Tecniche efficienti di identificazione per 61 cultivar di tè oleoso (Camellia oleifera abel) utilizzando la strategia MCID e i marcatori del DNA

Sommario

Questo studio ha utilizzato un diagramma manuale di identificazione dei cultivar (MCID) derivato dai modelli di banding del DNA Random Amplificato Polymorphic DNA (RAPD) per identificare in modo efficiente e riproducibile 61 cultivar di Camellia oleifera Abel per l'utilizzo delle risorse di germoplasma e l'identificazione delle cultivar di tè oleoso.

Abstract

È fondamentale identificare i materiali e le varietà di germoplasma di Camellia oleifera Abel [tè olioso (Ot)] per valutare le risorse di germoplasma e per approvare i meccanismi di protezione delle varietà Ot. Questo studio ha impiegato una tecnica ottimizzata del RAPD aumentando la lunghezza del primer RAPD e selezionando la temperatura di ricottura per PCR, che ha identificato 61 cultivar Ot provenienti da varie regioni. Inoltre, è stato sviluppato un MCID per progettare marcatori RAPD efficienti per l'identificazione delle cultivar. Da 80 primer arbitrari RAPD a 11-nt, sono stati selezionati 10 primer che producono bande polimorfiche chiare (PB) per l'analisi PCR delle 61 cultivar. Inoltre, la strategia MCID è stata impiegata per distinguere manualmente 61 cultivar basandosi sui PB osservati nelle impronte digitali del DNA dai 10 primer, che hanno generato il diagramma di identificazione della cultivar Ot (Ot-CID). Questo Ot-CID indicava ogni cultivar singolarmente, utilizzando PB per l'identificazione della cultivar, con i primer appropriati posizionati correttamente sull'Ot-CID. La strategia MCID offre un approccio semplice e pratico per l'identificazione delle piante utilizzando marcatori del DNA. Inoltre, questo approccio fornisce un metodo pratico ed efficiente per l'identificazione delle cultivar. L'Ot-CID risultante, composto da 61 cultivar Ot, ha efficacemente distinto le varianti Ot utilizzando marcatori RAPD, facilitando così la differenziazione delle cultivar per la protezione dei diritti della cultivar e l'identificazione precoce delle piantine nell'industria dei vivai.

Introduzione

Camellia oleifera Abel [tè a olio (Ot)] è una delle specie di alberi legnose commestibili più importanti al^mondo. La Cina è considerata il centro di origine e diversità dell'Ot, con abbondanti risorse di^{germoplasma 2}. L'antica tradizione dell'Ot, la propagazione vegetativa e i vari programmi globali di selezione hanno portato all'emergere di numerose^cultivar. La diffusa coltivazione globale della cultura Ot ha portato alla nascita di cultivar con omonimi (cultivar distinti con lo stesso nome) e sinonimi (cultivar con più di un nome)⁴. Pertanto, è fondamentale sviluppare tecniche per gestire una vasta gamma di germoplasma Ot e distinguere accuratamente le varie^{cultivar 3,5}.

Nonostante l'applicazione di marcatori molecolari basati sul DNA nella caratterizzazione delle cultivar, nella ricerca genetica e nell'identificazione degli Ot, che possono chiarire la diversità genetica e differenziare gli individui delle piante, nessuno studio ha identificato con successo un numero sostanziale di cultivar Ot né fornito una base affidabile per la differenziazione ^{delle cultivar} 6,7,8,9 . La mancanza di metodi affidabili è il principale limitamento per l'applicazione dei marcatori del DNA nell'identificazione delle colture vegetali. Questo potrebbe essere dovuto al fatto che le tecniche analitiche utilizzate per le impronte digitali del DNA non possono fornire informazioni pertinenti che specifichino distintamente primer e marcatori polimorfici per differenziare le cultivar che richiedono identificazione. Le tecniche analitiche per i pattern di banding del DNA (chiamate analisi a gruppi) non sono adatte per distinguere efficacemente cultivar o specie.

Sebbene siano state sviluppate schede di identificazione molecolare del DNA (ID) per oltre 200 cultivar Ot utilizzando i marcatori^SNP 2,3,10,11, ci sono ancora diverse sfide: (1) Il genoma Ot è complesso, con la maggior parte delle camelie coltivate esaploide, mentre il genoma di riferimento utilizzato per costruire le ID molecolari del DNA è triploide, il che può portare a certe ^{imprecisioni 3}. (2) Il sequenziamento dell'intero genoma è costoso, specificamente per laboratori con strutture limitate, impedendone l'applicazione diffusa per l'analisi su larga scala di varietà. Inoltre, i prodotti di amplificazione PCR richiedono sequenziamento o rilevamento a fluorescenza, complicando ulteriormente il processo¹². (3) In assenza di marcatori distintivi per le nuove varietà, è necessario sviluppare nuovi primer per marcatori, che richiederanno anche la ricodifica dei codici delle carte d'identità per i tipi esistenti. Questo comporta una quantità schiacciante di posizioni di codice, riducendo l'efficacia della differenziazione delle varietà. Pertanto, è essenziale adottare una tecnica che fornisca una verifica facile, affidabile, riferibile e pratica delle cultivar Ot per il settore dei vivai Ot, l'attività agricola, la protezione brevettuale delle piante e la conservazione e valutazione delle risorse^genetiche.

Le strategie tradizionali per l'identificazione delle cultivar si basavano su caratteristiche morfologiche, fisiologiche e agronomiche, ma queste caratteristiche presentano dei limiti poiché sono suscettibili alle influenze ambientali e richiedono una valutazione completa delle piante completamente^{sviluppate 13,14}. Inoltre, i marcatori molecolari hanno il vantaggio distintivo di non essere influenzati dalle variabili ambientali, fungendo così da strumento efficiente per la caratterizzazione accurata delle^{cultivar 14,15}. Recentemente, sono stati stabiliti vari indici basati sul DNA per valutare impronte digitali, diversità genetica, cultivar e purezza 16,17,18,19,20,21,22^. Il marcatore RAPD è vantaggioso per l'analisi delle cultivar grazie alla sua semplicità, efficienza e al fatto che non è necessario fornire dati di sequenza^{precedenti 23,24}. L'approccio RAPD può essere potenziato selezionando primer a 11 nucleotidi (nt) insieme alla loro temperatura specificata di ricottura PCR per la sua applicazione nell'impronta digitale vegetale, stabilendo così il RAPD come metodo preferito per l'identificazione delle varietà vegetali e la valutazione della diversità^{genetica 25,26}. Questi marcatori sono stati ampiamente utilizzati in studi di differenziazione delle colture e correlazione genetica di varie specie vegetali, tra cui albicocca²⁷, pesca^{ornamentale 28},^{melograno 29}, landrace²⁰ e^{noce 30} (Çilesiz et al., 2025). Nonostante il loro uso diffuso, molti approcci basati su marcatori del DNA rimangono insufficienti o semplificati per l'identificazione di routine delle varietà vegetali.

Pertanto, questo studio ha utilizzato una nuova tecnica analitica per l'identificazione riproducibile di varie varietà di Ot. Il MCID, derivato dai modelli di banda RAPD, ha differenziato 61 cultivar Ot per l'utilizzo delle risorse di germoplasma e l'identificazione delle cultivar.

La strategia RAPD-MCID descritta qui (Figura 1) è più adatta per la caratterizzazione di germoplasma su piccola e media scala in laboratori con infrastrutture standard per PCR e elettroforesi su gel ma con accesso limitato alle strutture di sequenziamento. È inoltre molto adatto per uno screening preliminare rapido ed economico prima di un'analisi genetica più dettagliata. I principali limiti operativi del metodo includono la sua dipendenza dai marcatori dominanti e la necessità di un'attenta standardizzazione delle condizioni PCR per garantire la riproducibilità tra laboratori. Per le banche di germoplasma su larga scala o la registrazione legale di varietà, si raccomanda l'uso complementare di marcatori co-dominanti come SSR o SNP.

Protocollo

1. Materiale vegetale

1. Raccogliere foglie giovani da germogli sani e in crescita attiva di ogni cultivar di tè oleoso dal Deposito Nazionale di Germoplasmi di Camellia, Contea di Shucheng, provincia di Anhui.
2. Consulta la Tabella 1 per i nomi e le origini di queste cultivar.

2. Estrazione del DNA genomico

1. Estrai il DNA genomico totale utilizzando un kit di estrazione di DNA vegetale secondo le istruzioni del produttore.
2. Il DNA è stato eluzionato con un buffer di 1× TE. Dopo l'eluzione, confermare che la soluzione di DNA estratta appare chiara e incolore. Misura la concentrazione di DNA utilizzando uno spettrofotometro a microvolume.
3. Regolare la concentrazione di DNA a 30 ng·^μL-1 con 1× tampone TE e conservare la soluzione di DNA adattata a -20 °C.

3. Selezione del primer RAPD

1. Sviluppare 80 primer casuali per l'analisi RAPD e analizzarli utilizzando pochi genotipi. Seleziona primer RAPD 11-nt che producano schemi di bande chiari e inequivocabili su tutti i genotipi testati.
2. Utilizzare i primer selezionati per la genotipizzazione per aumentare la credibilità dei frammenti amplificati. Seleziona 10 primer ben risolti con bande riproducibili per ulteriori analisi, come elencato nella Tabella 2.

4. PCR di DNA polimorfico amplificato casualmente (RAPD)

1. Prepara le reazioni di amplificazione modificando leggermente il metodo²³ descritto in precedenza. Prepara le soluzioni di reazione secondo la composizione elencata nella Tabella S1.
2. Eseguire PCR utilizzando un termociclatore con le seguenti condizioni: pre-denaturazione a 94 °C per 5 minuti; 42 cicli di denaturazione a 94 °C per 30 secondi, ricottura per 1 minuto alla temperatura ottimizzata indicata nella Tabella 2, ed estensione a 72 °C per 2 minuti; e un'estensione finale a 72 °C per 10 minuti.

5. Rilevamento e analisi di prodotti PCR

1. Separare i frammenti di DNA amplificati tramite elettroforesi su gel a 100 V in agarosio (p/v) all'1,3% preparato in un tampone 1× TAE contenente 0,001 M EDTA e 0,04 M Tris-acetato a pH 8,0. Tingi i gel con bromuro di etidio a 0,5 μg·^μL-1.
   ATTENZIONE: Il bromuro di etidio è un potente mutageno. Indossa l'attrezzatura di protezione individuale adeguata quando maneggi soluzioni di bromuro di etidio o gel colorati.
2. Far funzionare il gel a una tensione costante di 100 V per 45–60 minuti, oppure finché il fronte del colorante blu bromofenolo non si è spostato di circa due terzi della lunghezza del gel. Dopo la tintura e la rimozione della colorazione, osserva il gel sotto transilluminazione UV.
   NOTA: Conferma che bande di DNA distinte siano chiaramente visibili sotto la transilluminazione UV. Assicurati che la scala del DNA mostri bande affilate e ben separate che vanno da 100 a 2.000 pb.
3. Registra le bande polimorfe (PB) delle varietà in base alla loro presenza o assenza sotto la luce ultravioletta.
4. Esegui ogni amplificazione PCR in triplicata per garantire la riproducibilità. Score solo bande che sono costantemente presenti o assenti in tutte e tre le repliche indipendenti per l'analisi a valle. Confermare che il tasso di concordanza di punteggio delle bande tra repliche superi il 95%.

6. Analisi dei dati

1. Valutare le bande per l'identificazione della cultivar in base alla loro presenza o assenza assegnando "+ o" alle bande chiaramente visibili e "−" alle bande assenti nella corrispondente posizione molecolare su tutte le cultivar. Includere solo le bande che sono costantemente osservate tra tre repliche indipendenti.
2. Classificare le cultivar con bande distinte nell'impronta digitale prodotte indipendentemente da un singolo primer. Categorizza le cultivar con identici schemi di bande nello stesso sottogruppo. Differenzia progressivamente e completamente tutte le varietà di tè oleoso in base a questi parametri.

7. Applicazione e efficienza del diagramma nell'identificazione delle cultivar

1. Selezionare casualmente due gruppi di cultivar di tè oleoso tra i gruppi intra- e intergruppi per verificare l'applicabilità e la funzionalità del diagramma che illustra 61 cultivar di tè oleoso. Effettua manualmente la selezione facendo riferimento ai diversi rami del diagramma Ot-CID, senza l'uso di alcun software.
   NOTA: 2 gruppi di cultivar Ot sono stati selezionati casualmente per verificare l'applicabilità e la funzionalità del diagramma che illustra 61 cultivar Ot.
2. Designa i due gruppi selezionati come "A" e "B". Seleziona i manuali rilevanti per ciascun gruppo dall'Ot-CID.

8. Guida sullo smaltimento dei rifiuti pericolosi

1. Prepara e maneggia tutte le soluzioni di bromuro di etidio in un'area designata. Raccogliere separatamente tutti i rifiuti solidi contaminati da bromuro di etidio e i rifiuti liquidi per lo smaltimento secondo le linee guida istituzionali sui rifiuti pericolosi.
2. Smaltire tutti i materiali contaminati dal bromuro di etidio in contenitori designati per rifiuti pericolosi. Contattare l'ufficio istituzionale per la salute ambientale e la sicurezza per procedure di smaltimento approvate in caso di incertezza.

Risultati

I Risultati Rappresentativi presentati qui illustrano l'intero flusso di lavoro della strategia RAPD-MCID, dallo screening iniziale dei primer passando dalla discriminazione gerarchica dei cultivar, fino alla validazione finale. Il processo di discriminazione a passo a passo è documentato nelle Figure 2, Figure 3, 4,

Discussione

I marcatori del DNA sono strumenti potenti utilizzati per identificare cultivar di piante e specie²⁴. Questi marcatori sono stati sviluppati e impiegati in migliaia di studi sull'analisi genetica, l'identificazione delle cultivar, ecc.; tuttavia, non sono né facili né ampiamente utilizzati nella genotipizzazione^24,31. Questo è dovuto alla mancanza di metodi efficienti e semplici che utilizzino mar...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Centrifuge	Eppendorf,Germania	5427R	Usato per l'estrazione di DNA genomico dalle foglie di tè olio
Hi-DNAsecure Plant Kit	Tiangen, Cina	DP350	Usato per l'estrazione di DNA genomico dalle foglie di tè olio
Strumento di amplificazione genica PCR	Monad, Cina	MP60901	Usato per l'amplificazione PCR
SolarRed Agarose LE	Solarbio, Cina	A8202	Usato per l'elettroforesi dei frammenti PCR
TAE	Tsingke, Cina	TSG001	Usato per l'elettroforesi dei frammenti PCR
TaKaRa Ex Taq	Takara, Giappone	RR001A	Usato per l'amplificazione PCR
Spettrofotometro Thermo Scientific NanoDrop 2000C	ABI,USA		Usato per determinare la concentrazione di RNA