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Articolo di ricerca
Il sesquiterpeno lattone XTT attenua efficacemente le risposte infiammatorie indotte da lipopolisaccaridi (LPS) nei macrofagi. L'XTT prende di mira l'IKKα/β per inibire la segnalazione di NF-κB senza influenzare l'attivazione di MAPK, esercitando così potenti effetti antinfiammatori in vitro.
La disregolazione della cascata del fattore nucleare-κB (NF-κB) è strettamente legata alla progressione dei disturbi infiammatori. Le chinasi IκB (IKK) sono ben consolidate come modulatori centrali dell'attività del NF-κB, rendendole candidati terapeutici interessanti per il trattamento delle patologie infiammatorie. Il lattone sesquiterpene 1β-idrossil-5α-cloro-8-sxanthatin (XTT) è stato documentato per esercitare robusti effetti anticancerosi. Tuttavia, la sua attività antinfiammatoria e i meccanismi molecolari sottostanti rimangono poco chiari. In questo lavoro, XTT ha soppresso in modo marcato la sintesi di ossido nitrico (NO) e prostaglandina E2 (PGE 2) nei macrofagi RAW264.7 attivati da lipopolisaccaridi (LPS). XTT ha inoltre ridotto notevolmente i livelli di mRNA innescati da LPS come la sintasi inducibile di ossido nitrico (iNOS), cicloossigenasi-2 (COX2), fattore di necrosi tumorale α (TNF-α), interleuchina-1β (IL-1β) e interleucina-6 (IL-6). Inoltre, XTT ha ridotto i livelli proteici di iNOS e COX2 evocati dal trattamento con LPS. A livello meccanicistico, XTT non ha modificato in modo significativo l'attività della cascata della proteina chinasi attivata dal mitogeno (MAPK). Al contrario, XTT ha fortemente bloccato la fosforilazione e la degradazione inibitoria di κBα (IκBα) innescata da LPS interagendo con IKKα/β, compromettendo così la traslocazione nucleare NF-κB. Questi dati sono considerati insieme, che XTT provoca forti effetti antinfiammatori in vitro mirando su IKKα/β e bloccando la segnalazione di NF-κB. Questi risultati suggeriscono che l'XTT possa rappresentare un promettente composto principale per lo sviluppo di agenti antinfiammatori. Sono necessari ulteriori studi biochimici e in vivo per validare l'inibizione diretta di IKKα/β e il potenziale terapeutico.
L'infiammazione è un processo biologico strettamente regolato che permette agli organismi di rispondere a infezioni, lesioni tissutali e altre sfideambientali. Sebbene le risposte infiammatorie acute siano generalmente protettive, l'attivazione persistente delle vie infiammatorie può alterare l'omeostasi tissutale e contribuire all'insorgenza e alla progressione di disturbi cronici, tra cui la malattia infiammatoria intestinale (IBD) e l'artrite reumatoide (AR)2. Numerose reti di segnalazione intracellulare partecipano alla regolazione infiammatoria, tra cui la via del fattore nucleare-κB (NF-κB) è una delle piùstudiate 3.
I membri della famiglia NF-κB, tra cui p50, p52, p65 (RelA), RelB e c-Rel, funzionano come fattori di trascrizione dimerica che regolano l'espressione dei geni coinvolti nell'immunità enell'infiammazione 4,5. In condizioni basali, i dimeri NF-κB rimangono inattivi nel citoplasma grazie all'associazione con inibitori delle proteine κB (IκB). Dopo la stimolazione da parte di mediatori infiammatori come il lipopolisaccaride (LPS) o il fattore di necrosi tumorale α (TNF-α), il complesso IκB chinasi (IKK) si attiva e fosforila IκBα, causando la sua ubiquitinazione e degradazione. Questo processo permette ai complessi NF-κB di accumularsi nel nucleo e di avviare la trascrizione di mediatori infiammatori ecitochine 6. Poiché un'attivazione eccessiva o sostenuta di NF-κB è strettamente associata a una varietà di malattie infiammatorie e autoimmuni, l'intervento farmacologico a livello di segnalazione IKK ha suscitato notevoleinteresse 7,8,9.
I prodotti naturali sono da tempo fonti vitali per lo sviluppo di farmaci, inclusi i farmaciantinfiammatori. 1β-idrossil-5α-cloro-8-epi-sxanthatin (XTT) è un lattone sesquiterpenico isolato da Xanthium sibiricum11,12. Ricerche precedenti hanno dimostrato che XTT sopprime la proliferazione cellulare e scatena l'apoptosi nelle cellule epatocellulari umane tramite l'attivazione di ERK/p38 MAPK mediata da ROS e l'inibizione di JAK2/STAT3 causata dalla deplezione delglutatione 13. Tuttavia, il potenziale antinfiammatorio dell'XTT e i suoi meccanismi molecolari associati sono ancora poco compresi.
I risultati attuali indicano che l'XTT presenta notevoli effetti antinfiammatori in vitro. Le indagini meccanicistiche indicano che l'XTT interagisce con l'IKKα/β e sopprime la segnalazione di NF-κB, inibendo così le risposte infiammatorie nei macrofagi attivati. Questi risultati suggeriscono che XTT possa rappresentare un promettente composto lead per lo sviluppo di agenti antinfiammatori.
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Questo studio ha coinvolto solo linee cellulari commerciali consolidate e non ha incluso partecipanti umani, campioni clinici o esperimenti sugli animali. Pertanto, non era richiesta l'approvazione etica istituzionale e il consenso informato. Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con le linee guida di sicurezza dei laboratori istituzionali. I reagenti pericolosi venivano gestiti in cappe elettriche designate, con l'uso di dispositivi di protezione individuale (DPI) appropriati. I rifiuti chimici e biologici venivano smaltiti secondo le normative istituzionali. Le sostanze chimiche, i kit e i reagenti utilizzati nel protocollo sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Coltura cellulare
I macrofagi murini RAW264.7, le cellule HeLa del carcinoma cervicale umano e HEK293T cellule renali embrionali umane sono stati acquistati dalla Banca Cellulare dell'Accademia Cinese delle Scienze (Shanghai, Cina). Tutte le cellule sono state mantenute nel Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco, contenente il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di penicillina-streptomicina. L'ambiente di coltura era fissato a 37 °C con il 5% di CO₂ e umidità satura.
2. Saggio di vitalità cellulare
La vitalità cellulare è stata valutata tramite un saggio Cell Counting Kit-8 (CCK-8). RAW264,7 cellule (2,5 × 104 cellule/pozzo) sono state placcate in piastre da 96 pozzi e coltivate durante la notte a 37 °C. Le cellule sono state poi trattate con concentrazioni variabili di XTT per 24 ore, con o senza LPS (0,5 μg/mL). La concentrazione di LPS e la durata del trattamento sono state ottimizzate negli esperimenti preliminari per indurre risposte infiammatorie moderate senza causare citotossicità significativa. Successivamente, furono aggiunti 10 μL di reagente CCK-8 a ciascun pozzo e la lastra fu mantenuta a 37 °C per 2 ore. L'assorbanza è stata misurata a 540 nm utilizzando un lettore di microplacche.
3. Determinazione dei livelli di NO e PGE₂ nel mezzo di coltura cellulare
Le celle RAW264,7 sono state placcate in piastre a 24 pozzi con una densità di 2,5 × 105 celle per pozzo e coltivate durante la notte a 37 °C. Le cellule sono state pre-trattate con XTT per 2 ore prima della stimolazione LPS o TNF-α (15 ng/mL) per ulteriori 24 ore. Il periodo pre-trattamento di 2 ore è stato scelto per consentire un'adeguata interazione tra XTT e bersagli cellulari prima della sfida infiammatoria. I livelli di ossido nitrico (NO) e prostaglandine E₂ (PGE₂) nel mezzo di coltura sono stati quantificati seguendo i protocolli del produttore.
4. Reazione a catena quantitativa in tempo reale della polimerasi (qRT-PCR)
Le RAW264,7 cellule (2 × 106 cellule) sono state impiattate in piastre a 6 pozzi durante la notte e pretrattate con varie dosi di XTT per 2 ore prima della sfida LPS (0,5 μg/mL) per 24 ore. L'RNA totale è stato isolato usando il reagente TRIzol secondo le istruzioni del produttore. La concentrazione e la purezza dell'RNA sono state valutate utilizzando uno spettrofotometro, e per le analisi a valle sono stati utilizzati campioni con rapporti A260/A280 >1,8.
L'RNA totale (2 μg) è stato trascritto inversamente in cDNA in un volume di reazione finale di 20 μL utilizzando un kit di sintesi del cDNA. La PCR quantitativa in tempo reale è stata eseguita utilizzando la chimica SYBR Green su un sistema di rilevamento PCR in tempo reale. Le sequenze di primer erano le seguenti:
iNOS avanti: 5′-GGA TCT TCC CAG GCA ACC A-3′
Retromarcia iNOS: 5′-AAT CCA CAA CTC GCT CCA AGA TT-3′
COX2 in avanti: 5′-CAA CAC CTG AGC GGT TAC-3′
COX2 retromarcia: 5′-GTT CCA GGA GGA TGG AGT-3′
IL-1β in avanti: 5′-GCC TTG GGC CTC AAA GGA AAG AAT C-3′
IL-1β retromarcia: 5′-GGA AGA CAC AGA TTC CAT GGT GAA G-3′
IL-6 in avanti: 5′-TGG AGT CAC AGA AGG AGT GGC TAA G-3′
IL-6 retro: 5′-TCT GAC CAC AGT GAG GAA TGT CCA C-3′
TNF-α avanti: 5′-CAC CAC GCT CTT CTG TCT-3′
TNF-α retro: 5′-GGC TAC AGG CTT GTC ACT C-3′
GAPDH Attaccante: 5′-TGC ACC AAC TGC TTA GC-3′
GAPDH retromarcia: 5′-GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG-3′
La procedura di amplificazione PCR è stata eseguita come: denaturazione iniziale a 95 °C per 5 minuti, seguita da 39 cicli a 95 °C per 15 secondi e 60 °C per 30 secondi. I livelli relativi di espressione genica sono stati calcolati utilizzando il metodo 2−ΔΔCt con il GAPDH come controllo interno.
5. Western blotting
Dopo il trattamento, le cellule RAW264.7 sono state omogeneizzate in un tampone RIPA contenente inibitori di proteasi e fosfatasi. Questi inibitori venivano preparati freschi immediatamente prima dell'uso per prevenire la degradazione e la defosforilazione delle proteine. I livelli proteici totali sono stati quantificati utilizzando un kit di test BCA. Quantità uguali di proteine sono state separate tramite elettroforesi in gel dodecil solfato di sodio e poliacrilammide al 10% e trasferite sulle membrane della nitrocellulosa. Dopo il trasferimento, le membrane sono state incubate con latte scremato al 5% preparato in TBST contenente Tween-20 (TBST) per la bloccazione, e poi sondate con anticorpi primari (diluizione 1:1.000) durante la notte a 4 °C. Le membrane sono state poi esaminate con anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano (diluizione 1:5.000) per 1 ora a temperatura ambiente. Le bande proteiche sono state rilevate tramite un sistema di rilevamento della chemiluminescenza e le intensità delle bande sono state analizzate tramite quantificazione densitometrica.
6. Saggio di immunofluorescenza
Le cellule HeLa sono state seminate in piastre a 6 pozzi e pretrattate con XTT (8 μM) per 4 ore prima della stimolazione TNF-α (15 ng/mL) per 30 minuti. Questo periodo di pre-incubazione di 4 ore è stato scelto per massimizzare l'ingaggio del bersaglio prima dell'attivazione di NF-κB. Le cellule sono state fissate con paraformaldeide al 4% per 15 minuti e permeabilizzate con Triton X-100 allo 0,25% per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo il blocco con albumina sirica bovina al 2% (BSA) e siero di capra al 10% diluiti in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), le cellule sono state incubate con un anticorpo primario anti-p65 (diluizione 1:250) durante la notte a 4 °C, seguite da una sondazione con un anticorpo secondario coniugato TRITC (diluizione 1:1.000) per 1 ora a temperatura ambiente. I nuclei sono stati controcolorati con DAPI (0,5 μg/mL) per 5 minuti al buio. Le immagini di fluorescenza sono state catturate utilizzando un microscopio a fluorescenza. Le cellule HeLa sono state selezionate perché il loro alto rapporto citoplasma/nucleo facilita la visualizzazione della traslocazione nucleare p65.
7. Frazionamento citoplasmatico e nucleare
Le cellule HeLa sono state pre-incubate con XTT per 4 ore e poi stimolate con TNF-α (15 ng/mL) per 30 minuti. Le cellule venivano raccolte, risciacquate con PBS freddo e processate per l'estrazione di proteine citoplasmatiche e nucleari utilizzando un kit commerciale di estrazione di proteine nucleari e citoplasmatiche secondo le istruzioni del produttore. Tutte le procedure sono state eseguite su ghiaccio per preservare l'integrità proteica.
8. Saggio di spostamento termico cellulare (CETSA)
CETSA si è svolto come descrittoin precedenza il 14. Circa 1 × 107 cellule HeLa sono state raccolte e risospese in 500 μL di inibitori proteasi contenenti PBS fredda, quindi lisate tramite tre cicli di congelamento-disgelo in azoto liquido. I lisati cellulari sono stati centrifugati a 20.000 × g per 15 minuti a 4 °C. I soprannatanti risultanti sono stati allicitati in due gruppi equamente e trattati con XTT (100 μM) o DMSO per 1 ora a temperatura ambiente. XTT (100 μM) è stato applicato per aumentare la sensibilità al rilevamento negli esperimenti CETSA. I campioni sono stati poi aliquotati in sette tubi e riscaldati alle temperature indicate per 3 minuti, seguiti da incubazione a temperatura ambiente per altri 3 minuti. Frazioni proteiche solubili sono state raccolte per l'analisi immunoblottante.
9. Aggancio molecolare
L'analisi dell'aggancio molecolare è stata effettuata come descrittoin precedenza 14. Le strutture cristalline di IKKβ (ID PDB: 3BRT e 4KIK) sono state recuperate dalla Protein Data Bank (PDB). Le strutture proteiche sono state pre-processate con PyMOL (versione 2.3.4) per rimuovere molecole d'acqua, liganti originali e impurità, seguita dall'aggiunta degli atomi di idrogeno. Le cariche di Gasteiger venivano calcolate e le tasche attive venivano identificate usando AutoDock Tools (versione 1.5.6). Le strutture proteiche venivano poi memorizzate in formato PDBQT.
La struttura XTT è stata generata in Chem3D (versione 15.1) e ottimizzata tramite minimizzazione energetica. Il docking semi-flessibile veniva eseguito utilizzando AutoDock Vina (versione 1.1.2). Le scatole a griglia furono costruite per coprire completamente le tasche attive, mentre tutti gli altri parametri rimasero alle impostazioni predefinite. Sono state selezionate per l'analisi pose di attracco con le energie di legame più basse e le conformazioni più stabili. Le energie di legame inferiori a −5 kcal/mol sono state considerate indicative di una forte affinità di legame secondo i criteri pubblicati. PyMOL è stato inoltre impiegato per visualizzare le modalità di legame e valutare i legami a idrogeno, le interazioni idrofobiche, le interazioni di van der Waals e i potenziali siti di legame.
10. Analisi statistica
Tutte le analisi statistiche sono state condotte utilizzando il software GraphPad Prism 5.0. I dati sono presentati come l'errore medio ± standard della media (SEM) da tre esperimenti indipendenti. La significatività statistica è stata valutata utilizzando un'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) seguita dal test post hoc di Dunnett. Un valore di p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
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XTT inibiva la produzione di NO e PGE₂ nei macrofagi RAW264.7 stimolati da LPS o TNF-α
Per determinare se gli effetti antinfiammatori di XTT fossero indipendenti dalla citotossicità, è stata valutata la vitalità cellulare di RAW264.7 dopo il trattamento con XTT in presenza o assenza di LPS. Non è stata rilevata alcuna riduzione significativa della vitalità cellulare a concentrazioni comprese tra 0,5 e 8 μM, indicando che il composto era ben tollerato nelle condizioni ...
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I lattoni sesquiterpeni sono una classe di prodotti naturali con diverse attività farmacologiche, tra cui effetti antisettici, antinfiammatori, antipiretici edetoxificanti 15. Studi precedenti hanno dimostrato che XTT, un lattone sesquiterpenico di tipo xantanolide isolato da Xanthium sibiricum, mostra potenti effetti antiproliferativi e pro-apoptotici nelle cellule epatocellulariumane del carcinoma 13. Questo lavoro ha valutato le...
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Gli autori dichiarano di non avere interessi in conflitto.
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (n. 82004031), dal Progetto di Ricerca sull'Amministrazione Provinciale della Medicina Tradizionale Cinese del Sichuan (n. 2024MS566) e dal National Key Research and Development Program della Cina (n. 2023YFC3504402).
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Enhanced chemiluminescence reagent D20A2:D21A2:D22A2:D23A2: D24A2:D25A2:D26A2:D27A2:D28A2: D29A2:D30A2:D29 | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P90720 | rilevazione del segnale luminescente |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated secondary antibodies | Signalway Antibody (Nanjing) | L30118 | si lega specificamente all'anticorpo primario |
| p65 primary antibody | Bioworld | BS4139 | riconosce specificamente la subunità proteica NF-κB p65 |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | SCR_018042 |
| 0.45 μM Ployvinylidence fluoride membrane | Millipore | PR05509 | adsorbe molecole proteiche |
| 1β-hydroxyl-5α-chloro-8-epi-xanthatin | Chengdu Institute of Biology | composti monomerici naturali | |
| All-in-One cDNA Synthesis SuperMix | Bimake (Shanghai) | B24408 | retro-trascrivere |
| BAY11-7082 | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | SF0011 | inibitore IκB/IKK |
| Bcl2 antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 32012 | AB_3751037 |
| Bicinchoninic Acid (BCA) kit | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0010S | quantificazione delle proteine totali |
| CCK-8 agent | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | C0038 | misura della vitalità cellulare |
| Chemiluminescence detection system | Millipore, Bedford, USA | P90720 | acquisizione ed elaborazione dei segnali luminescenti |
| COX-2 antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 33345 | AB_3676692 |
| DMSO | Sangon Biotech(Shanghai)Co.,Ltd. | A100231-0500 | solubilizzare composti |
| GAPDH antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 41549 | AB_3751036 |
| Gel Imaging Instrument | E-BLOT | Touch Imager Pro | acquisizione e analisi delle immagini |
| Gradient PCR instrument | Biometra TADVANCED | Biometra Tadvanced 96SG | temperatura di annessione gradiente |
| Griess agent | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | S0021S | quantificazione del NO |
| Human cervical carcinoma HeLa cells | The Cell Bank of Chinese Academy of Sciences | SCSP-504 | cellule derivate dall'uomo |
| Human TNF-α | Novus Biologicals | 210-TA | citochine pro-infiammatorie |
| iNOS antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 48309 | AB_2943634 |
| Laser Confocal Inverted Microscope | Olympus | FV1000 | SCR_016840 |
| LPS ( E.coli 055:B5) | Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd | L6529 | stabilire modelli infiammatori |
| Murine macrophage RAW264.7 cells | The Cell Bank of Chinese Academy of Sciences | SCSP-5036 | cellule derivate dal topo |
| Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0027 | separare le proteine citoplasmatiche e nucleari |
| PD98059 | Selleck Chemicals (Shanghai) | S1177 | inibitore MEK |
| P-ERK (Thr202/Thr185) antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 12548 | rilevare il livello di fosforilazione della proteina ERK |
| p-IKKα/β (Ser176/Ser177) antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 11931 | AB_3751034 |
| p-IκBα (phospho-Ser32)antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 13776 | AB_3751033 |
| p-JNK (T183/T221) antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 13371 | AB_3718662 |
| p-p38 MAPK (Thr180) antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 11581 | AB_3751032 |
| Prostaglandin E2 Parameter Assay Kit | R&D Systems | KGE004B | AB_2894942 |
| PS1145 | Selleck Chemicals (Shanghai) | S7691 | inibitore IKK specifico |
| Rapid SDS-PAGE Gel Preparation Kit | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0018S | separazione delle proteine |
| Real-Time PCR System | Bio-Rad | CFX96 | SCR_018064 |
| RIPA buffer | Bimake (Shanghai) | P0013C | lisi cellulare |
| SB203580 | Selleck Chemicals (Shanghai) | S1076 | inibitore p38 MAPK |
| SP600125 | Selleck Chemicals (Shanghai) | S1460 | inibitore JNK |
| SYBR Green | Bimake (Shanghai) | B21202 | Per la quantificazione in tempo reale |
| TRITC-conjugated goat anti-mouse IgG | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | A0568 | AB_2893016 |
| TRITC-conjugated second antibody | Beijing Baiao Leibo Technology Co., Ltd. | ZN1992 | AB_3751143 |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | isolamento di RNA totale |
| Vinculin antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 41534 | AB_3751035 |