Imaging a due fotoni in tempo reale del metabolismo endoteliale del NAD+ cerebrale nei topi

Sommario

Questo protocollo consente il monitoraggio in tempo reale del metabolismo del dinucleotide dell'adenina adenina endoteliale nel cervello nei topi viventi tramite espressione di biosensori mirati agli endoteliali, preparazione della finestra cranica e imaging a due fotoni.

Abstract

Presentiamo un flusso di lavoro riproducibile per la visualizzazione in tempo reale delle risposte biosensori-canali del nicotinamide adenina dinucleotide (^NAD+) nelle cellule endoteliali microvascolari cerebrali in topi viventi, utilizzando microscopia a due fotoni a finestra cranica e un sensore fluorescente ^NAD+ mirato all'endoteliale. Il protocollo include (1) espressione selettiva del sensore NAD⁺ mediata da virus adenoassociato (AAV) nell'endotelio cerebrovascolare usando AAV-X1.1 sotto il promotore Cdh5 (caderina endoteliale vascolare), (2) preparazione chirurgica di una finestra cranica corticale stabile di 3 mm × 3 mm, e (3) imaging a due fotoni a doppia lunghezza d'onda per catturare simultaneamente il segnale del canale sensore verde eccitato a 920 nm e il tetrametilrodamina intravascolare (TMR)–destrano a 1040 nm canale di riferimento. Il canale TMR–dextrano fornisce un riferimento luminoso vascolare e supporta la selezione del vaso, la valutazione del movimento e la valutazione dell'integrità vascolare. Come esempio applicativo, descriviamo cambiamenti associati al mononucleotide di nicotinamide nella fluorescenza dei canali sensori endoteliali dopo l'acqua potabile, la terapia orale o la somministrazione endovenosa. Questo protocollo enfatizza passaggi critici, considerazioni raccomandate di dosaggio e titolo virale, troubleshooting e strategie di analisi quantitativa, consentendo ai laboratori di implementare il monitoraggio in vivo della dinamica dei canali biosensoriali ^NAD+ cerebrovascolari per studi sul neurometabolismo in condizioni di salute e malattia. 

Introduzione

Il nicotinamide adenina dinucleotide (NAD⁺) è un cofattore centrale per l'equilibrio redox, l'attività mitocondriale, la riparazione del DNA e la segnalazione reattiva allo stress. Nella vascolatura cerebrale, l'omeostasi endoteliale ^NAD+ è sempre più riconosciuta come un regolatore attivo dell'integrità della barriera, del tono vascolare e dell'accoppiamento neurovascolare piuttosto che come una lettura metabolica^{passiva 1}. La perturbazione del metabolismo endoteliale del ^NAD+ è stata collegata a perdite di barriera emato-encefalica (BBB) associate all'invecchiamento e a omeostasi neurovascolare compromessibile, evidenziando la necessità di metodi in grado di risolvere direttamente la dinamica metabolica endoteliale nel tessuto cerebrale^{vivente 2}.

La maggior parte degli approcci attualmente utilizzati per quantificare ^NAD+ si basa su misurazioni biochimiche degli endpoint, colorazioni di tessuto fisso o letture dei sensori ex vivo. Sebbene informativi, questi approcci non preservano l'architettura microvascolare intatta, non possono distinguere facilmente i rapidi cambiamenti interni all'interno dell'animale nel tempo e forniscono una specificità limitata per tipi cellulari quando applicati a tessuti cerebrali eterogenei. Al contrario, l'imaging cronico a due fotoni a finestra cranica consente la visualizzazione ripetuta dei microvasi corticali in topi viventi con alta risoluzione spaziale e temporale, rendendolo particolarmente adatto al monitoraggio di segnali endoteliali metabolicamente responsivi sotto interventi fisiologici o farmacologici^{definiti 3,4,5}.

L'obiettivo generale di questo protocollo è fornire un flusso di lavoro end-to-end per il monitoraggio in tempo reale ^{delle dinamiche} NAD+ endoteliali cerebrali in vivo. Il metodo combina la somministrazione sistemica di un sensore ^NAD+ basato su proteine fluorescenti verdi potenziate (eGFP) e mirato a endoteliali, confezionato nel virus adenoassociato (AAV)-X1.1 e pilotato dal promotore Cdh5, una finestra cranica stabile di 3 mm × 3 mm per l'accesso^{ottico 6,7,8}, e immagini a due fotoni a doppia lunghezza d'onda con un canale di riferimento intravascolare tetrametilrodamina (TMR)–^{dextrano 1}. Il meccanismo del sensore è stato chiarito come segue: Cambronne et al. Il biosensore citoplasmatico NAD⁺ LigA-cpVenus è un sensore a risposta inversa basato su cpVenus. Il legame ^NAD+ riduce la fluorescenza simile a cpVenus/eGFP nella lettura standard di eccitazione a 488 nm, mentre un canale di eccitazione a 405 nm funge da riferimento per la normalizzazione ratiometrica. Pertanto, la fluorescenza verde grezza non dovrebbe essere interpretata come una misura positiva diretta della concentrazione di NAD⁺. In questa implementazione a due fotoni, l'eccitazione a 920 nm viene utilizzata per acquisire il segnale verde del canale sensore, mentre l'eccitazione a 1040 nm viene utilizzata per il canale di riferimento vascolare TMR–dextrano; Pertanto, l'attuale acquisizione di 920/1040 nm non è equivalente a una misura ratiometrica calibrata di 488/405 nm. Il biosensore Cambronne et al. è stato scelto perché è stato ampiamente validato per il monitoraggio della dinamica intracellulare del ^NAD+ ed è compatibile con l'attuale configurazione di imaging a doppia lunghezza d'onda. Sebbene indicatori più recenti come FiNad offrano approcci alternativi per monitorare la dinamica NAD⁺, la loro implementazione richiederebbe la modifica del canale di fluorescenza rosso attualmente utilizzato per l'etichettatura di riferimento vascolare TMR–dextrano. Il sensore Cambronne riporta variazioni relative nella disponibilità di ^NAD+ all'interno di un intervallo dinamico finito ed è stato validato in applicazioni cellulari e subcellulari; tuttavia, l'interpretazione del segnale può essere influenzata dal livello di espressione, dal pH, dal fotosbiancamento e dalla variabilità del percorso ottico, mentre la quantificazione assoluta di ^NAD+ richiede calibrazione o validazione biochimica ortogonale. AAV-X1.1 è stato selezionato perché sono state segnalate varianti endoteliali-tropiche di AAV in modo efficiente nella vascolarizzazione del sistema^{nervoso centrale 6,7}. Nel nostro confronto preliminare di diversi sierotipi AAV, inclusi AAV9, AAV-BR1, AAV-ENT e AAV-X1.1, utilizzando l'espressione proteica fluorescente verde potenziata guidata da CAG o Cdh5 come reporter, AAV-X1.1 ha prodotto il modello di espressione più favorevole associato al vaso tra i sierotipi testati. Il promotore Cdh5 è stato successivamente utilizzato per limitare ulteriormente l'espressione dei transgeni alle cellule endoteliali vascolari, in linea con precedenti rapporti che dimostravano l'espressione selettiva dei transgeni endoteliali in vivo^6.

Rispetto ai saggi NAD+ ex vivo, questo approccio preserva la rete vascolare intatta, consente misurazioni longitudinali nello stesso animale e consente la valutazione simultanea dei segnali metabolici endoteliali e di un riferimento del lumen vascolare. Il flusso di lavoro è particolarmente utile per studi su invecchiamento, stress infiammatorio, disfunzione della BBB e risposte rapide a interventi metabolici come la somministrazione di mononucleotidi di nicotinamide^(NMN) 9,10,11,12,13. Questo metodo è più appropriato quando la domanda sperimentale richiede la visualizzazione ripetuta dei microvasi corticali nei topi viventi e cambiamenti relativi nel segnale del canale sensore endoteliale. È meno adatto per la quantificazione assoluta di ^NAD+ senza una calibrazione ratiometrica aggiuntiva o validazione biochimica. Le limitazioni pratiche includono l'accessibilità ottica corticale, i vincoli di profondità di imaging, la dipendenza da una trasduzione endoteliale AAV di successo, la potenziale infiammazione associata alla finestra cranica e la necessità di un microscopio a due fotoni a doppia lunghezza d'onda. L'impianto cronico della finestra cranica può indurre infiammazione locale, reattività vascolare, gliosi, opacità o rimodellamento dei tessuti, tutti elementi che possono influenzare la fisiologia endoteliale e le misurazioni dei canali ^{sensoriali 1,3,4}. Per minimizzare questi elementi di confusione, il protocollo richiede chirurgia asettica, perforazioni intermittenti con raffreddamento frequente, emostosi attenta, evitamento del contatto adesivo con la dura, analgesia postoperatoria, monitoraggio quotidiano ed esclusione di animali con opacità persistente, detriti infiammatori, infezioni, morfologia vascolare instabile o scarsa stabilità del segnale di base.

Protocollo

Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato Etico Animale dell'Università di Scienze della Salute e della Riabilitazione nell'ambito del progetto intitolato "Studio Meccanicistico dell'Osservazione Metabolica Basata su Sonde Metaboliche dell'Integrità della Barriera Emato-Encefalica" (numero di approvazione KFDX: NO. 2023-1023). Eseguire tutti gli interventi chirurgici in condizioni asettiche e fornire analgesia perioperatoria e cure di supporto secondo il protocollo animale approvato. Nel flusso di lavoro rappresentativo, somministrare buprenorfina cloridrato (0,05–0,1 mg/kg, sottocutaneo) prima o immediatamente dopo l'intervento e poi ogni 8–12 ore per 24–48 ore secondo necessità. Recupera i topi in una gabbia riscaldata e monitorali finché non si ripristinano postura normale, movimenti spontanei e respirazione stabile.

1. Panoramica sperimentale

1. Utilizzare topi adulti C57BL/6J di età compresa tra 10 e 12 settimane e con un peso di 23–25 g per gli esperimenti rappresentativi.
2. Mantenere i topi in condizioni specifiche prive di patogeni con un ciclo luce/buio di 12 ore, una temperatura ambiente di 22°C–24°C, un'umidità relativa del 40%–60% e un accesso ad libitum a cibo e acqua.
3. Acclimata gli animali per almeno 7 giorni prima delle procedure.
4. Usa entrambi i sessi a seconda del disegno sperimentale. Riporta il sesso, il numero di animali e l'allocazione dei gruppi per ogni esperimento. Il dataset di imaging rappresentativo mostrato qui ha utilizzato N = 3 topi.
5. Somministrare prima l'AAV sistemico e consentire un periodo di espressione di 3–4 settimane prima dell'imaging.
6. Eseguire un intervento chirurgico alla finestra cranica 3–5 giorni prima dell'imaging.
7. Anestetizzare i topi il giorno dell'imaging, iniettare TMR–dextrano per via endovenosa ed eseguire immagini dopo una corretta circolazione dei tracciatori.
8. Amministrare NMN secondo il calendario di intervento selezionato. Fornire integrazione con acqua potabile per 5 giorni prima dell'imaging artificiale, eseguire la gara orale a intervalli predefiniti prima dell'imaging o somministrare NMN endovenoso durante la sessione di imaging dopo l'acquisizione del baseline.
   NOTA: Mettere in pausa il protocollo dopo la somministrazione dell'AAV durante il periodo di espressione di 3–4 settimane e mantenere gli animali sotto monitoraggio di routine della salute e condizioni abitative standard. Mettere in pausa il protocollo dopo l'intervento chirurgico della finestra cranica durante il periodo di recupero di 3–5 giorni. Prima di procedere con l'immagini, confermare un peso corporeo stabile, una cura e attività normali, l'assenza di infezioni o infiammazione eccessiva e una finestra cranica chiara.

2. Chirurgia della finestra cranica per imaging corticale longitudinale

1. Preparazione pre-chirurgica
   1. Sterilizza tutti gli strumenti chirurgici e stabilisci un campo sterile prima dell'induzione dell'anestesia.
   2. Imposta il sistema di riscaldamento omeotermico per mantenere la temperatura corporea tra 36,5°C e 37,5°C, preferibilmente utilizzando un controller di feedback a sonda rettale.
   3. Preparare apparecchiature per il monitoraggio respiratorio e confermare la stabilità del funzionamento prima dell'intervento.
   4. Prepara soluzione salina sterile, tamponi assorbenti, materiali emostatici, un copricapo sterile No. 1.5, una testa metallica e cemento dentale prima di iniziare la procedura.
   5. Usa una copertura sterile in vetro No. 1.5 dimensionata per coprire completamente la finestra cranica di 3 mm × 3 mm e posizionarla perfettamente sul bordo del cranio.
   6. Prepara un microtrapano ad alta velocità dotato di una bava da 0,5–1,0 mm.
   7. Fai funzionare il trapano a circa la metà della velocità massima e verifica che l'irrigazione salina sterile possa essere applicata immediatamente durante il diradamento del cranio.
   8. Durante la perforazione, applica soluzione salina sterile a temperatura ambiente con un cotton fioc o un contagocce per raffreddare il cranio e rimuovere la polvere ossea.
2. Anestesia, preparazione del cuoio capelluto ed esposizione al cranio
   1. Anestetizzare i topi con una soluzione lavorativa di Avertin appena preparata (1,25%, 12,5 mg/mL) tramite iniezione intraperitoneale a 200–250 mg/kg.
      1. Preparare la soluzione di lavoro Avertin con 2,2,2-tribromoetanolo e 2-metil-2-butanolo secondo le procedure operative standard istituzionali, proteggere la soluzione dalla luce e scartare le preparazioni che mostrano precipitazioni o decolorazioni.
   2. Confermare un piano chirurgico stabile con la perdita del riflesso di ritiro del pedale e la respirazione stabile.
   3. Applicare una pomata oftalmica su entrambi gli occhi immediatamente dopo l'induzione dell'anestesia.
   4. Se viene utilizzata l'anestesia inalatoria, indurre l'anestesia con isoflurano al 3%–4%.
   5. Mantieni l'anestesia con isoflurano all'1%–2% in ossigeno a 0,5–1,0 L/min e regola in base alla respirazione e ai riflessi.
      ATTENZIONE: Maneggiare gli agenti anestetici secondo le procedure di sicurezza istituzionale e utilizzare sistemi di recupero appropriati durante la somministrazione dell'anestesia inalatoria.
   6. Fissa il mouse in una cornice stereotassica o in un portatesta personalizzato che offra un accesso stabile al cranio dorsale.
   7. Mantieni la temperatura corporea tra 36,5°C e 37,5°C utilizzando una borsa riscaldante a feedback e una sonda rettale quando disponibili.
   8. Rasi il cuoio capelluto e rimuovi i capelli sciolti dal campo chirurgico.
   9. Disinfettare il cuoio capelluto utilizzando soluzione alternata di povidone-iodio o iodoforo e etanolo al 70% per tre cicli.
   10. Evita di permettere al disinfettante di entrare negli occhi o nell'apertura cranica.
   11. Fai un'incisione al cuoio capelluto mediano e ritrai delicatamente la pelle.
   12. Espone il cranio a sufficienza da permettere sia la creazione della finestra cranica sia la fissazione della placca frontale.
   13. Rimuovere il periosto e il tessuto connettivo residuo usando pinze sottili o una lama di bisturi.
   14. Asciugare delicatamente il cranio con cotton fiagna sterili per circa 10–20 secondi finché la superficie non appare opaca invece che umida.
   15. Evita una disidratazione eccessiva dei tessuti esposti.
3. Marcazione di una craniotomia da 3 mm × 3 mm
   1. Identificare bregma e lambda al microscopio chirurgico.
   2. Utilizzare questi punti di riferimento anatomici per orientare la linea mediana e puntare sulla regione corticale.
   3. Segna un quadrato di 3 mm × 3 mm su un emisfero della corteccia somatosensoriale dorsale.
   4. Posizionare il bordo anteriore circa 0,5 mm a posteriore rispetto al bregma e il bordo mediale circa 1,0 mm laterale alla linea mediana.
   5. Evita le suture craniche importanti e i grandi vasi superficiali quando possibile.
4. Perforazione e rimozione del lembo osseo
   1. Assottigliare il cranio lungo il perimetro segnato usando un contatto con la trapano intermittente invece che pressione continua.
   2. Applica ripetutamente soluzione salina sterile durante la perforazione per prevenire danni termici.
   3. Somministrare circa 20–50 μL di soluzione salina sterile per applicazione, o abbastanza da mantenere la superficie del cranio umida e fresca.
   4. Ripeti l'irrigazione ogni 10–20 secondi o ogni volta che si accumula polvere ossea o si sospetta accumulo di calore.
   5. Continua a assottigliare finché l'osso non diventa uniformemente traslucido e leggermente flessibile.
   6. Confermare un adeguato assottigliamento osservando i vasi durali visibili, la preservazione della pulsazione durale e l'assenza di compressione corticale o decolorazione termica.
   7. Smetti immediatamente di perforare se si verifica un eccesso accumulo di calore, sanguinamento o una riduzione della pulsazione durale.
   8. Irriga l'area e rivaluta prima di proseguire.
   9. Solleva delicatamente il lembo osseo da un angolo usando una pinza fine o una punta a ago.
   10. Riassottiglia il perimetro se rimane resistenza.
   11. Conservare la dura duram intatta durante la rimozione del lembo osseo.
   12. Sciacquare via la polvere ossea usando soluzione salina sterile.
   13. Controlla il sanguinamento lieve usando irrigazione salina delicata e tamponi assorbenti.
   14. Considera accettabile il sanguinamento se si risolve entro 1–2 minuti dall'irrigazione e dal contatto con il tampone assorbente.
   15. Escludere l'animale o interrompere la procedura se il sanguinamento persiste per più di circa 5 minuti.
   16. Escludere l'animale o interrompere la procedura se la dura dura viene strappata, si verifica compressione corticale o se il sangue oscura l'area di imaging.
       NOTA: La procedura può essere temporaneamente sostratta dopo l'emostasia completa e prima della posa della copertura. Mantieni la dura esposta in condizioni umide usando soluzione salina sterile e riprendi solo dopo aver confermato l'assenza di sanguinamento attivo.
5. Sigillatura delle finestre e fissazione della piastra frontale
   1. Conferma che la dura esposta sia pulita, umida e priva di sanguinamenti attivi.
   2. Posizionare un sottovestimento sterile sopra la craniotomia.
   3. Posizionare il coperto sul bordo del cranio che circonda la craniotomia senza comprimere la dura.
   4. Verifica la corretta posizione confermando una superficie di copertura a sciacqua, l'assenza di bolle d'aria intrappolate, la pulsazione durale conservata e un percorso ottico libero.
   5. Prepara cemento dentale o adesivo Super-Bond C&B secondo le istruzioni del produttore.
      1. Per la preparazione rappresentativa Super-Bond C&B, miscela 1 cucchiaio di polvere con 1 goccia di catalizzatore e 4 gocce di monomero in una teglia ceramica pre-raffreddata mantenuta a circa −20°C immediatamente prima dell'applicazione.
   6. Applica adesivo solo intorno al bordo esterno del cranio che circonda la copertura.
   7. Evita il contatto adesivo con la dura madre e evita che i capili si ritrovino sotto il vetro.
   8. Lascia indurire l'adesivo per circa 5–10 minuti a temperatura ambiente.
      ATTENZIONE: I componenti adesivi e cementi dentali possono contenere sostanze chimiche volatili o irritanti. Maneggiali secondo le procedure di sicurezza istituzionale e utilizza una ventilazione adeguata.
   9. Posiziona una placca frontale in titanio personalizzata attorno alla finestra cranica.
   10. Utilizza una piastra frontale con un'apertura centrale di circa 10 mm compatibile con il supporto per la testata a immagini.
   11. Centra la finestra cranica all'interno dell'apertura della piastra frontale.
   12. Applica il cemento dentale solo nelle aree a contatto con il cranio al di fuori della finestra ottica.
   13. Lascia che il cemento si indurisca completamente per circa 5–10 minuti prima di spostare l'animale.
6. Recupero post-operatorio e controllo qualità delle finestre
   1. Somministrare analgesia post-operatoria secondo il protocollo animale approvato.
   2. Nel flusso di lavoro rappresentativo, somministrare buprenorfina cloridrato a 0,05–0,1 mg/kg sottocutaneamente ogni 8–12 ore per 24–48 ore.
   3. Recupera i topi in una gabbia riscaldata.
   4. Monitora quotidianamente respirazione, postura, movimento, toelettatura e peso corporeo.
   5. Accettare finestre craniche che presentino una superficie di vetro trasparente, visibile vascolarizzazione corticale, duramota intatta, residui minimi di sangue, nessun adesivo sotto la copertura, nessuna infezione e fissazione stabile della placca frontale.
   6. Escludere animali con marcata opacità, sanguinamento persistente, detriti infiammatori, infezioni, spostamento delle finestre, perdita di peso grave (>15%) o scarsa cura e attività.
   7. Procedere con l'imaging dopo 3–5 giorni di recupero.
   8. Confermare attività normale, comportamento di toelettatura normale, peso corporeo stabile, assenza di dolore o infezione e una finestra cranica trasparente con vasi chiaramente visibili prima dell'imaging di esposizione.
      NOTA: Il protocollo può essere sospeso durante il periodo di recupero post-operatorio. Mantenere i topi nelle condizioni abitative standard, monitorare quotidianamente il peso corporeo e la chiarezza delle finestre e riprendere l'imaging solo dopo aver soddisfatto tutti i criteri di recupero.

3. Espressione del sensore endoteliale ^NAD+ mediata da AAV

1. Costruzione virale e preparazione
   1. Utilizzare un biosensore ^NAD+ geneticamente codificato basato su eGFP/cpVenus, pilotato dal promotore endoteliale Cdh5.
   2. Usa Cambronne et altri. Sequenza biosensore citoplasmatica NAD⁺ di LigA-cpVenus (ad esempio, plasmide Addgene #186787 o un inserto equivalente verificato per sequenza).
   3. Clonare il promotore Cdh5 a monte della sequenza di codifica del biosensore NAD⁺ utilizzando la spina dorsale vettoriale CV232.
   4. Confeziona la cassetta di espressione nella capside AAV-X1.1 come preparazione virale personalizzata.
      1. Annota il fornitore di produzione virale, il metodo di purificazione, il metodo di quantificazione del genoma virale, il numero di lotto di produzione e il certificato di analisi per ogni preparazione AAV.
   5. Registrare la mappa del plasmide, i risultati della verifica della sequenza, le informazioni sulla produzione virale, le informazioni sulla purificazione, il titolo del genoma virale e il certificato di analisi per ogni preparazione virale.
      1. Registra la mappa costruttiva, il rapporto di verifica della sequenza, il numero di batch di produzione virale, il rapporto di titolazione quantitativo della reazione a catena della polimerasi (qPCR), la documentazione di purificazione e il certificato di analisi per ogni preparazione virale utilizzata nello studio.
   6. Consulta la Tabella dei Materiali per tutti i dettagli dei costrutti.
   7. Utilizzare preparazioni AAV ad alto titolo con titoli qPCR specifici per lotto, tipicamente superiori a 2 × 10¹³ vg/mL.
   8. Conserva le aliquote monouso a −80°C.
   9. Evita cicli ripetuti di congelamento-disgelo.
   10. Registra il lotto di produzione, il titolo qPCR, la durata di stoccaggio e la variazione accettabile da lotto a lotto prima dell'uso.
2. Somministrazione sistemica di AAV
   1. Scongelare una aliquota virale sul ghiaccio.
   2. Diluire il virus in soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) fino a un volume finale di iniezione di 100–200 μL per topo.
   3. Mantenere una dose finale di 2 × 10¹² vg per topo su tutti gli animali.
      1. Calcola il volume di iniezione dal titolo genomico virale specifico per lotto. Per la preparazione rappresentativa con un titolo qPCR di 1,39 × 10¹³ vg/mL, iniettare circa 144 μL per somministrare una dose di 2 × 10¹² vg per mouse.
   4. Somministrare il virus tramite iniezione del seno venoso retro-orbitale usando una siringa sterile di insulina da 29 G.
   5. Iniettare la sospensione virale lentamente per circa 10–20 secondi.
   6. Confermare il parto riuscito verificando l'assenza di perdite, sanguinamenti eccessi e lesioni oculari.
   7. Valida e segnala separatamente qualsiasi via alternativa di amministrazione.
   8. Osserva il topo finché la postura normale e i movimenti spontanei non saranno ripristinati.
   9. Confermare respirazione stabile e assenza di sanguinamento o disagio.
   10. Riporta l'animale nella gabbia solo dopo la completa guarigione.
   11. Prevedi 21–28 giorni per l'espressione del sensore prima dell'imaging.
   12. Mantenere un intervallo di espressione coerente all'interno di ogni set di confronto.
   13. Validare separatamente gli intervalli di espressione al di fuori dell'intervallo 21–28 giorni.
       NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa durante il periodo di espressione AAV. Mantieni la gestione di routine e il monitoraggio della salute e procedi con la chirurgia della finestra cranica solo dopo che l'intervallo di espressione previsto è scaduto e l'animale è rimasto in salute.
3. Validazione della restrizione endoteliale
   1. Seleziona gli animali prima della raccolta formale dei dati.
   2. Accettare animali quando il segnale verde del canale sensore è rilevabile e segue la rete vascolare.
   3. Confermare che il segnale sia arricchito lungo le pareti del vaso adiacenti al lumen TMR–dextran–positivo.
   4. Confermare l'assenza di fluorescenza parenchimale diffusa dominante.
   5. Applicare criteri di accettazione identici in tutti i gruppi sperimentali.
   6. Usa i topi con PBS seguiti dal 4% di paraformaldeide quando è richiesta una validazione post hoc.
   7. Raccogliere il cervello e preparare sezioni coronali o sagittali da 30–40 μm.
   8. Sezioni di colorazione con marcatori endoteliali come lectina di pomodoro, CD31 o cadherina endoteliale vascolare (VE-cadherina).
      1. Annota la fonte degli anticorpi, il numero di catalogo, il numero di lotto, la specie ospite, la diluizione, le condizioni di incubazione e il metodo di rilevamento per ogni esperimento di validazione.
   9. Valutare l'espressione della nicotinamida fosforibosiltransferasi (NAMPT) e della poli(ADP-ribosio) polimerasi 1 (PARP1) quando necessario.
   10. Utilizzare diluizioni primarie ad anticorpi ottimizzate per la preparazione tissutale.
   11. Acquisire immagini fluorescenti o confocali usando le stesse impostazioni di acquisizione tra i gruppi.
   12. Quantificare la colocalizzazione come la frazione di segnale sensore positivo che si sovrappone o immediatamente adiacente alle regioni positive con marcatori vascolari.
   13. Escludere gli animali quando il segnale più rilevabile si trova all'esterno delle strutture vascolari.
   14. Escludere gli animali quando manca l'arricchimento della parete del recipiente.
   15. Escludere gli animali quando la fluorescenza parenchimante fuori bersaglio impedisce una selezione affidabile della regione di interesse.
   16. Escludere gli animali quando la fluorescenza del canale sensoriale è satura o instabile durante l'acquisizione di base.

4. Imaging a due fotoni e analisi quantitativa

1. Preparazione del giorno di imaging e etichettatura di riferimento intravascolare
   1. Anestesiare i topi con una soluzione lavorativa Avertin appena preparata (1,25%, 12,5 mg/mL) tramite iniezione intraperitoneale a 200–250 mg/kg, oppure utilizzare il regime anestetico approvato dal protocollo istituzionale sugli animali.
   2. Confermare un piano chirurgico stabile con perdita di ritiro del pedale e respirazione stabile.
   3. Applica la pomata oftalmica subito dopo l'induzione.
   4. Se viene utilizzata l'anestesia inalatoria, indurre l'anestesia con isoflurano al 3%–4%.
   5. Mantieni l'anestesia con isoflurano all'1%–2% in ossigeno a 0,5–1,0 L/min e regola in base alla respirazione e ai riflessi.
   6. Preparare 70 kDa TMR–destrono in PBS sterile a 10–25 mg/mL.
   7. Proteggere la soluzione TMR–dextrano dalla luce e filtrare la soluzione se richiesto dalla pratica istituzionale.
   8. Iniettare TMR–destrono per via endovenosa a 20 mg/kg.
   9. Regola il volume di iniezione in base alla concentrazione di stock. Per un topo da 25 g, somministrare circa 0,5 mg di colorante totale.
   10. Prepara il tracciante fresco o conserva le aliquote protette dalla luce secondo le raccomandazioni del produttore.
   11. Lascia circolare il TMR–destrono per 5–10 minuti prima dell'acquisizione dell'immagine.
2. Configurazione del microscopio
   1. Utilizzare un microscopio a due fotoni a doppia lunghezza d'onda configurato per un'eccitazione a 920 nm del canale sensore basato su eGFP.
   2. Utilizzare un percorso di eccitazione a 1040 nm per il canale di riferimento vascolare TMR–dextrano.
   3. L'imaging rappresentativo è stato eseguito su un microscopio multifotonico Nikon A1 MP/A1R MP+ controllato dal software di analisi AR/AR NIS Elements (versione 5.42.06).
   4. Registra le sorgenti laser, i parametri degli impulsi, la configurazione delle combinazioni di fascio, il tipo di rivelatore e la versione software per ciascun sistema di imaging.
   5. Configurare i canali di rilevamento per separare il segnale del canale sensore dal segnale TMR–destro.
   6. Utilizzare tubi fotomoltiplicatori non scansionati (PMT) o rivelatori di fosfuro di arseniuro di gallio (GaAsP).
   7. Raccogliere l'emissione verde del canale sensore tra circa 500 e 550 nm.
   8. Raccogliere l'emissione TMR–dextrano tra circa 570 e 650 nm.
      1. Nel dataset rappresentativo, raccogliere l'emissione verde del canale sensore utilizzando un filtro di emissione da 525/50 nm e raccogliere l'emissione TMR–destrono usando un filtro di emissione da 575/25 nm o 610/75 nm.
   9. Minimizzare il flusso spettrale tra i canali.
   10. Mantieni costanti le impostazioni di guadagno e offset del rilevatore all'interno di ogni set di confronto.
   11. Verifica la separazione dei canali utilizzando controlli a canale singolo quando disponibili.
   12. Usa un obiettivo a immersione in acqua Nikon CFI75 Apochromat 25XC W 1300 o equivalente (25×, diaframma numerica 1.10, distanza di lavoro 2.0 mm).
   13. Confermare la co-registrazione del canale utilizzando punti di riferimento vascolari fissi come biforcazioni e bordi del lume.
   14. Ripeti la verifica della co-registrazione dopo qualsiasi aggiustamento del percorso ottico.
   15. Misura la potenza del laser al piano del campione prima dell'imaging (imagining).
   16. Mantenere una costante di potenza laser a 920 nm all'interno di ogni set di confronto.
   17. Mantieni una costante di potenza laser di 1040 nm all'interno di ogni set di confronto.
   18. Utilizzare circa 10–20 mW a 920 nm e 8–18 mW a 1040 nm come range di lavoro rappresentativi.
   19. Regolare la potenza del laser in base alla profondità di imaging e alla qualità della finestra cranica.
   20. Escludere i campi che mostrano una perdita di segnale superiore al 20% durante il periodo di base di 120 s.
   21. Escludere i campi che mostrano cambiamenti fototossici visibili.
3. Ambientazioni di acquisizione
   1. Seleziona campi visivi con una finestra ottica chiara, microvaselle nitidamente messe a fuoco e movimento minimo.
   2. Accettare finestre con copertura trasparente, vascolarizzazione corticale visibile, duramotore intatta, residui minimi di sangue, nessun adesivo sotto la copertura, nessuna infezione e fissazione stabile della corazza.
   3. Escludere animali con marcata opacità, sanguinamento persistente, detriti infiammatori, infezioni, spostamento delle finestre, perdita di peso grave (>15%) o scarsa toelettatura/attività.
   4. Acquisire immagini time-lapse a 512 × 512 pixel.
   5. Acquisire immagini statiche rappresentative a 1024 × 1024 pixel quando è necessario un maggiore dettaglio spaziale.
   6. Mantieni costanti la dimensione dei pixel, lo zoom, la velocità di scansione e il campo visivo all'interno di ogni set di confronto.
   7. Acquisire z-stack utilizzando una dimensione di passo di 1–3 μm.
   8. Immagini dei microvasi corticali a profondità di circa 200–250 μm sotto la superficie pial.
   9. Estendere la profondità di imaging a circa 400 μm quando la qualità delle finestre lo consente.
   10. Mantieni costante la profondità di imaging per confronti abbinati.
   11. Acquisire una base di 120 s ogni 1 s prima degli interventi acuti.
   12. Continuare l'acquisizione per il periodo predefinito post-intervento.
   13. Registrare risposte NMN endovenose per circa 10–30 minuti dopo l'iniezione.
   14. Acquisire dataset di acqua potabile e di gavage orali a endpoint sperimentali predefiniti.
   15. Mantieni le stesse impostazioni di acquisizione in tutti i gruppi di confronto.
4. Intervento NMN (esempio di applicazione)
   1. Sciogliere NMN in acqua potabile sterile.
   2. Regolare la concentrazione di NMN per somministrare circa 100 mg/kg/giorno.
   3. Proteggi la bottiglia dalla luce.
   4. Sostituire l'acqua potabile contenente NMN ogni 24–48 ore.
   5. Monitora il consumo d'acqua utilizzando misurazioni del peso della bottiglia.
   6. Calcola l'assunzione stimata di NMN utilizzando il consumo d'acqua e il peso corporeo.
   7. Continuare l'integrazione per 5 giorni prima dell'estensione delle immagini.
   8. Prepara NMN a 1 mg/mL per la garvaga orale.
   9. Somministrare 200 μL per mouse utilizzando un ago a punta arrotondata da 20G e 38 mm.
   10. Esegui immagini 30–60 minuti dopo il vavaggio.
   11. Preparare NMN a 1 mg/mL per la somministrazione endovenosa.
   12. Iniettare 100 μL per topo attraverso il seno venoso retro-orbitale o la vena caudale.
   13. Somministra l'iniezione lentamente per 10–20 secondi.
   14. Inizia subito l'imaging o entro 5 minuti dall'iniezione.
   15. Acquisire dataset sull'acqua potabile dopo 5 giorni di integrazione.
   16. Acquisire dataset orali e gavage in un momento fisso post-gavage.
   17. Acquisire una base di base immediatamente prima dell'iniezione endovenosa.
   18. Registrare risposte acute per circa 10–30 minuti dopo l'iniezione endovenosa.
5. Elaborazione delle immagini ed estrazione del segnale
   1. Esegui la correzione del movimento quando sono presenti artefatti di movimento.
   2. Usa Fiji/ImageJ (versione 1.8.0 o successiva) con StackReg, TurboReg o un algoritmo equivalente di registrazione a corpo rigido.
   3. Utilizzare i punti di riferimento vascolari nel canale TMR–dextrano per guidare la registrazione.
   4. Accettare i dataset solo quando lo spostamento residuo è inferiore a circa 1–2 pixel dopo la correzione.
   5. Confermare che i confini della regione vascolare di interesse (ROI) rimangano stabili durante tutta l'acquisizione.
   6. Utilizzare il canale TMR–dextrano per segmentare i lumen del recipiente.
   7. Definisci i ROI endoteliali immediatamente adiacenti al lume.
   8. Seleziona microvasi con marcatura luminosa stabile, movimento minimo e segnale visibile nel canale sensore.
   9. Analizza diametri di vasi di circa 5–80 μm.
   10. Definire i ROI endoteliali come regioni associate alla parete vasiale, larghe circa 2–5 μm.
   11. Analizza 3–5 imbarcazioni per campo visivo quando disponibili.
   12. Analizza da 1 a 3 campi visivi per mouse quando disponibili.
   13. Definire i ROI di fondo nelle regioni tissutali prive di segnale tracciante e sensore.
   14. Posizionare i ROI di fondo ad almeno 20 μm di distanza da vasi analizzati e artefatti di immagini.
   15. Sottrai l'intensità media di fondo da ciascun canale prima della normalizzazione.
   16. Applica la stessa strategia di sottrazione dello sfondo a tutti i campioni.
   17. Estraggiamo i valori medi di intensità delle serie temporali per F_sensor(t).
   18. Estraggiamo i valori medi di intensità delle serie temporali per F_ref(t).
   19. Esegui misurazioni utilizzando l'analisi R/AR NIS Elements o Fiji/ImageJ.
   20. Esporta file immagine grezze come file ND2.
   21. Esportare copie di analisi come stack TIFF a 16 bit quando possibile.
   22. Esporta i dati delle serie temporali ROI come file CSV.
   23. Calcola i valori di fluorescenza sottratti dal fondo prima della normalizzazione.
   24. Calcola ΔF/_{F 0} usando ΔF/F₀ = (F(t) − F₀)/_{F 0}.
   25. Definisci F₀ come il segnale medio durante il periodo di base di 120 s.
   26. Calcola la normalizzazione del riferimento vascolare come F_sensor(t)/F_ref(t).
   27. Riportate la variazione di picco, il tempo di picco, l'area sotto la curva e la cinetica del recupero quando la durata dell'acquisizione lo permette.
   28. Non interpretare il segnale del canale sensore a 920 nm come una concentrazione calibrata di NAD⁺ .
   29. Eseguire ulteriori calibrazioni ratiometriche o validazioni biochimiche quando sono necessarie misurazioni quantitative di ^NAD+ .
6. Statistiche e reportage
   1. Definisci il topo come l'unità sperimentale biologica.
   2. Misurazioni medie a livello di vaso all'interno di ogni topo prima dell'analisi a livello di gruppo o applicare un modello statistico annidato.
   3. Utilizzare test t a due code abbinate per confronti all'interno del mouse distribuiti normalmente.
   4. Utilizzare test di rango firmato con parete di Wilcoxon quando le assunzioni di normalità non sono soddisfatte.
   5. Utilizzare modelli ANOVA a misure ripetute o a effetti misti per analisi che coinvolgono più di due condizioni correlate.
   6. Applicare correzioni appropriate per confronti multipli.
   7. Eseguire analisi statistiche utilizzando GraphPad Prism o software equivalente.
   8. Definisci la significanza statistica come p < 0,05.
   9. Riporta il test statistico esatto in ogni legenda della figura.
   10. Codica i file immagine prima della selezione e quantificazione del ROI quando possibile.
   11. Mantieni l'analisi accecante fino a quando le misurazioni del ROI e le decisioni di controllo qualità non saranno complete.
   12. Utilizzare N = 3 topi come unità sperimentale biologica nel dataset rappresentativo.
       NOTA: Non mettere in pausa l'acquisizione dell'immagine durante l'imaging attivo in time-lapse. L'elaborazione delle immagini e l'analisi quantitativa possono essere messe in pausa dopo l'esportazione dei dati grezzi. Memorizza file ND2, file di analisi TIFF, file ROI, metadati e tabelle di misurazione CSV in un archivio con backup. Annota la potenza del laser, le impostazioni del rilevatore, la profondità di immagini, l'identificazione dell'animale, l'assegnazione del trattamento e le decisioni di esclusione per ogni sessione di imaging.

Risultati

Una preparazione riuscita produce una finestra cranica trasparente e meccanicamente stabile, adatta all'imaging longitudinale. La Figura 1A riassume il flusso di lavoro procedurale dall'anestesia e l'esposizione del cranio fino alla craniotomia, posizionamento del coverslip, fissazione della placca frontale e recupero post-operatorio. La Figura 1B presenta fotografie seriali rappresentative dei principali passaggi chirurgici. Le...

Discussione

Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro end-to-end per monitorare in vivo ^{il metabolismo} del NAD+ endoteliale cerebrale. I principali determinanti del successo includono: (i) chiarezza e stabilità delle finestre, inclusa la minimizzazione del danno termico e il controllo dello spurgo durante la perforazione; (ii) specificità endoteliale e adeguata espressione del sensore ottenuta tramite una selezione appropriata del capside, promotore, dose e intervallo di esp...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
2,2,2-Tribromoetanolo (Avertin)	Sigma-Aldrich	T48402	ATTENZIONE: Sostanza chimica tossica/nociva. Utilizzato per preparare la soluzione anestetica Avertin per la chirurgia della finestra cranica. Soluzione di lavoro tipica: 1,25% (12,5 mg/mL), somministrata per via intraperitoneale a 200–250 mg/kg.
2-Metil-2-butanolo	Sigma-Aldrich	152463	ATTENZIONE: Sostanza chimica tossica/nociva. Solvente utilizzato per la preparazione della soluzione concentrata di Avertin. Proteggere dalla luce e scartare le preparazioni che mostrano precipitazione o scolorimento.
Tamponcini assorbenti	Winner Medical	Tamponcini di cotone sterili	Utilizzati per l'emostasi, l'asciugatura del cranio, l'irrigazione e il mantenimento del campo operatorio.
AAV-X1.1-Cdh5-citoplasmatico NAD+ biosensore-SV40 pA	Shanghai GeneChem Co., Ltd.; Addgene fonti per plasmidi	Costrutto GeneChem GCPV5052075; Addgene #186787; Addgene #196836	Biosensore NAD+ mirato agli endotelial confezionato in AAV-X1.1. Cassetta espressiva: promotore Cdh5–biosensore citoplasmatico NAD+–poli(A) SV40. Dose di iniezione rappresentativa: 2 × 10¹² vg/topo. Conservare gli aliquoti a −80 °C ed evitare cicli ripetuti di congelamento–scongelamento. Registrare il titolo qPCR specifico del lotto, il numero di lotto, la mappa del plasmide, la verifica della sequenza e il certificato di analisi.
Agente analgesico (buprenorfina cloridrato)	MCE	HY-B0071	Analgesia perioperatoria e postoperatoria. Dose rappresentativa: 0,05–0,1 mg/kg per via sottocutanea ogni 8–12 h per 24–48 h.
Sistema di somministrazione dell'anestesia	RWD Life Science	R500 con vaporizzatore R580	Utilizzato per la somministrazione di isoflurano durante l'imaging. Flusso di ossigeno tipico: 0,5–1,0 L/min.
Agente anestetico (isoflurano)	RWD Life Science	Serie R510-22	Utilizzato per l'anestesia da imaging. Impostazioni tipiche: 3–4% induzione e 1–2% mantenimento.
Coverslip	Su misura	Nessun numero di catalogo	Coverslip di vetro No. 1,5 sterile dimensionato per coprire completamente una finestra cranica di 3 × 3 mm e aderente al bordo del cranio.
Cement/adesivo dentale	Sun Medical	Super-Bond C&B; VZB/JAP8147	Utilizzato per la sigillatura della finestra cranica e il fissaggio della placca frontale in titanio. Preparazione rappresentativa: 1 cucchiaio di polvere, 1 goccia di catalizzatore e 4 gocce di monomero. Indurire circa 5–10 min a temperatura ambiente.
Trapano dentale	RWD Life Science	Microtrapano 78001	Trapano ad alta velocità utilizzato per l'assottigliamento del cranio e la craniectomia. Utilizzare circa la metà della velocità massima con frequente raffreddamento con soluzione salina.
Soluzione disinfettante	Winner Medical	Povidone-iodo/iodoforo e etanolo al 70%	Utilizzato per la preparazione del cuoio capelluto prima della chirurgia. Applicare disinfettanti alternati per tre cicli.
Pinzette sottili	JZ Brand	JD1050/JD1070	Utilizzate per la rimozione del periostio, la manipolazione dei tessuti e il sollevamento del lembo osseo.
Sonda per somministrazione orale	RWD Life Science	20G, 38 mm, punta a sfera	Utilizzato per la somministrazione orale di NMN.
Placca frontale	Su misura	Nessun numero di catalogo	Placca frontale in titanio con apertura centrale di circa 10 mm compatibile con il supporto per l'imaging.
Cuscinetto riscaldante/controllore omeotermico	RWD Life Science	69020 con cuscinetto 69023	Utilizzato per mantenere la temperatura corporea a circa 36,5–37,5 °C durante la chirurgia e l'imaging.
Software di acquisizione immagini	Nikon	NIS-Elements AR/AR Analysis v5.42.06	Utilizzato per il controllo del microscopio e l'acquisizione di immagini. Le impostazioni rappresentative includono 512 × 512 o 1024 × 1024 pixel, passo z di 1–3 µm e intervallo di time-lapse di 1 s.
Software di analisi delle immagini	NIH	Fiji/ImageJ v1.8.0 o successivo	Utilizzato per la correzione del movimento, la selezione delle ROI, la sottrazione dello sfondo, l'estrazione dell'intensità e l'esportazione in CSV.
Forniture per iniezione endovenosa	BD	329461	Siringa insulinica sterile da 1 mL con ago da 29G per iniezioni di AAV, TMR–destrano e NMN.
NMN (nicotinamide mononucleotide)	Selleck Chemicals	S5259	Precursore di NAD+ utilizzato per esperimenti di somministrazione tramite acqua potabile, somministrazione orale e somministrazione endovenosa.
Unguento oftalmico	Farmacia certificata locale	Non applicabile	Utilizzato per prevenire l'essiccazione della cornea durante l'anestesia.
Soluzione tampone fosfato (PBS)	Servicebio	G4202-100ML o G4202-500ML	PBS 1× sterile utilizzato per la diluizione virale, la preparazione del tracciante, il risciacquo dei tessuti e la preparazione dei reagenti.
Sistema di monitoraggio respiratorio	RWD Life Science	Modulo di monitoraggio integrato	Utilizzato per monitorare la respirazione e la profondità dell'anestesia durante la chirurgia e l'imaging.
Soluzione salina (0,9% NaCl, sterile)	Servicebio	G4702-500ML	Utilizzato per il raffreddamento del cranio, l'irrigazione, l'umidificazione dei tessuti e la preparazione delle soluzioni.
Struttura stereotassica/supporto per la testa	Su misura	Nessun numero di catalogo	Utilizzato per il posizionamento stabile durante la chirurgia della finestra cranica e l'imaging.
Microscopio chirurgico	Olympus	SZ61	Utilizzato durante la chirurgia della finestra cranica per l'assottigliamento del cranio, la craniectomia e il posizionamento del coverslip.
TMR–dest