Citometria a flusso multicentrico per la malattia residua misurabile della leucemia mieloide acuta con LAIP/DfN e popolazioni arricchite da cellule staminali leucemiche CD34+CD38

Sommario

Questo protocollo descrive un flusso di lavoro multicentrico per la quantificazione misurabile della malattia residua della leucemia mieloide acuta, utilizzando l'analisi immunofenotipica/diversa dalla norma (LAIP/DfN) associata alla leucemia e popolazioni arricchite di cellule staminali leucemiche definite fenotipicamente in CD34⁺CD38⁻ .

Abstract

Il follow-up della malattia residua misurabile (MRD) è raccomandato per la valutazione della risposta al trattamento negli studi clinici sulla leucemia mieloide acuta (LMA) secondo le linee guidaguida ELN 2025. L'obiettivo di questo studio era implementare un follow-up standardizzato dei pazienti utilizzando un approccio armonizzato di flusso MRD in 30 laboratori di ematologia francesi partecipanti a studi clinici sulla LMA. Per ottenere risultati comparabili, la rete ha stabilito raccomandazioni dalle procedure di laboratorio umido ai rapporti clinici. Abbiamo progettato un pannello a 3 tubi con marcatori comuni obbligatori di 8 colori per tubetto, secondo le raccomandazioni ELN, per identificare i pattern immunofenotipici associati alla leucemia/diverso dalla norma (LAIP/DfN) nelle cellule di massa e nelle popolazioni arricchite di cellule staminali leucemiche (LSC) nella frazione CD34⁺CD38⁻ . È stata utilizzata una spina dorsale composta da CD34/CD38/CD45/CD117, completata da marcatori di linea per il primo tubo, marcatori associati al LSC per il secondo tubo e marcatori monocitotici e di differenziazione per il terzo tubo. Questo pannello può essere utilizzato in formati a 8, 10 e 12 colori e implementato su più piattaforme convenzionali di citometri a flusso. Proponiamo impostazioni del citometro di flusso adattate a ciascuna piattaforma.

L'armonizzazione della sensibilità tra le quattro piattaforme è stata effettuata utilizzando perline arcobaleno a 8 picchi. L'immunocolorazione è stata eseguita dopo la lisi di massa. Per rilevare il bias tra le piattaforme, l'indice di colorazione è stato testato utilizzando campioni freschi di midollo osseo sano in parallelo sulle quattro piattaforme. Campioni regolari di controllo della qualità del midollo osseo sono stati condivisi tra i laboratori per la valutazione esterna della qualità umida (EQA) al fine di verificare tutte le fasi del protocollo. Infine, la standardizzazione della strategia di analisi dei dati ottenuta nei centri è stata valutata utilizzando l'EQA secco condividendo i file dati MRD FCS. La fattibilità di questo approccio multicentrico richiede l'armonizzazione della sensibilità degli strumenti e della preparazione del campione, nonché la formazione e l'educazione sistematica degli operatori analitici.

Introduzione

La malattia residua misurabile (MRD) si riferisce al piccolo numero di cellule leucemiche che persistono durante o dopo il trattamento e sono non rilevabili dalla morfologia, in particolare nei casi di remissione completa con blasti inferiori al 5% nel midollo osseo. Il monitoraggio della MRD è raccomandato per la valutazione della risposta al trattamento negli studi clinici sulla leucemia mieloide acuta (LMA) secondo le linee guida ELN^{2025 1}. Oltre ai metodi di biologia molecolare, tra cui la trasscrittasi inversa PCR (RT-qPCR) e il sequenziamento di nuova generazione (NGS), la citometria a flusso multiparametrico (MFC) è un approccio^{comunemente utilizzato 2}.

Per ottenere risultati coerenti sull'MRD, in particolare negli studi clinici, sono possibili due strategie: centralizzare la misurazione dell'MRD in un unico laboratorio o implementare un protocollo che garantisca la riproducibilità tra i diversi laboratori coinvolti nella determinazione dell'MRD. Il numero di campioni, la dimensione dello studio e la capacità dei laboratori di processare volumi di campioni più grandi o più piccoli possono determinare la scelta tra queste strategie. Se si sceglie una strategia multicentrica, devono essere affrontate le differenze tra le piattaforme citometriche e la necessità di analisi comparabili tra i siti.

A tal fine, descriviamo un approccio standardizzato di flusso MRD multicentrico e multipiattaforma che combina analisi immunofenotipica associata alla leucemia/diverso dalla norma (LAIP/DfN) e la rilevazione arricchita da cellule ^staminali leucemiche (LSC) definita fenotipicamente, implementata in 30 laboratori di ematologia francesi basandosi sulle raccomandazioni ELN e sui rapporti ^{precedenti 3,4}.

La citometria a flusso consente la definizione, al momento della diagnosi, della "firma" della leucemia che incorpora l'espressione specifica dei marcatori sui blastogeni del paziente: LAIP. Dopo il trattamento, il flusso MRD consente il monitoraggio dei LAIP identificati al momento della diagnosi. Poiché i blasti leucemici possono evolversi e modificare il loro immunofenotipo sotto pressione terapeutica, una seconda strategia deve essere implementata sistematicamente: l'approccio DfN, che si basa sull'identificazione delle cellule con caratteristiche che le differenziano dall'ematopoiesi normale. Questa tecnica può anche rilevare la comparsa di nuovi marcatori sui blastogeni durante il decorso della malattia e il suo trattamento.

Nel gruppo di flusso AML francese, il disegno del panel si basava sullo studio precedentemente pubblicato di HOVON sulla definizione dei pattern delle cellule leucemiche. Non esiste un LSC universale né un marcatore LAIP, quindi abbiamo progettato un pannello a 3 tubi che consente l'identificazione simultanea delle popolazioni arricchite da LAIP, DfN e CD34⁺CD38⁻ arricchite da LSC. Una colonna dorsale basata su CD34/CD38/CD45/CD117 è stata utilizzata in tutte le valvole, completata da marcatori di linea nel primo tubo, marcatori associati al LSC nel secondo tubo e marcatori di linea o differenziazione monocitotica nel terzo tubo per completare la definizione LAIP in AML con blasti monocitotici. Tutte e tre le tubette vengono acquisite alla diagnosi e nei campioni di follow-up.

Data la fisiopatologia della leucemogenesi, l'attenzione si è spostata dallo studio del blast bulk all'identificazione della frazione più immatura come popolazioni arricchite da cellule staminali leucemiche. Dick e colleghi hanno dimostrato l'eterogeneità della leucemia descrivendo le LSC CD34⁺CD38⁻ con il potenziale di generare leucemia in topi^{immunodeficienti 5,6}. Nella quantificazione delle LSC alla diagnosi e al follow-up, si stanno facendo sforzi per standardizzare i panel di anticorpi e le strategie di analisi all'interno del gruppo di lavoro ELN^{DAVID 1,7}. Attualmente, due pannelli, HOVON e ALFA, utilizzano marcatori dicotomici LSC per distinguere le popolazioni arricchite da LSC dalle cellule staminali ematopoietiche normali nello spazio^CD34+CD38^{− 8,9}.

Il metodo qui descritto combina la preparazione standardizzata del campione, la progettazione comune del pannello di anticorpi, impostazioni di sensibilità adattate alla piattaforma, analisi arricchita con LSC per LAIP/DfN e CD34⁺CD38⁻ , valutazione esterna della qualità e segnalazione clinica armonizzata per il monitoraggio multicentrico del flusso di MRD AML.

Protocollo

Il protocollo segue le raccomandazioni e le linee guida dei comitati etici dei Centri Ospedalieri Universitari Francesi. Tutti i pazienti firmavano il consenso informato secondo la legislazione francese. Il protocollo di studio è stato approvato dal Comitato Etico Umano della CHU Lione e dal Comitato Etico del Consiglio di Revisione Istituzionale della CHU di Lille in conformità con la Dichiarazione di Helsinki (osservatorio HDF-AML, CNIL 2214454v0). Per l'allograft, i donatori sono stati inclusi nel database europeo Internet ProMISE e hanno fornito un consenso informato per la raccolta dei loro dati personali. L'estrazione e l'analisi dei dati sono state effettuate in conformità con il Comitato Etico locale (CNIL2093819). Tutti i file di flusso FCS utilizzati per la revisione della rete erano completamente anonimizzati tramite uno script Python.

1. Impostazione del citometro

1. Determinare i valori target adattati a ciascun citometro utilizzando perle arcobaleno a 8 picchi.
2. Imposta ogni macchina secondo i valori target mostrati nella Tabella 1. Assicurati che ogni canale raggiunga il valore target ± 5%. Verifica sistematicamente questa impostazione per mantenere la sensibilità longitudinale di ogni piattaforma.
3. Stabilire la matrice di compensazione utilizzando tubi a singola colorazione per ogni anticorpo, utilizzando perle di compensazione e/o cellule a seconda di ciascuna piattaforma.
4. Salva la matrice di impostazione e compensazione come test o protocollo identificato come MRD LAIP/DfN, LSC e MonoGran (T1, T2, T3). Utilizzare questo saggio o protocollo per l'acquisizione per la quantificazione del flusso AML MRD.

2. Procedura di laboratorio umido

1. Aspirato di midollo osseo
   1. Raccogliere 1-2 mL di midollo osseo di EDTA alla diagnosi e nei momenti di monitoraggio, inclusi MRD1, MRD2, MRD3, MRD4 e ricadute.
   2. Inviare i tubi al laboratorio di flusso di riferimento entro 24-48 ore.
2. Preparazione del test del midollo osseo per l'esame morfologico
   1. Metti una goccia di midollo osseo aspirato su un vetrino di vetro. Spargere delicatamente il campione usando un copertino o un altro vetrino.
   2. Dopo 30 minuti di asciugatura, tingi la spalmatura con May-Grünwald-Giemsa (Lime Supplementare 1).
3. Lisi di bulk
   1. Aggiungi 15 mL di soluzione lisante NH₄Cl a 1-2 mL di campione di midollo osseo. Mescola delicatamente e incuba per 10 minuti a temperatura ambiente.
   2. Centrifugare a 450 × g a temperatura ambiente per 5 minuti e scartare il soprandatante.
   3. Risospendere la pellet cellulare in 10 mL di PBS/0,1% BSA. Centrifugare a 450 × g a temperatura ambiente per 5 minuti e scartare il soprantantante.
   4. Risospendere la pellet cellulare a una concentrazione di 30 × 10⁶ globuli globuli (WBC/mL) in PBS.
4. Immunocolorazione della sospensione cellulare
   1. Distribuire gli anticorpi monoclonali nei tubi T1, T2 e T3 secondo la piattaforma (Tabella 2). Fornisci il clone, il volume, il riferimento del catalogo e il fornitore per ciascun anticorpo in una tabella degli anticorpi.
      NOTA: Per ogni tubo che utilizza coloranti viola brillante, usa il buffer di colorazione brillante prima di aggiungere gli anticorpi.
   2. Aggiungi 2-3 ×10⁶ celle lisate per tubo in 100 μL di sospensione cellulare. Incubare le cellule con gli anticorpi per 15 minuti al buio a temperatura ambiente.
   3. Lava le cellule con 3 mL di PBS. Centrifuga per 5 minuti a 450 × g e scarta il soprantantante.
   4. Risospendere le cellule colorate a 300 μL di PBS.
      NOTA: Possono essere utilizzati cocktail di anticorpi premiscelati o tubi di anticorpi secchi validati.

3. Acquisizione del citometro a flusso

1. Apri il protocollo di analisi o acquisizione MRD con la matrice di impostazione e compensazione adattata per la misurazione MRD LAIP/DfN e LSC.
2. Acquisire un minimo di 500.000-1.000.000 di globuli globuli in ciascun tubo alla diagnosi e nei campioni di follow-up MRD per migliorare il clustering delle cellule MRD e la fiducia nella MRD a basso livello.
   NOTA: Per la misurazione degli LSC, acquisire un minimo di 1.000.000 di globuli nel Tubo 2 per ottenere una sensibilità adeguata per la quantificazione delle LSC (LOQ 0,002% e LOD 0,001%^)10,11.
3. Salva i file dati FCS dai campioni di diagnosi e MRD. Annotare la data di acquisizione e l'identificazione del paziente per facilitare il follow-up dell'analisi MRD e LSC.

4. Strategia di analisi

1. Utilizzare un modello comune e una sequenza comune di dot-plot che incorpori una strategia di gating armonizzata predefinita adattata al software di analisi utilizzato in ogni centro.
2. Applicare la strategia di gating per identificare le cellule leucemiche utilizzando tre approcci: LAIP, DfN e analisi LSC ^{nella frazione} CD34⁺CD38-.
3. Identificare ed escludere potenziali eventi aspecifici e popolazioni fisiologiche normali, inclusi basofili, cellule plasmacitoidi dendritiche, ematogoni, plasmocellule, eritroblasti, grumi piastrinosi, detriti ed eritrociti non lisati.

5. Definizione di LAIP/DfN e popolazioni fisiologiche

1. Per catturare LAIP in esplosioni massive, disegna un gate a singola cella basato su FSC-W contro FSC-H.
2. Disegna un gateway di celle vive basato su FSC rispetto a SSC.
3. Disegna una porta di emergenza su^{un dim}/SSC CD45.
4. Disegna la porta di segnali primitiva usando CD34/CD117.
5. Utilizzare grafici biparametrici fissi per disegnare le porte LAIP rilevanti, inclusi LAIP1, LAIP2, LAIP3, LAIP4, LAIP5, LAIP6, LAIP7 e LAIP8.
6. Popolazioni fisiologiche
   1. Ematogoni a gate usando la seguente sequenza: cellule vive, MNC sul grafico FSC/SSC, grafo del punto CD19/SSC e grafico del punto CD34/CD38. Back-gate usando CD45/SSC.
   2. Basofili gate che utilizzano la seguente sequenza: cellule vive, MNC sul dot plot FSC/SSC, CD123/CD45RA (CD123⁺⁺CD45RA^-), escludendo gli ematogoni CD19⁺ . Back-gate usando CD45/SSC.
   3. Cellule dendritiche plasmacitoidi gate utilizzando la seguente sequenza: cellule vive, MNC sul dot plot FSC/SSC, CD123/CD45RA (CD123⁺⁺CD45RA⁺), escludendo gli ematogoni CD19⁺ . Back-gate usando CD45/SSC.
   4. Identificare eritroblasti, gruppi piastrinosi, detriti ed eritrociti non lizzati utilizzando il dot plot CD36/CD45. Back-gate usando CD45/SSC e FSC/SSC.
7. Approccio LAIP
   1. Definire MRD in AML primitivo CD34⁺ O CD117⁺ usando operatori booleani come segue: LAIP1 E LAIP2 E LAIP3 E LAIP4 E LAIP5 E LAIP6 E LAIP7 E LAIP8 E NON puliti CD36^bright+/CD45 E celle singole E celle vive E marcatori primitivi CD34^+/CD117^+/ E (Cancellazione di Blocco CD45/SSC O MNC CD34⁺) (Figura 1).
   2. Definisci MRD in CD34-CD117^- AML usando operatori booleani come segue: LAIP1 E LAIP2 E LAIP3 E LAIP4 E LAIP5 E LAIP6 E LAIP7 E LAIP8 E NON puliti CD36^bright+/CD45 E single celle E celle vive E CD34CD117 E CD45/SSC blast gate (Figura 2).
8. Approccio DfN
   1. Utilizzare lo stesso modello dell'approccio LAIP e applicare lo spazio vuoto definito sui campioni di midollo osseo di riferimento (Tabella 3).
   2. Definire le popolazioni anomale quando il gruppo di cellule anomale è separato dalle cellule normali di 0,5 decenni sulla scala^{logaritmica 12}.
   3. Per catturare DfN in blast di massa, estrai celle vive usando FSC/SSC.
   4. Disegna le singole celle rimuovendo i doppietti in base al picco/area SSC del FSC.
   5. Disegna il gate MNC usando FSC/SSC.
   6. Applicare una cancella di pulizia per rimuovere i linfociti usando CD45/CD36/SSC.
   7. Applica una gatta di pulizia per rimuovere eritroblasti e detriti usando CD45/CD36.
   8. Utilizzare due porte di ingresso, CD34⁺/CD45/SSC e CD117⁺/CD45/SSC, per definire le caselle vuote secondo le pubblicazioni^{precedenti 12,13}.
   9. Preleva ogni scatola vuota di DfN in base alle popolazioni di controllo interno, inclusi linfociti per i marcatori di linea incrociata e precursori mieloidi normali per perdita, diminuzione o iperespressione.
   10. Confronta le scatole vuote con campioni di midollo osseo di riferimento, inclusi midollo osseo rigenerante, infiammatorio e sano del donatore.

6. Definizione della popolazione LSC CD34⁺CD38^-

1. Identificare le cellule arricchite di LSC alla diagnosi nello spazio CD34⁺CD38^- basandosi sui marcatori LSC con espressione dicotomica e assenza di espressione nelle cellule staminali ematopoietiche normali dal midollo osseo sano.
2. Definire la porta di ingresso LSC come MNC34⁺ usando la seguente sequenza di gate: celle vive, celle singole, MNC e CD34⁺ nel dot plot CD45/CD34.
3. Definire la frazione CD34⁺CD38^- (P6) utilizzando una soglia rigorosa basata sul livello di fluorescenza meno uno (FMO) del CD38.
4. Definire le celle arricchite con LSC nel Tubo 1 nella frazione P6 usando operatori booleani come segue: P6CD7⁺ O P6CD33⁺ O P6CD19⁺ O P6CD56⁺ E NON pulite CD36^{bright CD+} e single cell e celle vive E MNC E MNC CD34⁺.
5. Definire le celle arricchite da LSC nel Tubo 2 nella frazione P6 usando operatori booleani come segue: P6CD45RA⁺ O P6MIX⁺ O P6CD123⁺ E NON pulite CD36^bright+ e single cell E celle live E MNC E MNC CD34⁺.
6. Usa CD36 per pulire eventi non specifici nel cancello LSC MRD finale (Figura 3).

7. Definizione della soglia ^CD38- nella popolazione CD34⁺

1. Imposta il canale CD38 abbastanza alto da distinguere le popolazioni CD38^- da quelle CD38^+/ con buona risoluzione.
2. Definisci P6 come CD34⁺CD38^-, P7 come CD34⁺CD38^basso e P8 come CD34⁺CD38^alto.
3. Basare l'impostazione del canale CD38 sulle popolazioni di CD38-bright, identificando le cellule plasmatiche come le più luminose e gli ematogoni in base all'intervallo di misura di ciascuna piattaforma.
4. Definire la popolazione CD34⁺CD38^- (P6) utilizzando l'approccio CD38 FMO validato da un controllo isoclonico CD38.
5. Definire^{la bassa} popolazione (P7) di CD34⁺CD38 utilizzando il livello di ematogone negativo.
6. Definire la popolazione^{ad alto} livello di CD34⁺CD38 (P8) utilizzando il livello di positività dell'ematogone e il livello negativo per le cellule plasmoplasmiche (Figura 4).
7. Utilizzare lo stesso livello di soglia CD38^- in tutto il gruppo armonizzato utilizzando metodi robusti come CD38^- FMO o controllo isoclonico CD38.
8. Utilizzare almeno un immunofenotipo aberrante nella frazione CD34⁺CD38^- per definire le cellule arricchite da LSC. Includere marcatori LSC come CLL1/TIM3/CD97/CD45RA/CD123 o marcatori di linea come CD7/CD19/CD56/CD33.
9. Applicare le seguenti soglie: sensibilità al test LOQ ^10-4 e LOD ^10-5; La positività LSC alla diagnosi ≥ 1% dei blasti CD45/SSC; e la positività degli LSC nel follow-up MRD ≥ 0,01% dei WBC.

8. Rapporto di flusso clinico armonizzato

1. Fornire le seguenti informazioni per ciascun risultato: qualità del midollo osseo, strategia utilizzata per l'identificazione della MRD, descrizione del LAIP, LOD e LOQ, soglie e interpretazione dei risultati.
2. Emodiluzione e rappresentatività del midollo osseo
   1. Valutare l'emodiluzione per ogni referto clinico di flusso MRD per valutare la robustezza del risultato.
   2. Utilizzare uno dei metodi di emodiluzione descritti in precedenza quando applicabile (Tabella 4)7,14,15,16,17,18,19,20,21.
   3. Come approccio complementare, calcola la rappresentatività del midollo osseo utilizzando il rapporto osservato CD34/WBC45 rispetto al rapporto atteso osservato nei campioni di riferimento del midollo osseo (Figura 5).
   4. Usa la seguente formula:
      P: percentuale di purezza = 100 × (n/L - s) / (m - s)
      s: proporzione di cellule MNC CD34⁺ nel sangue periferico normale: 0,0005
      m: proporzione di cellule MNC CD34⁺ nel midollo osseo normale: 0,035
      L: numero di leucociti WBC45⁺ nel campione di paziente MRD
      n: numero di cellule MNC CD34⁺ nel campione di paziente MRD
   5. Riportare la rappresentatività del midollo osseo come valutazione di qualità del campione. Non usare questo valore per normalizzare i risultati della MRD.
   6. Interpretare la rappresentatività del midollo osseo come segue: 100% - 10%, bassa influenza sulla proporzione di cellule CD34⁺ dal midollo osseo; 10% contro 1%, avvertimento per l'interpretazione dei risultati MRD; e < 1%, risultato non interpretabile.
3. Quantificazione delle LSC alla diagnosi
   1. Riporta il profilo utilizzato per identificare le cellule arricchite da LSC, ad esempio CD34⁺CD38-CD90-CD45RA^+MIX+(CLL1/TIM3/CD97)CD7⁺CD56⁺.
   2. Riportate i risultati delle LSC alla diagnosi come percentuale osservata dai blasti CD45/SSC.
   3. Usa LSC ≥'1% del totale delle blastocystie come soglia per una prognosi negativa.
4. MRD successivo di LAIP/DfN
   1. Riporta il profilo LAIP usato per identificare MRD, ad esempio CD34⁺CD38^dim+CD13^+/-CD33⁺⁺CD117⁺CD7⁺.
   2. Riportare la sensibilità dell'analisi come il valore meno sensibile tra la soglia tecnica e il valore di robustezza osservato per il profilo LAIP rispetto ai campioni di midollo osseo di riferimento.
   3. Utilizzare un cluster minimo di 50 celle tra gli eventi WBC acquisiti come limite di quantificazione. Ad esempio, con 500.000 celle di globuli bianco, il LOQ è dello 0,01% (1 × ^10-4).
   4. Riportare i risultati LAIP/DfN come positivi, negativi, rilevabili ma sotto la soglia clinica o non rilevabili.
   5. Riportare la positività LAIP/DfN come ≥ 0,1%, espressa come percentuale di leucociti ^CD45+ totali.
   6. Riportano negatività LAIP/DfN come < 0,1%.
   7. Per risultati rilevabili ma sotto la soglia, riportare il valore rappresentativo e la soglia di sensibilità.
   8. Per risultati non rilevabili, segnalare che il risultato è inferiore alla soglia di sensibilità dell'analisi e aggiungere un commento se necessario, come emodiluzione, bassa specificità LAIP o soglia tecnica insufficiente.
5. Follow-up MRD da parte della LSC
   1. Riporta il profilo utilizzato per identificare le cellule arricchite da LSC, ad esempio CD34⁺CD38-CD90-CD45RA^+MIX+(CLL1/TIM3/CD97)CD7⁺CD56⁺.
   2. Utilizzare un cluster minimo di 20 celle tra gli eventi WBC acquisiti come limite di quantificazione. Ad esempio, con 1.000.000 di celle di globuli bianco, il LOQ è dello 0,002% (2 × ^10-5).
   3. Riportare i risultati degli LSC come positivi, negativi, rilevabili ma sotto la soglia clinica o non rilevabili.
   4. Riportate la positività degli LSC come ≥ 0,01%, espressa come percentuale totale di leucociti CD45⁺ .
   5. Riportano la negatività degli LSC come < 0,01%.
   6. Per risultati rilevabili ma sotto la soglia, riportare il valore rappresentativo e la soglia di sensibilità.
   7. Per risultati non rilevabili, segnalare che il risultato è inferiore alla soglia di sensibilità dell'analisi e aggiungere un commento se necessario, come emodiluzione, bassa specificità LSC o soglia tecnica insufficiente.
6. Integrare l'interpretazione del flusso MRD con i precedenti momenti di monitoraggio del monitoraggio. Indicare la modulazione del profilo fenotipico durante il trattamento e la dinamica del flusso MRD, inclusi re-positività, aumento, stabilità o diminuzione.
7. Inoltrai i risultati al clinico richiedente e all'investigatore utilizzando il rapporto di flusso clinico secondo il periodo di tempo del laboratorio di riferimento del flusso di riferimento.
8. Riassumere il rapporto di flusso clinico armonizzato utilizzando i seguenti elementi: qualità del midollo osseo, strategia di identificazione MRD, descrizione LAIP, LOD e LOQ, soglie e interpretazione come MRD positivo, MRD negativo con valore LOD o MRD rilevabile ma non quantificabile.

Risultati

Mirroring della piattaforma

Per il confronto iniziale a due piattaforme tra CANTO e NAVIOS, le impostazioni di tensione sono state regolate acquisendo perle arcobaleno a 8 picchi non compensate per raggiungere valori MFI predefiniti. I valori target dalla piattaforma CANTO di riferimento sono stati trasposti alla seconda piattaforma NAVIOS utilizzando la seguente conversione: nuovo target MFI = target MFI di riferimento/256²². Per rilevare il bias tra le piattaforme, sono stati testati in parallelo 10 campioni freschi di midollo osseo rigenerativo di EDTA. L'indice di colorazione tra popolazioni positive e negative è stato confrontato tra campioni e piattaforme e ha mostrato una separazione comparabile (Supplemental File-Figure S3).

Durante lo studio, le piattaforme sono state progressivamente aggiornate da configurazioni a 8 e 10 colori a configurazioni LYRIC e DxFLEX a 12 e 13 colori (File Supplementare 1). Il mirroring è stato esteso su quattro piattaforme utilizzando perline arcobaleno a 8 picchi e midollo osseo sano colorato ottenuto con lo stesso pannello. La sovrapposizione dei picchi è stata controllata regolando solo le scale logaritmiche della rappresentazione. Dopo aver applicato le impostazioni definite, i pattern di colorazione delle celle si sovrapponevano, con la principale differenza nella traslazione delle nuvole cellulari lungo le scale logaritmiche (Figura 6 e Supplemental File-Figure S4 e Figura S5).

Valutazione della qualità e riproducibilità tra i laboratori di flusso

Dopo l'implementazione della procedura operativa standard iniziale e i suoi aggiornamenti durante gli aggiornamenti della piattaforma, è stata effettuata regolarmente una valutazione della qualità esterna (Wet External Quality Assessment) utilizzando campioni di midollo osseo di riferimento freschi condivisi tra i centri partecipanti. L'EQA umido è stato utilizzato per verificare la procedura di laboratorio umido, le impostazioni della piattaforma e la strategia comune di analisi del gate. Le popolazioni riportate includevano cellule MNC CD34⁺ nel denominatore WBC CD45⁺ e celle P6 CD34⁺CD38⁻ nel denominatore WBC CD45⁺ . I risultati sono stati analizzati tramite z-score e/o rappresentazione grafica (Figura 7).

Dal 2017 sono stati eseguiti cinque round di EQA a umido, con 22, 15, 17, 26 e 25 laboratori partecipanti. Per le cellule %CD34⁺CD38⁻ nei globuli albi (WBC CD45⁺ e %MNC CD34⁺ in globuli globuli nel CD45⁺), i risultati sono stati i seguenti: EQA1, valori medi 0,015% e 1,01% (DE 0,09% e 0,24%); EQA2, 0,09% e 1,02% (DE 0,046% e 0,36%); EQA3, 0,097% e 1,46% (SD 0,024% e 0,32%); EQA4, 0,024% e 2,16% (DE 0,015% e 0,59%); e EQA5, 0,027% e 1,9% (SD 0,008% e 0,45%).

Per affrontare la standardizzazione della strategia di analisi MRD tra i centri, l'EQA umida è stata integrata da EQA secca utilizzando file FCS condivisi per la diagnosi, il follow-up MRD e il midollo osseo di riferimento. Oltre il 90% dei dati analizzati localmente è stato incluso all'interno dell'intervallo centralizzato basato sulla media della serie ± 2 SD: 95,6% e 91,3% per DryEQA2017, con 22 dei 23 laboratori partecipanti e 100% per DryEQA2024, con 24 dei 25 laboratori partecipanti (Figura 8). Sono stati eseguiti due cicli di EQA a secco per %MRD LAIP in WBC CD45⁺ e %MRD LSC CD34⁺CD38⁻ in WBC CD45⁺. DryEQA2017 ha mostrato un valore medio di LAIP dell'11,9% (DS 1,35%) e un valore medio LSC dello 0,16% (SD 0,05%). DryEQA2024 ha mostrato un valore medio MRD LAIP dello 0,35% (DS 0,26%) e un valore medio MRD LSC CD34⁺CD38⁻ dello 0,18% (SD 0,06%).

Esempio di misurazione multimodale del flusso AML MRD utilizzando strategie LAIP/DfN e LSC

Per quantificare la MRD, sono stati utilizzati sistematicamente tre approcci. Il primo approccio ha stabilito la cartografia LAIP delle blastografie leucemiche alla diagnosi utilizzando il cancello booleano, e questa cartografia è stata applicata a campioni di midollo osseo di follow-up (Figura 9A). Il secondo approccio ha utilizzato l'analisi DfN per identificare cellule anomale con modelli di espressione atipici non osservati nelle aree di "scatola vuota" definite dalla differenziazione mieloide normale (Figura 9B). Il terzo approccio ha quantificato le cellule arricchite da LSC nella frazione CD34⁺CD38⁻ utilizzando marcatori dicotomici LSC e gating booleano (Figura 10).

Campioni di midollo osseo di riferimento

Sono stati studiati in totale 135 campioni di midollo osseo di riferimento, inclusi 25 campioni di midollo osseo sano da donatore, 34 campioni infiammatori di midollo osseo e 76 campioni di midollo osseo rigeneranti. Il midollo osseo sano del donatore è stato ottenuto da donatori sani, con un'età mediana di 31 anni e un intervallo compreso tra 21 e 49 anni. Il midollo osseo infiammatorio è stato ottenuto da pazienti indirizzati per citopenia, inclusi anemia, neutropenia o trombopenia, con aspirati di midollo osseo che non mostravano alcuna malignità ematologica; L'età mediana era di 52 anni, con un intervallo di 25 a 82 anni. Il midollo osseo rigenerante è stato ottenuto durante il follow-up AML in diversi momenti di chemioterapia, inclusi dopo l'induzione o la consolidazione, con negatività della valutazione molecolare MRD per i trascritti NPM1 o CBF; L'età mediana era di 54 anni, con un intervallo compreso tra 18 e 65 anni.

La qualità di questi campioni è stata convalidata tramite esame microscopico. La percentuale teorica attesa di cellule CD34⁺ nei campioni di midollo osseo non diluiti è stata calcolata anche utilizzando la formula di Brooimans, con risultati >90% per tutti i campioni. Questi campioni sono stati utilizzati per stabilire soglie per l'analisi LAIP/DfN e LSC e per calcolare la formula di emodiluzione e purezza. La variazione MFI tra marcatori e espressione in base allo stato del midollo osseo è stata studiata per campioni sani di donatore, infiammatori e rigeneranti di midollo osseo (Supplemental File - Figura S6). Sono stati determinati valori di riferimento per i parametri più rilevanti, inclusi %MNC CD34⁺ da WBC, %P6 CD34⁺CD38⁻ in MNC CD34⁺, %P7 CD34⁺CD38^dim in MNC CD34⁺, e %P8 CD34^{+CD38 alto} in MNC CD34⁺ (Supplemental File-Figure S6).

Valutazione della sensibilità e della linearità

La sensibilità è stata valutata per le porte specifiche di LAIP/DfN e LSC misurando il numero di eventi anomali in un insieme di campioni di midollo osseo di riferimento, inclusi midollo osseo rigenerante, infiammatorio e sano del donatore. La diluizione seriale di un numero noto di blasti nel midollo osseo sano è stata utilizzata per verificare il limite di quantificazione e la linearità della misurazione della MRD (Figura 11 e Figura 12).

Figura 1: Strategia di gating per l'analisi MRD LAIP in AML utilizzando marker primitivi (CD34⁺/CD117⁺) nel Tubo 1. Prima fila: gating sequenziale del tempo, celle vive basate su FSC contro SSC, singole cellule basate su FSC-W contro FSC-H, celle WBC CD45⁺ su CD45 contro SSC, blast su CD45^dim/SSC, celle mononucleari (MNC) su FSC-A/SSC-A, celle mnc CD34⁺ sul grafico CD45 vs CD34, e la porta marcatrice primitiva sul grafico CD34 vs CD117. Seconda e terza riga: grafici biparametrici fissi utilizzati per definire le porte LAIP più rilevanti (LAIP1–LAIP8). MRD LAIP è stato definito utilizzando la seguente strategia booleana: tempo E celle vive E singole cellule E (blasti O MNC CD34⁺) E marcatori primitivi (CD34^+/−CD117^+/−) E LAIP1 E LAIP2 E LAIP3 E LAIP4 E LAIP5 E LAIP6 E LAIP7 E LAIP8. Nel caso illustrato, la MRD era del 6,8% dei globuli globuli rossi CD45⁺, rispetto allo 0,04% ± 0,03 nel midollo osseo sano. A destra: back-gating della porta MRD finale usata per la quantificazione, permettendo la pulizia di eventi non specifici, eritroblasti e detriti. Abbreviazioni: LMA = leucemia mieloide acuta; MRD = malattia residua misurabile; LAIP = immunofenotipo associato alla leucemia; FSC = scatter in avanti; SSC = dispersione laterale; WBC = globuli bianchi; MNC = celle mononucleari; hBM = midollo osseo sano. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Strategia di gating per l'analisi MRD LAIP in AML utilizzando blasti maturi (CD34⁻CD117⁻) nel Tubo 3. Prima fila: gating sequenziale del tempo, celle vive basate su FSC contro SSC, singole cellule basate su FSC-W contro FSC-H, celle WBC CD45⁺ su CD45 contro SSC, blast su^{CD45 dim}/SSC, celle mononucleari (MNC) su FSC-A/SSC-A, celle mnc CD34⁺ sul grafico CD45 vs CD34, e il blast gate maturo sul grafico CD34 vs CD117.
Seconda e terza riga: grafici biparametrici fissi utilizzati per definire le porte LAIP più rilevanti (LAIP1–LAIP8). MRD LAIP è stato definito utilizzando la seguente strategia booleana: tempo E cellule vive e cellule singole e blasti e blasti CD34⁻CD117⁻ BLASTI E LAIP1 E LAIP2 E LAIP3 E LAIP4 E LAIP5 E LAIP6 E LAIP7 E LAIP8. Nel caso illustrato, la MRD era del 15% dei globuli globuli rossi CD45⁺, rispetto allo 0,09% ± 0,02 nel midollo osseo sano.
Destra: back-gating della porta MRD finale usata per la quantificazione, permettendo la pulizia di eventi non specifici. Abbreviazioni: LMA = leucemia mieloide acuta; MRD = malattia residua misurabile; LAIP = immunofenotipo associato alla leucemia; FSC = scatter in avanti; SSC = dispersione laterale; WBC = globuli bianchi; MNC = celle mononucleari; hBM = midollo osseo sano. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Strategia di gating per cellule staminali ematopoietiche normali (nHSC) e cellule staminali arricchite di leucemiche (LSC) nella frazione CD34⁺CD38⁻ (Tubo 2). (A) Cellule staminali ematopoietiche normali (nHSC) e (B) cellule staminali leukemiche (LSC) nella frazione CD34⁺CD38⁻ (Tubo 2). Prima fila: gating sequenziale del tempo, cellule vive basate su FSC contro SSC, cellule singole basate su FSC-W contro FSC-H, cellule WBC CD45⁺ su CD45 contro SSC, blasti su CD45dim/SSC, celle mononucleari (MNC) su FSC-A/SSC-A e celle MNC CD34⁺ sul grafico CD45 vs CD34.
Dalla seconda alla quarta riga: grafici puntino biparametrici fissi usati per definire P6 (CD34⁺CD38⁻), P7 (CD34⁺CD38^basso) e P8 (CD34⁺CD38^alto), insieme ai marcatori dicotomici LSC più rilevanti, inclusi MIX (CLL1/TIM3/CD97), CD123 e CD45RA. MRD LSC è stata definita utilizzando la seguente strategia booleana: tempo E celle vive E celle singole E blasti E MNC CD34+ E P6 E (P6 LSC MIX⁺ O P6 LSC CD123⁺ O P6 LSC CD45RA⁺).
A destra: back-gating della porta finale MRD LSC utilizzata per la quantificazione, permettendo la pulizia di eventi non specifici.
(A) nHSC in un campione di midollo osseo sano: gli nHSC (eventi viola) erano CD34⁺CD38⁻, MIX⁻ (CLL1/TIM3/CD97), CD45RA⁻, CD123⁻, CD117⁺, HLA-DR⁺, CD36⁻ e CD90⁺. La frazione nHSC CD34⁺CD38⁻ rappresentava lo 0,02% dei globuli globuli globuli (WBC) CD45⁺4^+CD38− erano negative. Le soglie di analisi riportate erano LOQ 0,0001% e LOD 0,001%.
(B) Cellule arricchite da LSC in un campione AML: le cellule arricchite da LSC (eventi arancioni) erano CD34⁺CD38⁻, MIX⁺ (CLL1/TIM3/CD97), CD45RA⁺, CD123⁺, CD117⁺, HLA-DR⁺, CD36⁻ e CD90⁺. La frazione LSC CD34⁺CD38⁻ rappresentava il 3,7% dei globuli WBC CD45⁺. Abbreviazioni: nHSC = cellule staminali ematopoietiche normali; LSC = cellula staminale leucemica; MNC = celle mononucleari; WBC = globuli bianchi; SSC = dispersione laterale; MIX = CLL1/TIM3/CD97; HLA-DR = antigene leucocitario umano-DR; LOQ = limite di quantificazione; LOD = limite di rilevamento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Definizione della soglia CD38⁻ nella popolazione CD34⁺ utilizzando il canale fluorescente CD38 meno uno (FMO). Prima fila: gating delle popolazioni di riferimento, inclusi blasti su CD45/SSC, celle MNC CD19⁺ e celle MNC CD34⁺ .
Seconda fila: livello di segnale nel canale FMO CD38. La prima linea mostra celle di blast, la seconda mostra celle MNC CD19⁺ e la terza mostra celle MNC CD34⁺ . La linea arancione indica la soglia che definisce la porta P6 CD34⁺CD38⁻ .
Terza fila: livello segnale CD38 PE-Cy7. La prima riga mostra le cellule blastiche, la seconda mostra le cellule MNC CD19⁺ con il livello dell'ematogone CD38 usato per definire P8 CD34^{+CD38 alto}, e la terza riga mostra celle MNC CD34⁺, con P6 CD34⁺CD38⁻ in arancione, P7 CD34⁺CD38^basse in verde e P8 CD34⁺CD38^alto Celle in blu. Abbreviazioni: FMO = fluorescenza meno uno; MNC = celle mononucleari; SSC = dispersione laterale; PE-Cy7 = ficoeritrina-cianina 7; P6 = frazione CD34+CD38−; P7 = CD34+CD38 frazione bassa; P8 = CD34+CD38 frazione alta. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Valutazione della rappresentatività del campione di midollo osseo basata sulle cellule MNC CD34⁺ . (A) Strategia di gating per le cellule MNC CD34⁺ e parametri utilizzati per il calcolo delle formule: n, numero di celle MNC CD34⁺ ; L, numero ^{di celle} CD45+ di globuli bili; s, proporzione di cellule MNC CD34⁺ nel sangue periferico normale; e m., proporzione di cellule MNC CD34⁺ osservate nel riferimento midollo osseo normale. (B) Rappresentazione schematica dell'impatto della diluizione del midollo osseo (BM) da parte del sangue periferico (PB) sull'origine delle cellule CD34⁺ nei campioni di BM. (C) Criteri utilizzati per interpretare la purezza delle BM. Abbreviazioni: BM = midollo osseo; PB = sangue periferico; MNC = celle mononucleari; WBC = globuli bianchi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Confronto dei modelli di espressione tra quattro piattaforme di citometro a flusso.
Un campione di midollo osseo (BM) normale è stato testato simultaneamente su quattro piattaforme citometriche utilizzando le impostazioni definite per ciascuna piattaforma e la regolazione della scala. La prima riga mostra le celle MNC sul grafico di punti CD45/CD33; la seconda riga mostra le celle MNC sul grafico di punti del marcatore primitivo CD34/CD117; la terza riga mostra le celle di blast sul grafico di punti CD34/CD38; e la quarta riga mostra le celle P6 CD34⁺CD38⁻ sul grafico a punti CD45RA/CD90. Abbreviazioni: BM = midollo osseo; MNC = celle mononucleari; P6 = frazione CD34⁺CD38⁻ . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Riproducibilità EQA in laboratorio umido tra i laboratori di flusso partecipanti. (A) Grafico di violino che mostra la distribuzione delle celle %P6 CD34⁺CD38⁻ nelle celle WBC CD45⁺ tra i cinque round EQA da laboratorio umido e i laboratori di flusso partecipanti. (B) Grafico violino che mostra la distribuzione delle cellule %MNC CD34⁺ nelle celle WBC CD45⁺ tra i cinque round EQA in laboratorio umido e i laboratori di flusso partecipanti. Abbreviazioni: EQA = valutazione esterna della qualità; P6 = frazione CD34+CD38−; WBC = globuli bianchi; MNC = celle mononucleari. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Valutazione EQA secca della misurazione MRD di LAIP/DfN e LSC. (A) Esercizio di EQA2017 secco per la misurazione MRD di LAIP/DfN e LSC utilizzando sei file FCS condivisi da un gruppo di panel a 8 colori, inclusi diagnosi di AML, MRD AML e file di riferimento del midollo osseo normali per analisi LAIP del tubo 1 e LSC del tubo 2. L'esercitazione è stata condivisa con 23 laboratori partecipanti. (B) Esercizio EQA2024 secco per la misurazione LAIP/DfN e LSC MRD utilizzando sei file FCS condivisi da un gruppo di panel a 12 colori, inclusi diagnosi AML, AML MRD e file di riferimento del midollo osseo normale per analisi del Tubo 1 LAIP e LSC del Tubo 2. L'esercitazione è stata condivisa con 24 laboratori partecipanti. (C) Confronto interpiattaforma di celle %MNC CD34⁺ e celle %nHSC P6 CD34⁺CD38⁻ nelle celle WBC CD45⁺ misurato durante il Wet EQA2025, condiviso con 25 laboratori partecipanti. I valori attesi erano dell'1,6% per le celle MNC CD34⁺ e dello 0,02% per le celle nHSC P6 CD34⁺CD38⁻ . Abbreviazioni: EQA = valutazione esterna della qualità; LAIP = immunofenotipo associato alla leucemia; DfN = diverso dalla norma; LSC = cellula staminale leucemica; MRD = malattia residua misurabile; FCS = standard di citometria a flusso; LMA = leucemia mieloide acuta; MNC = celle mononucleari; nHSC = cellule staminali ematopoietiche normali; WBC = globuli bianchi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9: Misurazione rappresentativa MRD utilizzando approcci LAIP/DfN. (A) Esempio di misurazione MRD usando il metodo LAIP/DfN. Il lato sinistro mostra la cartografia LAIP delle cellule leucemiche nel campione diagnostico, mentre il lato destro mostra l'applicazione della stessa cartografia LAIP al campione di follow-up, con la popolazione MRD mostrata in nero. (B) Esempio di misurazione MRD utilizzando il metodo DfN. Ogni coppia di grafici a punti confronta il midollo osseo sano (hBM; normale, grafico sinistro) con un campione di midollo osseo di follow-up MRD (DfN, grafico a destra). L'area della "scatola vuota" è definita sul midollo osseo normale, e la presenza di cellule leucemiche in questa scatola vuota viene valutata nel campione di follow-up, con la popolazione anomala mostrata in nero. Abbreviazioni: MRD = malattia residua misurabile; LAIP = immunofenotipo associato alla leucemia; DfN = diverso dalla norma; hBM = midollo osseo sano. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 10: Misurazione rappresentativa delle cellule arricchite con LSC CD34⁺CD38⁻ alla diagnosi e al follow-up. (A) Esempio di misurazione cellulare arricchita da LSC in un campione di diagnosi AML. Il lato sinistro mostra il profilo arricchito da LSC, con la popolazione arancione che esprime MIX (CLL1/TIM3/CD97), CD123, CD45RA, CD117, HLA-DR e CD36 all'interno della frazione CD34⁺CD38⁻ .
(B) Campione di follow-up dello stesso paziente che mostra la persistenza di cellule arricchite con MRD LSC con lo stesso profilo immunofenotipico (popolazione arancione). Abbreviazioni: LSC = cellula staminale leucemica; LMA = leucemia mieloide acuta; MRD = malattia residua misurabile; MIX = CLL1/TIM3/CD97; HLA-DR = antigene leucocitario umano-DR. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 11: Sensibilità analitica del rilevamento LSC. (A) Valutazione del limite di blank (LOB) per il rilevamento LSC. Il lato sinistro mostra la quantificazione degli eventi CD34⁺CD38⁻ in una fusione di cinque file FCS da cinque campioni di midollo osseo sano (5.148.000 eventi WBC acquisiti). Il lato destro mostra il numero di eventi appartenenti al cancello booleano LSC back-gate sul grafico di punti CD45/SSC (14 eventi), corrispondente a un LOB di <0,0005% (5 × ^10-6). (B) Valutazione della linearità per la quantificazione delle LSC. Il lato sinistro mostra una diluizione seriale tramite spike-in di cellule arricchite con LSC in un campione di midollo osseo sano. Il lato destro mostra la correlazione tra i valori MRD misurati e i valori teorici, corrispondenti a un limite di quantificazione (LOQ) di 2 × ^10-5 (0,002%). Abbreviazioni: LSC = cellula staminale leucemica; LOB = limite di vuoto; FCS = standard di citometria a flusso; WBC = globuli bianchi; MRD = malattia residua misurabile; LOQ = limite di quantificazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 12: Linearità e intervallo di quantificazione della misurazione dei LAIP MRD. (A) Valutazione della linearità per la quantificazione dei LAIP MRD tramite diluizione seriale di blastoplastici con diversi LAIP nel midollo osseo sano, mostrando la correlazione tra i valori MRD misurati e i valori teorici, con LOQ variabile secondo i diversi LAIP e LOQ <0,1%. (B) Intervallo di quantificazione secondo diversi LAIP. La linea rossa indica la soglia clinica dello 0,1%. Il LOQ ha raggiunto la soglia clinica per tutti i LAIP testati. Abbreviazioni: MRD = malattia residua misurabile; LAIP = immunofenotipo associato alla leucemia; LOQ = limite di quantificazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Fluoro cromo	Picco	LYRIC12c	Picco	DxFlex13c	Picco	NAVIOS10C	Picco	CANTO8c
FITC	P8	44618	P6	89916	P7	104	P8	56316
PE	P8	84008	P6	110652	P7	136	P8	88803
ECD	x	x	P6	153011	P7	150	x	x
PerCPcy5,5 /PEcy5,5	P7	63610	P6	101791	P7	85	P7	75717
PC7/PEcy7	P8	32412	P6	21381	P8	88	P8	32003
APC	P7	111628	P6	192708	P6	181	P7	143946
AA700/AP CR700	P7	25958	P6	237374	P7	182	x	x
A7A750/ APCH7	P8	77444	P6	158729	P7	150	P8	98311
BV421	P6	62031	P6	239208	P6	268	P6	68315
KO/V500	P7	159941	P6	293917	P6	179	P7	124919
BV605	P7	31688	P6	65337	x	x	x	x
BV711/ V660	P8	21816	P6	12107	x	x	x	x
BV786	P8	17560	P6	3795	x	x	x	x

Tabella 1: Valori target per ogni piattaforma utilizzando perline arcobaleno a 8 picchi. Vengono mostrati valori target specifici per ciascuna piattaforma citometrica (Canto, Lyric, Navios, DxFlex). I picchi mantenuti sono stati scelti per essere vicini all'IFF osservato per le cellule blasto. Questo è particolarmente importante per i citometri basati su PMT, dove l'intensità del segnale non aumenta linearmente con l'aumento della tensione PMT. Al contrario, sui citometri basati su APD, l'intensità del segnale aumenta linearmente con il guadagno, permettendo di utilizzare lo stesso picco per tutti i rivelatori, mentre per ogni canale sono necessari picchi diversi per ogni canale sui citometri basati su PMT. Abbreviazioni: MFI = intensità mediana di fluorescenza; PMT = tubo fotomoltiplicatore; APD = fotodiodo per valanga. Clicca qui per scaricare questa tabella.

CANTO 8C /NAVIOS 8c

FITC

PE

ECD

PerCPC y5,5

PECy7

APC

APC-R700 /AA700

APCH7

BV421

V500

BV605

BV711

BV786

Tubo 1 LAIP 8c

CD7 5μL /CD56 5μL

CD13 5μL

CD33 10μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD19 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

Tubo 2 LSC 8c

CD90 5μL

MIX3(2 0,5μL/Ac)

CD123 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD45RA 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

T3 Morbido Mentaire Gran 8c

CD15 5μL

CD56 5μL

HLADR 10μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD11b 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

T3 Supplem entaire - Monos 8c

CD36 5μL

CD64 5μL

CD14 10μL

HLADR 5μL

CD34 5μL

CD4 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

MIX3Ac =97 +TIM3+ CLL1

LYRIC 10-12c

FITC

PE

ECD

PerCPCy5,5

PECy7

APC

APC-R700

APCH7

BV421

V500

BV605

BV711

BV786

Tubo 1LAIP 12c

CD7 5μL

CD13 5μL

CD33 10μL

CD38 5μL

CD34 5μL

HLADR (5μL)

CD19 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD56 5μL

CD10 2μL

CD36 2μL

Tubo 2 LSC 12c

CD90 5μL

MIX3(2. 5μL/Ac)

CD123 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

HLADR (5μL)

CD45RA 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD200 5μL

CD19 5μL

CD36 2μL

T3 Morbido Mentaire 12c-Monos

CD15 5μL

CD64 5μL

CD33 10μL

CD38 5μL

CD34 5μL

HLADR (5μL)

CD4 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD14 5μL

CD11b 5μL

CD36 2μL

MIX3Ac =97+ TIM3+ CLL1

NAVIOS 10c

FITC

PE

ECD

PEcy5,5

PECy7

APC

AA700

AA750

BV421/PB

V500/KO

BV605

BV711

BV786

T1 Navios 10c

CD7 10μL

CD13 10μL

HLADR 5μL

CD33 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD56 10μL

CD19 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

T2 Navios 10c

CD90 5μL

MIX3(2.5 μL/Ac)

CD19 5μL

CD123 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD36 5μL

CD45RA 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

T3 Morbido Mentaire 10c Monos

CD15 5μL

CD4 5μL

HLADR 5μL

CD33 5μL

CD11b 5μL

CD34 5μL

CD36 5μL

CD14 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

MIX3Ac =97+ TIM3+ CLL1

DxFLEX 10 -12/13c

FITC

PE

ECD

PEcy5,5

PECy7

APC

AA700

AA750

BV421/PB

V500/KO

BV605

BV650

BV786

T1 DxFLEX 12-13C

CD7 10μL

CD13 10μL

HLADR 5μL

CD33 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD56 10μL

CD19 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD36 5μL

CD10 2μL

/

T2 DxFLEX 12-13C

CD90 5μL

MIX3(2.5 μL/Ac)

CD19 5μL

CD123 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD36 5μL

CD45RA 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

/

CD200 5μL

HLADR snv786 (3μL)

T3 Morbido Mentaire 12c Monos

CD15 5μL

CD4 5μL

HLADR 5μL

CD33 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD36 5μL

CD14 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD64 5μL

CD11b 5μL

/

Tabella 2: Configurazioni dei pannelli anticorpali per analisi AML MRD LAIP/DfN e LSC. La tabella riassume le configurazioni dei pannelli a 8, 10, 12 e 13 colori in base alla piattaforma citometrica. Il tubo 1 è utilizzato per l'analisi LAIP/DfN, il tubo 2 per l'analisi cellulare arricchita con LSC CD34⁺CD38⁻ , e il tubo 3 per marcatori di differenziazione monocitotica/granulocitotica. Per ciascuna piattaforma sono mostrati i volumi di anticorpi e le assegnazioni del fluorocromo. MIX3 corrisponde a CD97, TIM3 e CLL1. Abbreviazioni: LMA = leucemia mieloide acuta; MRD = malattia residua misurabile; LAIP = immunofenotipo associato alla leucemia; DfN = diverso dalla norma; LSC = cellula staminale leucemica; MIX3 = CD97/TIM3/CLL1. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Perdita completa dei marcatori normalmente espressi sui precursori mieloidi

CD13++CD33-/CD34+ o CD117+

CD13-CD33++/CD34+ o CD117+

CD13+HLADR-/CD34+

CD13+CD117+CD34-

Espressione di marcatori linfoidi a linee incrociate sui precursori mieloidi

CD7+CD13+/CD34+ o CD117+

CD7+CD33+/ CD34+ o CD117+

CD56+CD13+/ CD34+ o CD117+

CD56+CD33+/ CD34+ o CD117+

CD19+CD117+/ o CD13+ o CD33+

Sovraespressione sui precursori mieloidi

CD34++/CD117+

CD117++/CD13+CD33+

Diminuzione dell'espressione sui precursori mieloidi

CD38loCD34+CD33+CD117+

Tabella 3: Definizioni di "scatola vuota" basate su LAIP. La tabella elenca schemi predefiniti diversi dal normale (DfN) di "scatole vuote" utilizzati per identificare popolazioni di precursori mieloidi anomali. Le categorie includono la perdita completa dei marcatori normalmente espressi, l'espressione dei marcatori linfoidi tra linee trasversali, la sovraespressione dei marcatori e la diminuzione dell'espressione dei marcatori sui precursori mieloidi. Abbreviazioni: LAIP = immunofenotipo associato alla leucemia; DfN = diverso dalla norma. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Holdrinet et al.17
Broolmans et al.15
Purezza del midollo osseo = (1 − (GRMO/GR SG) x (GB SG/GB MO)) x 100	>80%
Björlund et al.19	GPA > 15%
	CD3 < 20%
Loken et al.18	CD16alto < 30%
Theunissen et al.20; Dworzak et al.21
Flusso o Ctr DIL citologico: PNN < 40%, Ebl > 5%, Ly < 20%	CD16++ CD11b++ < 40%
	GPA > 5%
	CD3 < 20%
Percentuale di purezza BM: MNC 34+/WBC45+	Purezza BM 100-10%

Tabella 4: Metodi di controllo della diluizione del midollo osseo per la segnalazione del flusso di MRD AML. La tabella riassume i metodi di diluizione e controllo della rappresentatività del midollo osseo pubblicati che possono essere utilizzati per i rapporti clinici di flusso AML MRD. Dovrebbe essere applicato almeno un metodo di diluizione e controllo per supportare l'interpretazione dei risultati della MRD. L'approccio di purezza del midollo osseo CD34/WBC45⁺ è incluso come valutazione complementare della qualità. Abbreviazioni: LMA = leucemia mieloide acuta; MRD = malattia residua misurabile; BM = midollo osseo; WBC = globuli bianchi; CD34/WBC45⁺ = cellule CD34⁺ tra i globuli bianchi CD45⁺ . Clicca qui per scaricare questa tabella.

Fascicolo supplementare 1: Informazioni aggiuntive di base, armonizzazione delle piattaforme, riferimento per il midollo osseo e materiali di supporto prognostico. Questo file supplementare contiene figure e tabelle di supporto relative all'identificazione dei LSC, all'eterogeneità fenotipica AML, al mirroring interpiattaforma, all'ottimizzazione specifica per piattaforma, ai profili di riferimento dei marcatori del midollo osseo, all'evoluzione longitudinale dei pannelli e alla soglia prognostica utilizzata per la quantificazione delle LSC alla diagnosi. Questi materiali forniscono ulteriore contesto per il flusso di lavoro multicentrico della citometria a flusso MRD, inclusa la motivazione per la valutazione cellulare arricchita con LSC CD34⁺CD38⁻ , la base tecnica per l'armonizzazione della piattaforma e i dati di supporto utilizzati per interpretare il background del midollo di riferimento, la migrazione dei panel e la selezione della soglia clinica. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Fasi critiche nel protocollo

La qualità del campione è cruciale per una quantificazione accurata di MRD e LSC. I campioni di midollo osseo freschi dovrebbero essere trasportati a temperatura ambiente e processati idealmente entro 24–48 ore e, se necessario, entro 72 ore dopo la^{raccolta 23}. L'emodiluzione dovrebbe essere valutata in ogni momento e inclusa nel rapporto di flusso clinico. Il clinico dovrebbe specificare il momento del trattamento, ad esempio dopo induzione, consolidamento, immunoterapia mirata, trattamenti meno intensivi come azacitidina/venetoclax o allografto. Il paesaggio della differenziazione è strettamente correlato al trattamento e al momento temporale ed è importante integrarlo nell'interpretazione della MRD. Durante il follow-up longitudinale, la stessa sensibilità dello strumento e affidabilità dell'analisi dovrebbe essere mantenuta tramite controlli regolari dei valori target con perle di controllo arcobaleno, EQA regolare e revisione collegiale dei file FCS durante tutto lo studio.

Un alto livello di standardizzazione e affidabilità intercentrica della quantificazione dei flussi MRD è mantenuto tramite una formazione educativa online regolare nel gruppo di flusso. È stata svolta almeno una sessione di formazione web al mese e in quegli anni sono stati discussi e rivisti più di 100 casi di quantificazione MRD LAIP/DfN, MRD LSC o LSC diagnostica. Questa formazione continua è importante perché l'interpretazione dei dati di flusso richiede un biologo altamente qualificato, in particolare per MRD di basso livello, popolazioni di fondo fisiologico, midollo rigenerante e interruttori fenotipici in trattamento.

La quantificazione delle popolazioni arricchite di LSC CD34⁺CD38⁻ è un altro passo fondamentale. Non esiste un marcatore universale per catturare le normali cellule staminali ematopoietiche o LSC. Il gruppo HOVON ha introdotto il monitoraggio LSC nella diagnosi e nel follow-up AML utilizzando un pannello a 8 colori che includeva un insieme di marcatori LSC "dicotomici" rilevanti³. I marcatori dicotomici sono definiti come che non mostrano espressione nelle cellule staminali ematopoietiche normali ma espressione positiva nelle popolazioni arricchite da LSC, con pattern tenui, intermedi, alti, eterogenei o bimodali. C'è interesse nell'includere una combinazione di specifici marcatori dicotomici LSC, come CLL1, TIM3 e CD97, in un unico canale, perché se solo uno è positivo, le cellule arricchite da LSC possono comunque essere rilevate. Altri marcatori dovrebbero essere utilizzati separatamente in canali specifici perché la loro espressione può sovrapporsi a quella delle normali cellule staminali ematopoietiche, a seconda dello stato del midollo osseo, incluso il midollo²⁴ in rigenerazione o stressato. La definizione completa delle cellule arricchite da LSC si basa su operatori booleani, inclusa l'espressione aberrante dei marcatori nella frazione CD34⁺CD38⁻ . Poiché questa rimane una definizione fenotipica, la popolazione dovrebbe essere interpretata come cellule arricchite da LSC CD34⁺CD38⁻ piuttosto che come LSC funzionalmente provati in ogni campione. Questo pannello LSC è applicabile anche ai pazienti con MDS con eccesso di blastoblasti e AML MRC utilizzando lo stesso protocollo.

Modifiche e risoluzione dei problemi del metodo

Durante l'evoluzione di piattaforme e pannelli, l'approccio di standardizzazione/armonizzazione deve essere mantenuto all'interno della rete di laboratorio, in particolare nel passaggio da pannelli da 8 a 10 colori a pannelli da 12 a 13 colori. Con l'evoluzione delle macchine, è necessario mantenere una colonna vertebrale comune di anticorpi e la stessa sensibilità nella rilevazione di anomalie fenotipiche durante lo studio clinico. Durante l'evoluzione della piattaforma, i fluorocromi degli anticorpi nella spina dorsale rimangono stabili e comuni su tutte le macchine (CD34/CD38/CD45/CD117). Tuttavia, per alcuni canali, è necessario cambiare fluorocromi a causa della banca ottica specifica della macchina, che richiede un approccio di armonizzazione. Quando si passa da un citometro rivelatore PMT a un citometro rivelatore APD, bisogna considerare l'elevata sensibilità dei rivelatori APD ad alte lunghezze d'onda. Pertanto, in alcuni casi, la scelta dei fluorocromi per alcuni anticorpi deve essere adattata per mantenere lo stesso indice di colorazione ed evitare una diffusione eccessiva tra i canali, adottando così un approccio di ottimizzazione. Gli attuali citometri clinici supportano pannelli da 12 a 13 colori, aumentando la specificità nella rilevazione del LAIP e migliorando l'interpretazione grazie all'aggiunta di marcatori che eliminano le cellule contaminanti nel gate MRD. Tuttavia, ciò aumenta anche la complessità dell'analisi²³.

L'aggiornamento da pannelli a 8 colori a 12 colori ha migliorato in alcuni casi la sensibilità e la specificità della valutazione MRD (File Supplementare 1). Nel Tubo 1 furono aggiunti HLA-DR, CD36, CD10 e CD56, separati dal CD7. Nel Tubo 2 sono stati aggiunti HLA-DR, CD36, CD200 e CD19. Nel Tubo 3 sono stati aggiunti il CD4, il CD64, il CD38, il CD36 e il CD14. HLA-DR, ora sistematicamente combinato con CD38 in ogni valvola, fornisce una definizione più chiara di LAIP e dei pattern di differenziazione alterati. CD36, ora sistematicamente incluso in ogni provetta, è un indicatore chiave per identificare eritroblasti, globuli rossi, piastrine e detriti, e per perfezionare la porta MRD finale. Il CD19 nel tubo LSC aiuta anche a identificare gli ematogoni. La combinazione dei marcatori di differenziazione di monociti e granulociti in un unico tubo permette una migliore delineazione dei pattern di differenziazione monocitotica e granulocitaria e aiuta a distinguere le aberranze per identificare i LAIP. Passando da pannelli a 8 colori a 10 colori, il miglioramento principale è arrivato dal rilevamento LAIP, specialmente con l'aggiunta di HLA-DR e CD56 separati da CD7 nel Tubo 1 e HLA-DR e CD19 nel Tubo 2. Passando dai pannelli a 10 colori a quelli a 12 colori, il miglioramento derivava da una migliore pulizia delle paratoie a soffio e LSC con l'aggiunta del CD36 in ogni valvola, completata dal CD10 nel Tubo 1 e dal CD200 nel Tubo 2. Questo è stato particolarmente utile per i pazienti con MRD a basso livello superiore al limite di rilevamento ma al di sotto del limite di quantificazione. Nel complesso, la maggior parte dei pazienti con positività MRD alla soglia clinica ≥ 0,1% era già identificata con il pannello a 8 colori; tuttavia, l'uso di più marcatori nei tubi ha migliorato la specificità e l'interpretazione della valutazione MRD, specialmente per MRD di basso livello come menzionato nelle linee guida ELN 2025.

Limitazioni del metodo

Scegliere un approccio multicentrico può essere una sfida. La fattibilità di questo concetto richiede passaggi obbligatori prima di implementare il flusso MRD negli studi clinici AML: armonizzazione della sensibilità degli strumenti e della preparazione del campione, e formazione e formazione sistematica per operatori^{analitici 25}. Man mano che le piattaforme si evolvono, la strategia multicentrica e multipiattaforma deve essere adattata per mantenere la robustezza e la riproducibilità dei risultati. Questo include la standardizzazione, l'uso dello stesso pannello e delle stesse impostazioni per lo stesso tipo di piattaforma; armonizzazione, utilizzando lo stesso pannello su più piattaforme con impostazioni armonizzate; e ottimizzazione, utilizzando un pannello e impostazioni specifiche adattate a ciascuna piattaforma.

L'emodiluzione è uno dei punti più impegnativi e critici per la quantificazione del flusso di MRD. La formula di rappresentatività CD34/WBC descritta in questo protocollo dovrebbe essere utilizzata come misura complementare di controllo qualità per il campione di midollo osseo e non dovrebbe essere utilizzata per normalizzare i risultati della MRD. La sua interpretazione può essere influenzata dalla rigenerazione del midollo, dagli effetti del trattamento, dalla malattia residua e da regimi meno intensivi. Analogamente, marcatori come CD56, CD123 e CD45RA non devono essere interpretati come marcatori DfN o LSC autonomi. Devono essere interpretati all'interno della strategia completa di gate, delle porte di pulizia, del background di riferimento del midollo osseo e del contesto clinico.

Importanza del metodo rispetto ai metodi esistenti o alternativi

Secondo le linee guida ELN 2025, la MRD è un importante indicatore prognostico nei pazienti con AML, indipendentemente dalla tecnica o dal tempismo della valutazione. L'uso di diverse tecniche di flusso MRD e marcatori è altamente complementare. La MRD multimodale, inclusa l'analisi LAIP/DfN e LSC, è utile a condizione che l'analisi venga eseguita all'interno di una rete standardizzata con una rendicontazione armonizzata dei risultati. La valutazione MRD consente una migliore definizione della risposta terapeutica e della ricaduta. Il flusso di MRD multicentrico e multimodale, insieme alla MRD molecolare, giocherà un ruolo strategico nei futuri studi clinici all'interno di un panorama terapeutico sempre più complesso che include nuove terapie mirate, trattamenti di prima e seconda linea, trapianti allogeneici e terapie a bassa intensità.

Importanza e potenziali applicazioni del metodo in aree di ricerca specifiche

I gruppi HOVON e ALFA hanno riportato che la quantificazione delle popolazioni arricchite con LSC CD34⁺CD38⁻ alla diagnosi di LMA ha un impatto clinico (Supplemental File 1). Sembra fondamentale definire soglie clinicamente significative per la LSC basandosi sul metodo di quantificazione. Come precedentemente riportato utilizzando il metodo descritto qui, una soglia LSC dell'≥1% era associata a un esito sfavorevole (Supplemental File 1)²⁶. Nella gestione della LMA, l'integrazione differenziale di MRD, monitoraggio del LSC ed ematopoiesi clonale può aiutare a perfezionare l'interpretazione terapeutica. La principale sfida sta nel distinguere la MRD, che potrebbe richiedere un trattamento aggiuntivo, dai cloni pre-leucemici stabili, che potrebbero non^{avere 27}. Un sistema integrato di segnalazione per calcolare la percentuale di blastomani è stato recentemente raccomandato per il follow-up AML nelle linee guida EHA/ELN 2025²⁰²⁵. Integra i risultati MRD con il confronto morfologico per una valutazione armonizzata dei blasti e dovrebbe facilitare una segnalazione coerente negli studi clinici per definire le categorie di risposta nei pazienti con LMA.

Sia lo studio HOVON che quello ALFA/FILO BIG1 mostrano che un punteggio che combina approcci LAIP/DfN e LSC ha permesso di classificare i pazienti in quattro gruppi: ^LAIP−/^LSC−, ^LAIP+/LSC⁻, ^LAIP−/^LSC+e ^LAIP+/^LSC+, con diversi tassi di sopravvivenza complessiva^{a 3 anni 3,26,29}. Nel complesso, questi risultati illustrano l'impatto clinico prognostico dello status combinato MRD LAIP/DfN e LSC. Nel contesto del trapianto di cellule staminali ematopoietiche allogenee, la presenza di cellule arricchite con LSC CD34⁺CD38⁻ è stata anche segnalata come predittore di fallimento post-trapianto, anche quando il numero totale di blasti è inferiore al 5%³⁰. Questi dati clinici supportano la rilevanza delle strategie combinate di flusso MRD, ma l'attuale protocollo si concentra sulla standardizzazione del flusso di lavoro tecnico e della rendicontazione tra i centri.

Come prospettiva, la tecnologia del flusso spettrale può ampliare il pannello di marcatori testati simultaneamente in un approccio di citometria a flusso multidimensionale, aumentando così la specificità dei LAIP monitorati e riducendo il rumore biologico di fondo dovuto alla rigenerazione ematopoietica. La valutazione della riproducibilità del flusso spettrale tra piattaforme, pannelli e centri, come proposto qui, sarà una sfida per l'implementazione clinica. Nuovi algoritmi di analisi non supervisionata, tra cui FlowSOM, t-SNE e UMAP, potrebbero facilitare la discriminazione tra ematopoiesi normale e compartimento leucemico, dalla frazione arricchita con LSC CD34⁺CD38⁻ al blocco blast. Catturare più profondamente le frazioni di LSC potrebbe aiutare a migliorare il monitoraggio dell'innestazione nei modelli xenoinnesti derivati dal paziente^31,32. Sono stati istituiti gruppi di lavoro ELN per validare e armonizzare questi nuovi approcci^33,34.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Antibodies (CANTO 8C-LYRIC12C)	Fluorochrome	Company	Catalog Number
CD90	FITC	BD Pharmingen	555595
CD7	FITC	BD Bioscience	332773
CD13	PE	BD Bioscience	347406
CD33	PerCPCy5,5	BD Bioscience	333146
CD117	BV421	BD Bioscience	563856
CD38	PeCy7	BD Bioscience	335825
CD34	APC	BD Bioscience	345804
CD45RA	APCH7	BD Pharmingen	560674
CD19	APCH7	BD Bioscience	641395
CD45	V500	BD Bioscience	560777
CD97	PE	BD Pharmingen	555774
TIM3(CD366)	PE	BD Pharmingen	563422
CLL1(CD371)	PE	BD Pharmingen	562566
CD123	PerCPcy5.5	BD Pharmingen	558714
CD15	FITC	BD Bioscience	332778
CD64	PE	BD Pharmingen	558592
CD11b	BV711	BD Bioscience	740771
CD4	APCH7	BD Bioscience	641398
HLADR	APC-R700	BD Horizon	565127
CD56	BV605	BD Horizon	562780
CD14	BV605	BD Horizon	564054
CD200	BV605	BD Biosciences	562853
CD10	BV711	BD Biosciences	740770
CD36	BV786	BD Biosciences	745554
CD19	BV711	BD Biosciences	563036
Antibodies (NAVIOS 10C/DxFlex 12C/13C)	Fluorochrome	Company	Catalog Number
CD90	FITC	BD Pharmingen	555595
CD7 FITC	FITC	BC iotest	A07755
CD13	PE	BC iotest	A07762
CD33	PC5.5	BC iotest	B36289
CD117	SNV428	BC iotest	C76813
CD38	PEcy7	BDBioscience	335825
CD34	APC	BC iotest	IM2472
CD45RA	APCH7	BDBioscience	560674
CD19	AA750	BC iotest	A94681
CD45	KromeOrange	BC iotest	B36294
CD97	PE	BD Pharmingen	555774
TIM3(CD366)	PE	BD Pharmingen	563422
CLL1(CD371)	PE	BD Pharmingen	562566
CD123	PC5.5	BC iotest	B20022
HLADR	ECD	BC iotest	B92438
CD36	AA700	BC iotest	B46022
CD19	ECD	BC iotest	A07770
CD4	PE	BC iotest	A07751
CD11b	BV650	Bdhorizon	569704
CD14	AA750	BC iotest	B92421
HLADR	SNV786	BC iotest	C78087
CD56	AA700	BC iotest	B92446
CD64	BV605	Bdoptibuild	569172
CD36	BV605	BD Horizon	563518
CD10	BV650	Bdoptibuild	745390
CD15	FITC	BD	332778
CD200	BV650	Bdoptibuild	743085
BD FACSCanto II  (8-color, blue/red/violet)		BD Bioscience	338962
BD FACSLyric 3-Laser 12-Color Instrument		BD Bioscience	662383
BC NAVIOSNavios 10 Colors, 3 Lasers, B5-R3-V2 Configuration		Beckman Coulter	B47905
BC DxFLEX  13-Colors, 13 Detectors, 3 Laser,  B5-R3-V5		Beckman Coulter	C78505
BC Kaluza Software v 3.1		Bekman Coulter	A82959
BD FACSuite Software v1.6		BD  Bioscience	651360
BD FACSDiva software v 8.0.3 (Win 7 32 bit OS)		BD  Bioscience	659523
BD CST Beads		BD  Bioscience	656505
Multicolor COMPBEADS		BD  Bioscience	552843
Sphero Rainbow Calibration Particles (8 peaks), 3.0 - 3.4 µm		BD  Bioscience	559123
ClearL Lab Compensation Beads		Beckman Coulter	B99883
PharmLyse NH4Cl 100ml10x conc		BD  Bioscience	555899
DPBS, 1X		CORNING	21-031-CV
Brillant Stain Buffer Plus		BD  Bioscience	566385
MGG (May-Grünwald-Giemsa)		Sigma Aldrich	1014242500