Isolamento e validazione delle sottopopolazioni di cellule staminali mesenchimali positive a Podoplanina utilizzando una strategia di perle magnetiche indirette

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo di selezione basato su perle magnetiche che utilizza anticorpi di citometria di flusso marcati con ficoeritrina (PE) e microsfere anti-PE per isolare specifiche sottopopolazioni di cellule staminali mesenchimali con alta positività dei marker target postsort e attività proliferativa/metabolica basata su CCK-8 nelle condizioni testate, senza richiedere costosi selezionatori cellulari o perle personalizzate specifiche per target.

Abstract

Lo studio dell'eterogeneità funzionale nelle cellule staminali mesenchimali si basa sull'isolamento efficiente di specifiche sottopopolazioni (ad esempio, cellule positive alla podoplanina (PDPN)). Tuttavia, per la maggior parte dei target proteici di membrana, le perle magnetiche commerciali direttamente disponibili per la selezione sono limitate. Per affrontare questo problema, il nostro laboratorio ha stabilito e testato un protocollo standardizzato di selezione delle perle magnetiche basato sul principio di accoppiamento indiretto degli "anticorpi di citometria a flusso marcati con ficoeritrina (PE)/perle magnetiche anti-PE". Utilizzando cellule PDPN-positive come popolazione target modello, questo protocollo arricchisce una frazione cellulare target senza dipendere da costosi selezionatori di celle a flusso citometrico.

I ricercatori possono utilizzare anticorpi di citometria a flusso marcati con PE compatibili che mirano a proteine cellulari accessibili e combinarli con microperle anti-PE commercialmente disponibili per stabilire un flusso di lavoro di selezione per target selezionati dopo l'ottimizzazione specifica del bersaglio. Questo approccio evita i lunghi tempi di consegna e gli elevati costi legati alla personalizzazione o all'ordinazione di perle magnetiche specifiche per ogni nuovo bersaglio, rendendolo particolarmente adatto per marcatori superficiali accessibili che sono rari o poco studiati. Nel modello PDPN testato qui, il protocollo ha permesso l'arricchimento della sottopopolazione target con alta positività PDPN post-soggetto e la proliferazione/attività metabolica basata su CCK-8 rispetto agli MSC non ordinati.

Introduzione

Nel campo dell'ortopedia, lesioni come danni alla cartilagine e lesioni nella zona avascolare (zona bianca) del menisco spesso causano danni irreversibili delle articolazioni e perdita di funzione, portando infine all'osteoartrite. Ciò è in gran parte attribuibile alla scarsa capacità rigenerativa di questi tessuti, che deriva dalla mancanza di sangue diretto e di apporto linfatico, nonché dalla presenza di cellule altamente differenziate con capacità limitate di proliferazione e ^migrazione 1,2,3,4. Per affrontare questa sfida, sono state esplorate varie strategie cliniche, tra cui l'uso degli esosomi ^5,6, il trapianto autologo o allogenico di condrociti ^7,8 e gli approcci di ingegneria ^tissutale 9,10,11,12. Negli ultimi anni, le cellule staminali mesenchimali (MSC) sono emerse come una promettente fonte cellulare per la riparazione rigenerativa, grazie al loro potenziale di differenziazione multilineage e alle proprietà immunomodulatrici, offrendo nuove speranze per la rigenerazione^{della cartilagine} 13,14,15,16.

Nonostante il loro potenziale terapeutico, le MSC mostrano un'eterogeneità significativa. Anche all'interno di una singola fonte tissutale, come il midollo osseo o il cordone ombelicale, sottopopolazioni distinte di MSC possono mostrare notevole variabilità nella capacità di proliferazione, nel potenziale di differenziazione multilineage (in particolare nella differenziazione condrogenica) e nella funzione rigenerativa in^vivo 17,18,19. Pertanto, l'identificazione precisa e l'isolamento delle sottopopolazioni MSC funzionalmente definite—come quelle con capacità condrogenica potenziata—è essenziale per far progredire la comprensione delle loro proprietà biologiche e migliorare l'efficacia della riparazione della cartilagine. Questo rappresenta un passo cruciale nella nostra ricerca.

Con il progredire della ricerca, un numero crescente di nuove proteine di membrana è stato identificato come marcatori di sottopopolazioni MSC funzionalmente distinte. Tuttavia, tradurre queste scoperte in strategie efficaci di ordinamento delle celle rimane tecnicamente impegnativo. La selezione convenzionale delle cellule attivate dalla fluorescenza (FACS), pur essendo potente, richiede strumentazione specializzata e competenze tecniche, limitandone l'accessibilità in molti laboratori. D'altra parte, la selezione delle cellule immunomagnetiche—sebbene più diffusa—è limitata dalla limitata disponibilità di reagenti commerciali, progettati principalmente per pochi bersagli a membrana ben affermati. Di conseguenza, per molti marcatori appena scoperti con potenziale rilevanza biologica, non esistono perle magnetiche commercialmente disponibili, rendendo difficile arricchire specificamente queste preziose sottopopolazioni MSC.

Per superare questa limitazione, il presente studio mira a stabilire e standardizzare un protocollo flessibile, conveniente ed efficiente per la selezione positiva delle cellule. Questo approccio si basa sulla coniugazione indiretta di anticorpi coniugati con ficoeritrina (PE) disponibili commercialmente con sfere immunomagnetiche anti-PE. Rapporti precedenti hanno dimostrato che le MSC positive al podoplanin-positive (^PDPN+) possiedono una capacità superiore di mantenimento e differenziazione della stemness rispetto alle loro controparti^PDPN-20. Inoltre, il coinvolgimento delle MSC ^PDPN+ nella rigenerazione della cartilagine e nella progressione dell'osteoartrite (OA) è stato documentato in^{letteratura 21,22}. Utilizzando la podoplanina (PDPN)—un marcatore candidato recentemente identificato per le sottopopolazioni funzionali di MSC—come bersaglio modello, abbiamo selezionato cellule positive a PDPN da MSC derivate dal midollo osseo. Forniamo un protocollo dettagliato passo dopo passo che copre la preparazione della sospensione a singola cellula, la marcatura di anticorpi e perle magnetiche, e la separazione magnetica. Inoltre, valutiamo la ressa, la positività PDPN post-smistamento e la proliferazione/attività metabolica basata su CCK-8 delle cellule selezionate. Standardizzando questo protocollo, miriamo a fornire ai ricercatori un metodo versatile e accessibile per isolare le sottopopolazioni cellulari target utilizzando anticorpi compatibili contro marcatori accessibili della superficie cellulare, facilitando così la ricerca fondamentale sulle cellule staminali e le future applicazioni traslazionali nella medicina rigenerativa.

Protocollo

Le MSC derivate dal midollo osseo umano sono state acquisite commercialmente (vedi la Tabella dei Materiali). Il fornitore ha confermato l'identità MSC tramite l'espressione positiva di CD73, CD90 e CD105; espressione negativa di CD34, CD45 e HLA-DR; e il potenziale di differenziazione trilineage. Le cellule sono state espanse in coltura e utilizzate nei passaggi 3–5. Tutto il lavoro cellulare di origine umana è stato effettuato in un armadietto di sicurezza biologica di Classe II in condizioni sterili. Poiché le cellule venivano acquisite commercialmente e nessun soggetto umano veniva reclutato o campionato direttamente in questo protocollo, non era richiesta alcuna approvazione diretta dell'IRB.

1. Preparazione della sospensione a singola cella

NOTA: La qualità della sospensione a cella singola influisce direttamente sull'efficienza di smistamento. Assicurati che le cellule siano ben disperse, altamente vitali e prive di grumi. I grumi visibili dovrebbero essere dispersi tramite pipetting delicato ripetuto finché i grumi non sono più visibili.

1. Seleziona MSC (passaggi 3–5) che hanno raggiunto l'80–90% di confluenza. Scartate il mezzo culturale.
2. Lava le cellule con 2 × 10 mL di PBS preriscaldato. Dondola delicatamente il recipiente e scarta il PBS.
3. Aggiungi 2 mL di tripsina-EDTA allo 0,25% e incuba a 37 °C per 3–5 minuti. Osserva le cellule al microscopio finché non si arrotondano e iniziano a staccarsi.
4. Aggiungere 4 mL di mezzo di coltura contenente il 16,5% di FBS (vedi la Tabella dei Materiali) per neutralizzare la tripsina. Pipetta delicatamente le cellule per assicurarne il distacco completo. Trasferire la sospensione della cella su un tubo centrifuga da 15 mL.
   NOTA: Controlla al microscopio per confermare che tutte le cellule siano state raccolte.
5. Centrifuga a 300 × g per 3 minuti e scarta il soprantantante.
6. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di tampone (vedi la Tabella dei Materiali). Procedi al conteggio delle cellule.

2. Conteggio cellulare e aggiustamento della concentrazione

NOTA: Se il numero totale delle cellule è inferiore a 1 × 10⁷, aggiungere comunque gli anticorpi e i reagenti magnetici basati sul volume standard per 1 × 10⁷ cellule per garantire l'efficienza dell'etichettatura.

1. Centrifuga di nuovo la sospensione della cella a 300 × g per 3 minuti e scarta il soprantantante.
2. Risospendere le cellule nel tampone per ottenere una densità di 1 × 10⁸ celle/mL.
   NOTA: Ad esempio, per processare 1 × 10⁷ celle, risospendere il pellet in 100 μL di tampon.
3. Trasferire la sospensione a celle su un tubo a fondo arrotondato in polistirene da 5 mL.

3. Marcatura degli anticorpi

1. Aggiungere 10 μL di Fc gamma RII Blocker (vedi la Tabella dei Materiali) ogni 1 × 10⁷ celle. Mescola delicatamente e incuba a temperatura ambiente per 10 minuti.
2. Aggiungere 5 μL di anticorpo anti-PDPN umano coniugato con PE (vedi la Tabella dei Materiali) ogni 1 × 10⁷ cellule, seguendo la concentrazione raccomandata dal produttore. Mescola delicatamente e incuba a temperatura ambiente per 15–20 minuti, protetto dalla luce.
   NOTA: Il volume dell'anticorpo deve essere regolato in base al scheda tecnica dell'anticorpo specifico per citometria a flusso utilizzato, poiché le concentrazioni possono variare tra i prodotti.

4. Etichettatura magnetica delle perline

NOTA: Tieni tutti i reagenti sul ghiaccio prima dell'uso e riportali subito dopo ogni aggiunta per mantenere attività e coerenza.

1. Aggiungere 10 μL di Selection Cocktail ogni 1 × 10⁷ celle (vedi la Tabella dei Materiali). Mescola delicatamente e incuba a temperatura ambiente per 15 minuti.
2. Aggiungere 5 μL di sfere magnetiche ogni 1 × 10⁷ celle (vedi la Tabella dei Materiali). Mescola delicatamente e incuba a temperatura ambiente per 10 minuti.
   NOTA: Vortice le sfere magnetiche si manifestano vigorosamente per 30 secondi prima dell'uso per garantire una dispersione uniforme.

5. Separazione magnetica

1. Posizionare un tubo a fondo rotondo in polistirene da 5 mL contenente il campione della cella etichettata nel supporto di separazione magnetica (vedi la Tabella dei Materiali).
2. Aggiungi un buffer al tubo per portare il volume totale a 2,5–3 mL. Incuba per 5 minuti a temperatura ambiente.
3. Esegui la separazione: tenendo insieme il magnete e il tubo come un'unica unità, invertili per versare il soprantantante in un nuovo tubo di raccolta. Questa frazione raccolta contiene le celle PDPN-negative; Tieni questo tubo sul ghiaccio.
   NOTA: Non rimuovere il tubo dal supporto magnetico durante questo passaggio, poiché ciò interromperebbe la separazione e causerebbe il fallimento della procedura.
4. Ripeti i passaggi 5.1–5.3 3 volte. Ogni volta, aggiungi il buffer al tubo originale nel magnete, attendi 5 minuti e versa il sovrantantante nello stesso tubo di raccolta delle frazioni negative usato nel passo 5.4.
5. Dopo il lavaggio finale, rimuovere dal supporto il tubo contenente le celle legate magneticamente. Questo tubo contiene la frazione cellulare positiva a PDPN.
6. Aggiungi 3 mL di buffer per risospendere le cellule positive. Trasferisci questa sospensione in un tubo nuovo etichettato (il tubo a frazione positiva).

6. Raccolta, coltura e validazione delle cellule target

1. Contare le cellule sia dal tubo a frazione positiva che da quella negativa. Registra la resa delle celle per ogni frazione.
2. Centrifuga la sospensione a celle a frazione positiva a 300 × g per 3 minuti. Scartate il soprannatante.
3. Risospendere il pellet cellulare in un mezzo di coltura Alpha MEM contenente il 16,5% di FBS. Regola la densità cellulare secondo necessità e semina le cellule in piastre di coltura o fiasche.
4. Incubare le cellule a 37 °C in un incubatore al 5% di CO₂.

7. Preparazione del campione per la purezza e la validazione funzionale

1. Contare le cellule e seminarle su una ciotola di coltura da 100 mm a una densità di 3 × 10⁶ cellule per piatto in 12 mL di mezzo di coltura. Ventiquattro ore dopo la semina, osserva l'attacco delle cellule. Sostituire il mezzo di coltura con un substrato fresco per rimuovere eventuali sfere magnetiche residue e celle non aderenti.
2. Prelevare le cellule tramite tripsinizzazione. Pipetta delicatamente su e giù 10–15 volte per spostare e rimuovere sfere magnetiche e anticorpi residui.
3. Valutare la percentuale di cellule positive a PDPN-PE tramite citometria di flusso (vedi File Supplementare 1 per il protocollo dettagliato).
4. Raccogliere cellule durante la fase di crescita logaritmica. Seminali in una piastra da 96 pozzi. In diversi momenti temporali (0 h, 24 h, 48 h, 72 h), si aggiunge il reagente CCK-8 (vedi la Tabella dei Materiali) e si misura l'assorbanza secondo le istruzioni del produttore. Traccia una curva di proliferazione basandosi sui dati.

Risultati

Il principio generale e il flusso di lavoro dell'esperimento sono illustrati nella Figura 1. Tutti i dati sperimentali successivi si basano su celle del passaggio 5. Dopo la separazione magnetica, le cellule ^PDPN+ ottenute sono state coltivate per 24–48 ore. Dopo aver sostituito il mezzo di coltura per rimuovere le celle non aderenti e le potenziali perle magnetiche residue (Figura 2A), abbiamo valutato l'efficienza d...

Discussione

In questo studio, abbiamo stabilito un protocollo basato su perle magnetiche per isolare le cellule PDPN+ da MSC derivate dal midollo osseo. Questo approccio consente un arricchimento efficiente della sottopopolazione PDPN-positiva mantenendo al contempo l'attività proliferativa/metabolica basata su CCK-8 nelle condizioni testate.

Rispetto ai metodi convenzionali di selezione immunomagnetica diretta, il vantaggio più significativo di questa strategia risiede n...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
7-AAD Cell Viability Assay Kit	KeyGEN	KGD1202-50
Anti-human CD32 Blocker (Fc gamma RII Blocker)	STEMCELL Technologies	18520
Buffer	STEMCELL Technologies	20104	Buffer
CCK-8	Meilunbio	MA0218-5
Dextran Magnetic Particles	STEMCELL Technologies	50100	Magnetic Particles
Fetal Bovine Serum	Gibco	16050-122
Magnet	STEMCELL Technologies	18000	magnetic separation stand
MEM Alpha Medium	Gibco	C12571500BT	MEM Alpha Medium (82,5%) + FBS (16,5%) + Penicillin-Streptomicina (1,0%)
MSCs	KeyGEN	KGG5575-1	Cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo umano
PE-conjugated Anti-Human PDPN Antibody	ABclonal	A26770	PDPN-PE
PE Selection Cocktail	STEMCELL Technologies	18151	Selection Cocktail
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Trypsin-EDTA	Gibco	25200-072