essere incorporati nella rete mitocondriale di adipociti differenzianti, non influenzano direttamente il programma adipogenico.

Introduzione

Oltre ai loro ruoli bioenergetici primari, i mitocondri fungono da centri di segnalazione in molteplici processi cellulari, inclusa la differenziazione^cellulare 1,2,3,4. Il tessuto adiposo marrone (BAT) possiede una massa mitocondriale notevolmente elevata a supporto della sua attività termogenica, evidenziando il suo ruolo nell'equilibrio energetico dell'intero corpo e nella patogenesi^{dell'obesità 5}. Sebbene la massa mitocondriale sia regolata dall'equilibrio tra biogenesi e mitofagia, non è chiaro se l'espansione della massa mitocondriale durante la differenziazione degli adipociti bruni sia funzionalmente necessaria per l'adipogenesi o semplicemente una conseguenza del processo.

Il trasferimento fisiologico mitocondriale tra cellule è stato documentato sia in vitro che in vivo, contribuendo all'adattamento tissutale in condizioni patologiche, inclusa disfunzione del tessuto adiposo associata all'obesità e resistenza^{all'insulina 6,7}. Inoltre, il trasferimento mitocondriale artificiale in vitro ha dimostrato di aumentare la capacità respiratoria delle cellule^{riceventi 8}. Insieme, questi risultati supportano il concetto che il trasferimento mitocondriale possa modificare la funzione metabolica cellulare e possa contribuire all'adattamento dei tessuti in condizioni di stress^{bioenergetico 9,10,11}. Rispetto alle strategie farmacologiche o genetiche che stimolano la biogenesi mitocondriale endogena attivando programmi di trascrizione nucleare e mitocondriale, il trasferimento mitocondriale consegna direttamente gli organelli alle cellule riceventi, permettendo una rapida modifica della massa mitocondriale indipendentemente dalle manipolazioni^{trascrizionali 12,13}. Questo approccio è fondamentale per correggere i difetti nelle malattie mitocondriali, ma consente anche di studiare le azioni mitocondriali senza i potenziali effetti fuori bersaglio degli approcci farmacologici o^{genetici 14}.

Nel presente studio, abbiamo indagato l'effetto dell'aumento artificiale della massa mitocondriale tramite trasferimento esogeno mitocondriale nella differenziazione degli adipociti bruni. Questo approccio ha permesso una valutazione diretta dell'impatto della massa mitocondriale sul programma adipogenico. Per raggiungere questo obiettivo, i protocolli di trasferimento mitocondriale originariamente sviluppati per le cellule staminali mesenchimali sono stati^{adattati 15} utilizzando sia cellule epatiche umane che preadipociti murini come donatori mitocondriali. È stato sviluppato un metodo per tracciare i mitocondri umani in cellule di topo differenzianti utilizzando strumenti genetici combinati con tecniche di imaging, dimostrando che i mitocondri di entrambe le origini sono incorporati nella rete mitocondriale endogena e persistono durante tutta la differenziazione adipogenica.

Per modellare l'adipogenesi difettosa associata a bassa massa mitocondriale, sono stati utilizzati adipociti marroni derivati da topi carenti di 1-acilglicerolo-3-fosfato-O-aciltransferasi 2 (AGPAT2-/-) (Agpat2^-/-). AGPAT2 è fortemente espresso nel tessuto adiposo, dove catalizza la formazione di acido fosfatidico nella via di biosintesi glicerolipidica. La carenza di AGPAT2 causa una grave lipodistrofia sia nell'uomo che nei topi e compromette l'adipogenesi nei modelli di adipociti bianchi e marroni in associazione con una riduzione della massa^{mitocondriale} 16,17,18. L'incorporazione di mitocondri esogeni nei preadipociti differenzianti ha leggermente alterato la distribuzione della dimensione delle gocce lipidiche, ma non ha aumentato l'espressione dei marcatori adipocitari bruni maturi né ha salvato il compromissione adipogenica dei preadipociti Agpat2^-/-.

Protocollo

Le procedure sugli animali sono state approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali della Pontificia Universidad Católica de Chile, protocollo 210609003. In questo studio sono stati utilizzati topi neonatali di tipo selvatico e Agpat2^-/- P0.5 di entrambi i sessi, derivati da un background genetico misto C57BL/6J e 129J. Dispositivi di protezione individuale (DPI): Indossare camice da laboratorio, occhiali di sicurezza e guanti in nitrilo. Vedi il File Supplementare 1 per ulteriori dettagli sul protocollo e la Tabella 1 per i buffer richiesti per questo protocollo.

Tutti i rifiuti chimici tossici generati durante la preparazione della microscopia elettronica, la fissazione del paraformaldeide e l'estrazione degli acidi nucleici devono essere rigidamente segregati in flussi designati e chiaramente etichettati, in conformità con le normative istituzionali sulla Salute e Sicurezza Ambientale (EHS). In nessun caso questi reagenti devono essere scaricati nel lavandino del laboratorio o nel sistema fognario pubblico. Tutti i rifiuti chimici pericolosi generati devono essere segregati secondo le classificazioni EHS istituzionali.

1. Coltura cellulare

1. Isolamento, differenziazione e mantenimento degli adipociti primari (iBAT)
   NOTA: Vedi il File Supplementare 1 per una breve descrizione delle procedure e la Tabella 1 per la composizione delle soluzioni richieste. Una spiegazione completa e dettagliata del nostro protocollo di differenziazione adipogenica marrone in vitro si trova in Figueroa et ^al.19.
   1. Isolare preadipociti dal tessuto adiposo interscapolare marrone (iBAT) dei topi neonatali (P0.5) seguendo le procedure chirurgiche e di digestione enzimatica descritte da Figueroa et ^al.19.
   2. Differenzia e mantiene la coltura degli adipociti bruni secondo il programma di differenziazione dei cocktail e dello scambio mediatico.
      NOTA: Per una differenziazione adipogenica di successo, è di fondamentale importanza che le colture raggiungano una confluenza del 90–100% prima di iniziare l'induzione adipogenica.
2. Cultura HepG2
   1. Coltivare cellule di HepG2 in DMEM integrate con siero bovino fetale al 10%, 100 U/mL di penicillina, 100 μg/mL di estreptomicina e 0,25 μg/mL di anfotericina B. Mantieni le cellule a 37 °C in un incubatore umidificato con 5% di CO₂.
      NOTA: Queste cellule crescono in gruppi e possono apparire subconfluenti nonostante l'elevata densità dovuta alla crescita multistrato.

2. Isolamento e trasferimento mitocondriale

1. Isolamento mitocondriale
   NOTA: Eseguire tutti i passaggi in un armadietto di biosicurezza a 4 °C o sul ghiaccio. Usa la preparazione entro 2 ore.
   1. Semi 2 × 10⁶ cellule donatrici (HepG2 o preadipociti) in vasche di coltura da 100 mm. Fai crescere le cellule fino a raggiungere l'80% (HepG2) o il 100% (preadipociti).
   2. Colorare cellule donatrici con MitoTracker Deep Red FM a 100 nM in un mezzo senza FBS per 30 minuti a 37 °C in un incubatore al 5% di CO₂ .
   3. Lava le cellule due volte con un substrato per rimuovere il colorante in eccesso.
   4. Distacca le cellule usando tripsina, raccoglie la sospensione e centrifuga a 300 × g per 5 minuti a 4 °C.
   5. Risospendere il pellet in 1 mL di buffer di isolamento mitocondriale (MIB) integrato con BSA, inibitori della proteasi e inibitori della fosfatasi. Interrompi la membrana plasmatica passando la sospensione attraverso una siringa di tubercolina 5 volte. Omogeneizza la sospensione passandola attraverso una siringa di insulina almeno 10 volte finché la soluzione non diventa marrone chiaro e non presenta grumi visibili.
      NOTA: Per l'analisi western blot, si attribuiscono 50 μL del lisato totale e si conservano a -20 °C.
2. Centrifugare l'omogeneato a 900 × g per 11 minuti a 4 °C.
   NOTA: Se il sovrantantante dopo lo spin di 900 × g non è torbido, la lisi cellulare è probabilmente incompleta.
   1. Raccogliere il surnatante e centrifugare a 10.000 × g per 10 minuti a 4 °C per granulare i mitocondri. Lava il pellet mitocondriale 3 volte con MIB integrato con BSA.
   2. Eseguire una risospensione finale con 100 μL di MIB senza BSA. Quantificare la concentrazione proteica utilizzando un saggio proteico BCA.
3. Saggio di trasferimento mitocondriale (MTA) nei preadipociti
   1. Preadipociti destinatari del seme a 5 × 10⁵ cellule/pozzo in piastre a 12 pozzi (con copertura da 18 mm per microscopia) 24 ore prima del saggio.
   2. Aggiungere mitocondri isolati direttamente al mezzo ricevente con un rapporto di 10 μg di proteina mitocondriale ogni^{10 5} cellule. Dondola delicatamente le placche per distribuire i mitocondri. Incubare le cellule per 24–120 ore (corrispondenti ai giorni 1, 3 e 5 di differenziazione) a 37 °C in un incubatore umidificato con il 5% di CO₂ prima dell'analisi.

3. Consumo mitocondriale di ossigeno ed efficienza MTA

1. Respirometria mitocondriale
   1. Imposta il bagno d'acqua esterno a 25 °C e assicurati un equilibrio termico stabile nella camicia della camera prima di iniziare qualsiasi misurazione.
   2. Eseguire una calibrazione della fase liquida a due punti utilizzando il software di acquisizione dello strumento.
      1. Calibrazione della saturazione dell'aria (High Point): Aggiungere 500 μL di acqua demineralizzata satura d'aria alla camera. Imposta lo agitatore magnetico a 60 giri/min e registra il segnale finché non si stabilizza su un plateau (>1.500 mV).
      2. Calibrazione a zero ossigeno (Punto Basso): Aggiungere una piccola quantità (~3 mm di diametro) di solfito di sodio alla camera per spostare l'aria residua. Registra finché il segnale non scende a un plateau di base stabile (~1% del segnale basale, ~20 mV).
   3. Avvia la registrazione in tempo reale (durata totale: ~10 min).
   4. Registra per 3 minuti finché non si raggiunge una lettura lineare stabile.
   5. Risospendere mitocondri isolati in 200 μL di tampone per analisi mitocondriale (MAS⁾²⁰ integrato con 5 mM glutammato e 2,5 mM di malato.
      NOTA: Per il presente lavoro, la pellet di mitocondri totali è stata estratta da due piastre cellulari da 100 mm.
   6. Trasferire la sospensione nella camera ossigrafica e chiudere saldamente lo sturalavandini di sigillamento della camera, assicurandosi che non rimangano bolle d'aria.
   7. Registra il consumo di ossigeno per 3 minuti.
   8. Aggiungi 150 μM di ADP per attivare la respirazione accoppiata mitocondriale e misura la respirazione con sintesi di ATP accoppiata per 3 minuti.
   9. Definisci manualmente i segmenti stabili e lineari corrispondenti a ciascuna fase respiratoria. Estrai i valori automatizzati delle pendenze calcolati dal software, espressi come tassi di consumo di ossigeno in nmol∙^mL-1∙^min-1.
      NOTA: Per la pulizia della camera interplate, risciacqua la camera 2 volte con 1 mL di acqua demineralizzata e assicurati che l'interno sia completamente asciutto. Aggiungi 100 μL di PBS alla camera prima di procedere con la lastra successiva.
2. Citometria a flusso
   NOTA: Conservare tutti i campioni sul ghiaccio durante tutta la procedura per preservare l'integrità cellulare e bioenergetica.
   1. Isolare i mitocondri ed eseguire il saggio di trasferimento mitocondriale (MTA), come descritto nelle Sezioni 2.1 e 2.2, rispettivamente, in piatti di coltura da 35 mm, utilizzando cellule donatrici precedentemente etichettate con MitoTracker Deep Red FM.
   2. Aspirare il mezzo di coltura e lavare il monostrato cellulare una volta con 1 mL di PBS sterile.
   3. Aggiungere 500 μL di tripsina-EDTA allo 0,25% e incubare le piastre a 37 °C fino a osservare il completo distacco cellulare al microscopio.
   4. Neutralizza la tripsina aggiungendo 1 mL di mezzo di crescita completo (DMEM con FBS al 10%). Trasferire l'intero volume in un tubo conico da 15 mL e centrifugare a 300 × g per 5 minuti a 4 °C.
   5. Scartare il soprandanante per aspirazione e trattenere la pellet cellulare. Risospendere il pellet in 500 μL di PBS gelato tramite pipetaggio delicato.
   6. Analizzare i campioni utilizzando un citometro a flusso dotato di un laser da 640 nm (vedi File Supplementare 1 per dettagli sull'acquisizione e l'analisi della citometria in flusso).
      1. Definire la popolazione cellulare usando grafici di scattering frontale (FSC) rispetto a scatter laterale (SSC) e applicare una strategia di gating per escludere detriti e doppietti cellulari.
      2. Quantificare l'intensità di fluorescenza nel canale rosso lontano (filtro di emissione 670/30 nm) per rilevare mitocondri internalizzati marcati con MitoTracker.
      3. Eseguire analisi utilizzando Floreada.io (vedi File Supplementare 1 per i dettagli del protocollo di gate).
         NOTA: Includere un controllo negativo (cellule riceventi senza MTA) per impostare la base per l'autofluorescenza di fondo.
3. Microscopia confocale ed elettronica
   1. Test di imaging a cellule vive
      1. Semi di preadipociti primari derivati da topi neonatali P0.5 in piastre a 12 pozzi contenenti steli di copertura da 18 mm, seguendo i requisiti specifici di densità cellulare e media dettagliati nella Sezione 1.
      2. Isolare i mitocondri ed eseguire il test di trasferimento mitocondriale (MTA) utilizzando cellule donatrici precedentemente etichettate con MitoTracker Deep Red FM, come specificato nella Sezione 2.
      3. Mantenere le colture riceventi in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di_CO2 per 24 ore per consentire l'assorbimento mitocondriale.
      4. Prepara una soluzione di lavoro MitoTracker Green da 70 nM diluendo il calcio in un mezzo di coltura senza FBS.
      5. Aspira il mezzo di crescita dalle piastre a 12 pozzi e sostituiscilo con la soluzione MitoTracker Green da 70 nM. Incubare le placche per 25 minuti a 37 °C in un incubatore umidificato con il 5% di_CO2 per contrastare la rete mitocondriale totale.
      6. Rimuovi la soluzione per le macchie e lava le coperture 2 volte con 1 mL di mezzo caldo e completo per la coltura.
      7. Sostituire il volume finale con un mezzo completo senza fenolo rosso per minimizzare l'autofluorescenza di fondo durante l'acquisizione.
      8. Trasferire le coperture o la lastra allo stadio del microscopio confocale. Impostare la camera di incubazione del microscopio per mantenere un ambiente costante di 37 °C e 5% di_CO2.
      9. Acquisire immediatamente immagini utilizzando le impostazioni appropriate di eccitazione/emissione sia per i canali rosso lontano (MitoTracker Deep Red FM) che per quelli verdi (MitoTracker Green). Vedi il File Supplementare 1 per ulteriori dettagli.
         NOTA: Eseguire tutte le fasi di colorazione e manipolazione in condizioni di scarsa illuminazione per prevenire il fotosbiancamento dei fluorofori. Utilizzare un obiettivo ad immersione in olio ad alta apertura numerica (NA) (60x o 100x) per una risoluzione ottimale della morfologia mitocondriale.
   2. Saggio immunofluorescenza confocale con cellule fisse
      NOTA: Dopo la fissazione cellulare, le soluzioni tossiche di paraformaldeide e glutaraldeide sono classificate come organi non alogenati. I sottoprodotti dell'estrazione degli acidi nucleici richiedono una segregazione rigorosa: le miscele fenolo/cloroformico devono essere eliminate come organi alogenati, mentre i tamponi a base di guanidinio sono classificati come organici corrosivi.
      1. Preadipociti primari di semi derivati da topi neonatali P0.5 in piastre a 12 pozzi contenenti membrane di copertura da 12 mm, come descritto nella Sezione 1.
      2. Isolare i mitocondri ed eseguire il saggio di trasferimento mitocondriale (MTA) seguendo le procedure specificate nella Sezione 2.
      3. Incubare le colture per 24 ore per consentire l'assorbimento mitocondriale.
      4. Indurre la differenziazione adipogenica marrone seguendo il protocollo descritto nel File Supplementare 1 e consultare la Tabella 1 per la composizione dei buffer richiesti.
      5. Fissa le cellule al giorno 7 di differenziazione (168 ore). Aspirare il mezzo di coltura e aggiungere 500 μL di paraformaldeide (PFA) al 4% per pozzo. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
      6. Lava le coperture 2 volte aggiungendo 1 mL di PBS ghiacciato per pozzo. Permeabilizzare e bloccare le cellule incubando le coperture in PBS contenenti lo 0,05% di saponina e lo 0,2% di BSA per 1 ora a temperatura ambiente. Posiziona la piastra su uno shaker orbitale sotto una delicata agitazione.
      7. Lava le cellule due volte con 1 mL di PBS. Tingere simultaneamente i nuclei e le gocce lipidiche. Applicare 1 μg/mL di Hoechst 33342 e 1 μg/mL di BODIPY preparati nel buffer di bloccaggio/permeabilizzazione. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente, assicurandoti che la piastra sia protetta dalla luce.
      8. Lava le copertine due volte con 1 mL di PBS ghiacciato. Monta le coperture su vetrine pulite in vetro. Somministrare 10 μL di montante sul carrello e posizionare il copertino con il lato della cella verso il basso sul mezzo di montaggio. Lascia asciugare i campioni durante la notte in un ambiente buio a temperatura ambiente prima dell'imaging.
      9. Acquisire immagini utilizzando un microscopio confocale. Utilizzare due canali di fluorescenza calibrati per gli spettri di emissione di Hoechst e BODIPY. Consulta il Fascicolo Supplementare 1 per ulteriori dettagli di imaging.
      10. Esegui l'analisi delle gocce lipidiche usando ImageJ v1.54s. Apri il canale delle gocce lipidiche, identifica manualmente le singole gocce usando gli strumenti di selezione a mano libera e ROI Manager , e calcola l'area delle gocce usando il modulo Analizza | Misura il comando.
      11. Elabora e analizza i dati risultanti utilizzando gli script R forniti nel File Supplementare 2 all'interno dell'ambiente RStudio v4.5.2.
          NOTA: Acquisisci esattamente cinque immagini per copertina con ingrandimento 10x per garantire un campionamento rappresentativo. Usa R versione 4.5.2 o superiore per la compatibilità con gli script forniti.
   3. Microscopia elettronica a trasmissione (TEM)
      NOTA: Per i sottoprodotti della microscopia elettronica, i tamponi altamente tossici di tetrossido di osmio e cacodinato di sodio contenenti arsenico devono essere raccolti come rifiuti tossici di metalli pesanti, mentre l'acetato di uranile viene gestito separatamente come rifiuti radioattivi di metalli pesanti secondo i protocolli istituzionali di sicurezza radiologica.
      1. Centrifugare i mitocondri isolati, dalla Sezione 2, a 10.000 × g per 10 minuti a 4 °C per ottenere un pellet compatto.
      2. Fissa il pellet aggiungendo glutaraldeide al 2,5% in un tampone cacodilato di sodio 0,1 M (pH 7,0). Incubare per 2 ore a 4 °C.
         NOTA: Maneggiare sempre soluzioni di glutaraldeide e eseguire i primi passaggi di fissazione all'interno di una cappa chimica. Indossa guanti e occhiali in nitrilo per proteggere gli occhi. Evita qualsiasi contatto con fonti di calore, poiché il glutaraldeide riscaldato rilascia vapori altamente irritanti.
      3. Lavare la preparazione mitocondriale per 3 × 10 minuti con un tampone di cacodilati di sodio a 0,05 M, e centrifugare brevemente per trattenere il pellet tra un cambio di tampone e l'altro.
      4. Post-fissare il campione aggiungendo terossido di osmio acquoso all'1% (_{OsO 4}). Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
         NOTA: Il tetrossido di osmio deve essere aperto e maneggiato solo all'interno di una cappa chimica certificata e completamente funzionante. Indossa un camice da laboratorio, occhiali di sicurezza o una visiera integrale, e guanti spessi o doppi in nitrilo (cambia immediatamente i guanti se si verifica uno schizzo, poiché_{l'OsO 4} può penetrare il nitrile sottile nel tempo).
      5. Lava il campione per 3 × 5 minuti con acqua doppiamente distillata. Tingi il pellet con acetato di uranyle acquoso all'1% per 15 minuti.
         NOTA: Lavora su carta da banco usa e getta con fondo di plastica. Dedica un'area specifica del laboratorio per la colorazione radioattiva. Indossa doppi guanti, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza. Lavati accuratamente le mani dopo aver completato la procedura.
      6. Disidratare la preparazione utilizzando una serie di etanolo gradato. Incubare il pellet in etanolo 30%, 50%, 70%, 95% e 100% per 5 minuti a ogni concentrazione.
      7. Inserisci le frazioni mitocondriali. Incubare in una soluzione 1:1 di Epon/etanolo per 30 minuti, seguita da resina pura di Epon per 1 ora.
      8. Trasferire i campioni in stampi di incorporazione e polimerizzare in un forno a 60 °C per 48 ore.
      9. Fissa i blocchi di resina all'ultramicrotomo e taglia sezioni ultrasottili (80 nm).
      10. Raccogli sezioni su griglie. Tingi le griglie con acetato di uranile acquoso all'1% per 4 minuti. Risciacquo con acqua doppia distillata.
      11. Tingere con citrato di piombo per 5 minuti seguendo il metodo²¹ di Reynolds. Risciacqua bene. Visualizza le griglie usando il TEM. Vedi il Supplemental File 1 per dettagli sul metodo di Reynolds e sull'acquisizione di immagini TEM.

4. Quantificazione molecolare

1. Curva standard del DNA mitocondriale (mtDNA)
   1. Seminare le cellule di HepG2 in cinque vasi di coltura da 100 mm. Incubare le colture fino a raggiungere l'80% della confluenza.
   2. Isolare i mitocondri dalle cellule prelevate seguendo la procedura tecnica descritta nella Sezione 2.
   3. Estrarre il DNA totale dal pellet mitocondriale risultante utilizzando il metodo acido-guanidinio-fenolo-cloroformio come descritto nella Sezione 4.2.6. Misurare la concentrazione di DNA e valutare la purezza ((rapporti A₂₆₀/A₂₈₀ e (A₂₆₀/_{A 230} )) utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis a microvolume.
   4. Prepara una serie di diluizione seriale usando acqua priva di nucleasi come diluente. Diluire il DNA per ottenere quantità finali di 1, ^10-1, ^10-2, ^10-3, ^10-4 e ^10-5 ng per volume di reazione. Vortice ogni diluizione per 5 secondi per garantire completa omogeneità prima di procedere al passo successivo della serie.
      NOTA: Regolare l'intervallo di concentrazione della curva standard in base alla concentrazione specifica del campione e al volume finale della reazione PCR.
2. Rilevamento del mtDNA umano nelle cellule riceventi
   1. Preadipociti primari derivati da topi neonatali P0.5 in vasi di coltura da 60 mm, seguendo le condizioni di densità e di mezzo specificate nella Sezione 1.
   2. Isolare i mitocondri dalle cellule di HepG2 donate ed eseguire il saggio di trasferimento mitocondriale (MTA) come dettagliato nella Sezione 2.
   3. Incubare le colture per 24 ore a 37 °C e 5% di_CO2.
   4. Indurre la differenziazione adipogenica marrone per 24–120 ore (nei giorni 1, 3 e 5) seguendo il protocollo di scambio dei mezzi descritto nella Sezione 1.
   5. Aspira il mezzo di coltura e lava le cellule 2 volte con 2 mL di PBS gelato.
   6. Estrarre il DNA totale utilizzando il metodo acido-guanidinio-fenolo-cloroformio²².
      NOTA: Sempre aliquota ed esegui la separazione delle fasi all'interno della cappa per evitare di inalare vapori tossici di fenoli. Usa guanti doppi in nitrilo o guanti resistenti ai prodotti chimici a grande resistenza.
   7. Eseguire la separazione delle fasi e scartare l'intera fase acquosa situata sopra l'interfase.
      PASSO CRITICO: Rimuovere completamente la fase acquosa per prevenire la contaminazione e garantire un'elevata purezza del DNA per la qPCR a valle.
   8. Aggiungere 0,3 mL di etanolo al 100% per 1 mL del reagente di estrazione iniziale. Copri il tubo e mescola energicamente per inversione.
   9. Lascia riposare per 3 minuti a temperatura ambiente e centrifuga a 2.000 × g per 5 minuti a 4 °C per mettere in pellet il DNA.
   10. Trasferire il sovrantantante fenolo-etanolo in un tubo separato per un potenziale isolamento proteico. Risospendere la pellet di DNA in 1 mL di citrato di sodio 0,1 M (in etanolo al 10%, pH 8,5) per 1 mL di reagente di estrazione utilizzato.
   11. Lascia riposare per 30 minuti a temperatura ambiente, invertendolo delicatamente alcune volte, e centrifuga a 2.000 × g per 5 minuti a 4 °C. Scartate il soprannatante.
   12. Ripeti i passaggi di lavaggio del citrato di sodio altre due volte.
   13. Lavare il pellet risultante con 2 mL di etanolo al 75% per ogni 1 mL di reagente di estrazione iniziale.
   14. Lascia riposare per 20 minuti a temperatura ambiente e centrifuga a 2.000 × g per 5 minuti a 4 °C.
   15. Scarta il soprandanante e asciuga il pellet all'aria per 10 minuti. Solubilizzare il DNA aggiungendo 0,3–0,6 mL di NaOH da 8 mM e pipettando ripetutamente su e giù finché la pellet non scompare.
   16. Centrifugare a 12.000 × g per 10 minuti a 4 °C per rimuovere eventuali detriti insolubili. Trasferisci il soprantantante in un tubo sterile e regola il pH a 7–8 usando HEPES.
   17. Misurare la concentrazione e la purezza del DNA (rapporti (A(260)/A(280) e (A(260)/A(230)) utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis a microvolume.
   18. Diluire il modello fino a una quantità finale di 15 ng di DNA totale in acqua priva di nucleasi. Eseguire PCR quantitativa in tempo reale (qPCR) per il mtDNA umano utilizzando piastre ottiche a 96 pozzi come specificato nella Sezione 4.3.
   19. Analizza i risultati dell'amplificazione applicando un modello di regressione logaritmica.
       NOTA: Eseguire l'analisi di regressione logaritmica utilizzando la concentrazione di DNA e i corrispondenti valori del ciclo soglia (Ct) come variabili.
3. RT-qPCR per l'espressione genica
   1. Preparazione e differenziazione cellulare
      1. Preadipociti primari di semi derivati da topi neonatali P0.5 in piatti di coltura da 60 mm come dettagliato nella Sezione 1.1.
      2. Isolare i mitocondri ed eseguire il test di trasferimento mitocondriale (MTA) seguendo le procedure della Sezione 2. Incubare le colture per 24 ore.
      3. Indurre l'adipogenesi marrone per 24–120 ore (campionamento nei giorni 1, 3 e 5 di differenziazione) secondo il protocollo della Sezione 1.
   2. Isolamento totale dell'RNA
      1. Rimuovere il mezzo di coltura e aggiungere 1 mL di reagente estraente acido-guanidinio-fenolo-cloroformio per 1 × 10^{6 cellule} direttamente nel piatto. Omogeneizzare i campioni tramite pipetting ripetuto finché il lisato non diventa uniforme.
         NOTA: Sempre aliquota ed esegui la separazione delle fasi all'interno della cappa per evitare di inalare vapori tossici di fenoli. Usa guanti doppi in nitrilo o guanti resistenti ai prodotti chimici a grande resistenza.
      2. Aggiungere 0,2 mL di cloroformio per ogni 1 mL di reagente estrattivo utilizzato. Tappa bene i tubi e scuoti vigorosamente a mano per 15 secondi. Lascia riposare per 3 minuti a temperatura ambiente e centrifuga a 12.000 × g per 15 minuti a 4 °C.
      3. Trasferire con attenzione la fase acquosa superiore in un nuovo tubo privo di nucleasi. Evita il contatto con l'interfase. Tieni i campioni sul ghiaccio.
      4. Aggiungere 0,5 mL di isopropanolo per 1 mL di reagente estrattivo utilizzato. Mescola delicatamente per inversione e incuba per 10 minuti a temperatura ambiente.
      5. Centrifugare a 12.000 × g per 10 minuti a 4 °C per pelletare l'RNA. Scartare il soprantantante per inversione.
      6. Lava il pellet di RNA con 1 mL di etanolo al 75%. Vortice brevemente e centrifuga a 7.500 × g per 5 minuti a 4 °C.
      7. Scarta il sovrandante e asciuga all'aria la pellet di RNA per 10 minuti a temperatura ambiente. Risospendere il pellet in 30 μL di acqua priva di nucleasi. Incubare i campioni a 60 °C per 15 minuti per garantire una solubilizzazione completa.
      8. Determinare la concentrazione e la purezza dell'RNA (rapporti A₂₆₀/_{A 280} ) utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis a microvolume.
      9. Verifica l'integrità dell'RNA tramite elettroforesi su gel di agarosio.
   3. Trattamento con DNasi
      1. Aggiungere 0,1 volumi di 10× tampone DNasi e 1 μL di enzima DNasi a ciascun campione di RNA. Mescola delicatamente con la pipetta. Incubare le reazioni a 37 °C per 30 minuti.
      2. Risospendere il reagente di inattivazione della DNasi tramite flicking o vortice finché la suspense non diventa omogenea. Aggiungi il reagente di inattivazione (0,1 volumi del campione di RNA o 2 μL, a seconda di quanto sia maggiore) e mescola accuratamente. Incuba per 5 minuti a temperatura ambiente. Muovi i tubi 3 volte durante questo periodo per mantenere il reagente in sospensione.
      3. Centrifuga a 10.000 × g per 1,5 minuti. Trasferire il soprandanante contenente RNA su un nuovo tubo.
         PASSO CRITICO: Assicurarsi che nessun reagente di inattivazione della DNasi venga trasferito, poiché inibisce la successiva sintesi del cDNA.
   4. Trascrizione inversa (RT)
      1. Quantificare l'RNA trattato e diluirlo in acqua priva di nucleasi per utilizzare fino a 2 μg di RNA totale per reazione da 20 μL.
      2. Prepara il master mix RT su ghiaccio seguendo le istruzioni del produttore. Distribuisci la miscela in tubetti di reazione e aggiungi i campioni di RNA.
      3. Carica in un thermal cycler ed esegui il programma di trascrizione inversa come specificato dal produttore del kit.
   5. PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR)
      1. Usa il cDNA generato nella Sezione 4.3.4 come modello PCR. Diluire il cDNA in acqua priva di nucleasi a una concentrazione operativa di 20 ng per reazione da 10 μL. Tieni tutti i reagenti sul ghiaccio.
      2. Prepara un mix master contenente SYBR Green, primer e acqua priva di nucleasi. Includere il volume in eccesso per la perdita di pipetta. Dispensare 10 μL della miscela di reazione in ciascun pozzetto di una piastra ottica qPCR.
      3. Sigilla la piastra con pellicola adesiva ottica e centrifuga brevemente per raccogliere il liquido sul fondo. Carica la piastra in uno strumento PCR in tempo reale ed esegui l'amplificazione usando la modalità fast cycling.
      4. Determinare i valori del ciclo soglia (Ct) ed eseguire la quantificazione relativa utilizzando il metodo ΔΔCt. Includere un'analisi della curva di fusione alla fine della corsa per verificare la specificità dell'amplificazione.
         NOTA: Normalizzare l'abbondanza di mRNA target a livelli di mRNA 36B4 come gene endogeno di mantenimento della casa. Fai funzionare le piastre qPCR entro 2 ore dalla configurazione; altrimenti, conservare le piastre sigillate a 4 °C.
4. Tachia occidentale
   1. Quantificare la concentrazione proteica da estratti interi e mitocondriali (vedi le Sezioni 2.1.8 e 2.1.12) utilizzando un saggio BCA.
   2. Prepara 30 μg di proteina per campione e aggiungi il volume appropriato del buffer di caricamento del campione SDS-PAGE (ad esempio, buffer di Laemmli).
   3. Denatura i campioni riscaldando a 95 °C per 5 minuti (oppure segui i requisiti di temperatura specifici per le proteine di membrana).
   4. Carica i campioni nei pozzi di un gel di poliacrilammide. Separare le proteine tramite elettroforesi in gel dodecil-solfato di sodio e poliacrilammide (SDS-PAGE) a una tensione costante (ad esempio, 80–120 V) finché il fronte del colorante non raggiunge il fondo del gel.
   5. Attiva una membrana PVDF immergendola al 100% in metanolo per 1 minuto, seguita da un equilibrio nel tampone di trasferimento.
   6. Assembla il sandwich di trasferimento, assicurandoti che non ci siano bolle d'aria tra il gel e la membrana.
   7. Trasferire le proteine sulla membrana PVDF elettroblottando a 400 mA per 2 ore. Mantieni il sistema a 4 °C durante tutto il processo.
   8. Bloccare i siti di legame aspecifici incubando la membrana in latte scremato al 5% preparato in soluzione salina Tris-buffer contenente 0,1% Tween 20 (TBS-T) per 1 ora a temperatura ambiente.
   9. Incubare la membrana con anticorpi primari (diluiti 1:1.000 in soluzione bloccante) durante la notte a 4 °C sotto agitazione delicata.
   10. Lava la membrana 3 × 15 minuti con TBS-T.
   11. Incubare con anticorpi secondari coniugati con peroxidasi di rafano (HRP) per 2 ore a temperatura ambiente.
   12. Lava la membrana 3 volte con TBS-T, seguita da un lavaggio finale di 5 minuti con 1× cucchiaiere.
   13. Visualizza le bande proteiche utilizzando un substrato a chemiluminescenza avanzata (ECL). Cattura il segnale utilizzando un sistema di imaging digitale.
       NOTA: Regolare la percentuale di gel di poliacrilammide (ad esempio, 8%, 10% o 12%) in base al peso molecolare delle proteine bersaglio. Se l'apparato di elettrotrasferimento non dispone di un sistema di raffreddamento attivo, sostituire i contenitori di ghiaccio ogni ora e mantenere la camera sommersa in un bagno di ghiaccio. Conservare membrane in 1× TBS a 4 °C se la visualizzazione è ritardata.

Risultati

Estrazione mitocondriale e integrità strutturale e respiratoria

Per valutare l'impatto dell'aumento della massa mitocondriale sull'adipogenesi marrone, è stato eseguito un saggio di trasferimento mitocondriale (MTA) su preadipociti indifferenziati (Figura 1A). I mitocondri sono stati isolati da preadipociti murini primari (mMito) e dalla linea cellulare epatica umana HepG2 (hMito). L'analisi del Western blot ha di...

Discussione

Implicazioni biologiche del trasferimento mitocondriale nell'adipogenesi

I nostri risultati mostrano che, sebbene i mitocondri esogeni sia di fonti umane che murine possano essere incorporati nella rete mitocondriale endogena dei preadipociti differenzianti, un aumento artificiale della massa mitocondriale non è sufficiente a guidare il programma adipogenico marrone. Questi risultati suggeriscono che l'espansione mitocondriale caratteristica ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
100 mm plate	SPL Life Science	10101SPL
10x Tris/Glycine Buffer	BioRad	1610734
12 mm glass coverslips	Marienfeld	111520
12-well plate	SPL Life Science	30012SPL
16% Paraformaldehyde Aqueous Solution	Invitrogen	28908
18 mm glass coverslips	HART	-
24-well plate	SPL Life Science	30024SPL
3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt (T3)	Sigma	T6397
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)	Calbiochem	410957
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1	BioRad	1610158
35 mm plate	SPL Life Science	20035SPL
6-well plate	SPL Life Science	30006SPL
60 mm culture dish	SPL Life Science	20060SPL	Utilizzato per esperimenti con preadipociti primari e DNA/qPCR; fornitore/catalogo non fornito
AccuRuler RGB Plus Pre-stained Protein Ladder	Maestrogen	02102-250
ACK lysing buffer	Gibco	A10492-01
Actrapid 100 UI/mL (Insulin)	Novo Nordisk	A10AB01
ADP	Merck	117105
Agarose	FERMELO BIOTEC	FER00AL200G	Utilizzato per la verifica dell'integrità dell'RNA; fornitore/catalogo non fornito
Ammonium Persulfate	BioRad	1610700
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling	7074
Anti-rat IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling	7077
Antibiotic-antimycotic	Gibco	15240062
Axio Observer inverted microscope stand	Carl Zeiss	431007-9901-000	Aggiunto da Metodi Supplementari
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	D49328
BD Cytometer Setup and Tracking beads	BD Biosciences	-	Aggiunto da Metodi Supplementari; catalogo non fornito
BD FACSDiva Software v8.0.3	BD Biosciences	-	Aggiunto da Metodi Supplementari
BD LSRFortessa X-20 cell analyzer	BD Biosciences	-	Voce esistente standardizzata per corrispondere al file supplementare
BioRender	BioRender	-	Utilizzato per creare il flusso di lavoro della Figura 1
Blotting-grade blocker	BioRad	170-6404
BODIPY 493/503	Invitrogen	D3922
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A1470
CaCl2	Calbiochem	208291
cDNA Reverse Transcription Kit	Invitrogen	4374966
Cell Strainer 100 µm, nylon	Falcon	352360
Cell Strainer 40 µm, nylon	Falcon	352340
Collagenase type II	Gibco	17101-015
Dexamethasone	Sigma	D4902
DMEM Powder, High Glucose, Pyruvate	Thermo Scientific	12800017
DMEM/F-12, no phenol red	Thermo Scientific	21041025
DMEM/F-12, powder	Gibco	12500062
DMSO	Sigma	D8418	Solvente per il mezzo di induzione; fornitore/catalogo non fornito
EMBed-812 EMBEDDING KIT (Epon)	Electron Microscopy Sciences	14120
Ethanol absolute	Merck	100983
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid tetrasodium salt (EGTA)	Merck	324626
FAST SYBR MASTER MIX	Thermo Scientific	4385612
FCCP	Sigma	C2920
Fetal bovine serum	Capricorn Scientific	BS-16A
Floreada.io	Floreada.io	-	Software di analisi di citometria a flusso
Fluoromount-G	Thermo Scientific	7984-25
GAPDH Antibody	Santa Cruz	sc-32233
Glucose	Gibco	15023-021
Glutamate	Sigma	G1626
Glutaraldehyde 25% Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	16210
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP	Invitrogen	62-6520
GraphPad Prism v10.6.1	GraphPad Software	-	Software di analisi statistica/regressione logaritmica
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail 100X	Thermo Scientific	78442
HEPES	Biological Industries	41-122-100
Histone H3 (1G1)	Santa Cruz	sc-517576
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570
ImageJ v1.54s	NIH	-	Software di analisi delle immagini delle gocce lipidiche
Immun-Blot PVDF Membrane	BioRad	1620177
Indomethacin	Sigma	I7378
Insulin syringe	Cranberry	AAJECIN3	Utilizzato per l'omogeneizzazione cellulare; fornitore/catalogo non fornito
KCl	Calbiochem	529552
KH2PO4	Calbiochem	529568
KHCO3	Sigma	60339
LAMP-1 Antibody	Abcam	ab25245
Lane Marker Reducing Sample Buffer	Thermo Scientific	39000
Malate	Sigma	M1000
MgCl2	Calbiochem	208291	Componente della soluzione per il test mitocondriale; fornitore/catalogo non