Quantificazione della citotossicità delle cellule NK potenziata dai recettori antigenici chimerici e dagli anticorpi terapeutici tramite imaging a cellule vive e citometria a flusso

Sommario

Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro in vitro standardizzato per la misurazione coerente della citotossicità naturale, mediata dai recettori degli antigeni chimerici e dipendente dagli anticorpi delle cellule naturali umane, utilizzando imaging a cellule vive e citometria di flusso.

Abstract

Le cellule natural killer (NK) sono linfociti innati che svolgono un ruolo fondamentale nell'immunità protettiva contro diversi patogeni e tumori intracellulari. La loro funzione principale è eliminare le cellule target infette, trasformate malignamente o rivestite da anticorpi tramite citotossicità cellulare dipendente da anticorpi (ADCC). Le cellule NK possono anche essere geneticamente modificate per esprimere recettori antigenici chimerici (CAR) che consentono il riconoscimento mirato di antigeni specifici. La misurazione quantitativa della citotossicità delle cellule NK è essenziale per valutare la funzionalità di base e per la valutazione preclinica degli anticorpi monoclonali e delle strategie di ingegneria CAR. Tuttavia, i test funzionali in vitro rimangono molto variabili tra i laboratori a causa delle differenze nella preparazione cellulare, nelle cellule bersaglio, nei rapporti effettore-bersaglio, nei tempi di co-incubazione e nei metodi di lettura, limitando la riproducibilità e i confronti incrociati. Questo articolo presenta un protocollo standardizzato per la valutazione quantitativa della citotossicità delle cellule NK utilizzando la citometria a flusso e imaging in tempo reale con cellule vive. Le cellule NK primarie umane e le cellule NK-92 che esprimono CAR sono state valutate per la loro capacità di uccidere le cellule tumorali e le cellule target rivestite di anticorpi in un formato a 96 pozzetti a placche per misurare la citotossicità naturale, la morte mediata da CAR e l'ADCC. La sopravvivenza delle cellule target è stata misurata in modo continuo utilizzando immagini a cellule vive o in un momento temporale definito tramite citometria a flusso, che ha anche permesso la caratterizzazione fenotipica delle cellule NK e delle cellule bersaglio. Questi protocolli forniscono un quadro solido utilizzando colture tissutali di routine, imaging e metodi di citometria a flusso per consentire la quantificazione riproducibile delle funzioni degli effettori delle cellule NK per studi sull'immunità innata e sulle immunoterapie basate sulle cellule NK.

Introduzione

Le cellule natural killer (NK) sono linfociti innati che svolgono un ruolo centrale nella sorveglianza immunitaria contro cellule infette da virus e maligne, mostrando citotossicità rapida^{e potente 1}. A differenza delle cellule B e T, le cellule NK non esprimono recettori specifici per l'antigene e invece si affidano a una serie di recettori attivanti e inibitori per rilevare la perdita di espressione di un complesso di istocompatibilità maggiore di classe I o lo stress cellulare. Questo permette loro di mediare la citotossicità diretta rilasciando granuli citotossici contenenti perforina e granzimi o, in alcuni casi, attivando i recettori della morte 1,2,3,4. Oltre alla citotossicità naturale, le cellule NK esprimono FcγRIII (CD16), un recettore che riconosce la porzione Fc dell'immunoglobulina G (IgG) e media la citotossicità cellulare dipendente da anticorpi (ADCC) contro le cellule target rivestite di^{IgG 5,6}.

Grazie ai loro meccanismi citotossici intrinseci e al profilo di sicurezza favorevole, le cellule NK sono emerse come candidate promettenti per l'immunoterapia cellulare. Con il potenziale per l'uso allogenico, le cellule NK possono funzionare come una terapia "pronta all'uso" con un rischio minimo di malattia innesto contro ospite, consentendo un'applicabilità clinica più ampia e costi^{ridotti 7}. I recenti progressi hanno ulteriormente ampliato il potenziale terapeutico delle cellule NK attraverso strategie di ingegneria genetica, inclusa l'introduzione di recettori antigenici chimerici (CAR) che reindirizzano le cellule NK a riconoscere specifici antigeni tumorali. Le cellule CAR-NK hanno dimostrato efficacia antitumorale in modelli xenoinnesti in vivo e in studi clinici, con tossicità ridotta rispetto alle cellule^{CAR-T 8,9,10}. Pertanto, cresce l'interesse nello sviluppo di piattaforme ingegnerizzate per cellule NK e strategie terapeutiche basate su anticorpi. In questo contesto, una misurazione accurata e quantitativa della capacità di uccidere le cellule NK è essenziale per comprendere la biologia delle cellule NK, valutare l'efficacia delle terapie CAR o di altre terapie ingegnerizzate per cellule NK e valutare anticorpi monoclonali che dipendono dall'ADCC.

Una varietà di saghi in vitro è stata ampiamente utilizzata in laboratori per valutare la citotossicità delle cellule NK. I metodi comuni includono i saghi di rilascio radioattivo del cromo-51, i saghi di rilascio di lattato deidrogenasi e i sagni di rilascio di calcina–acetossimetil^11,12. Sebbene questi metodi tradizionali siano stati ampiamente utilizzati per misurare la citotossicità, si basano su letture indirette della morte cellulare, forniscono misurazioni di endpoint piuttosto che dati cinetici e offrono sensibilità e gamma dinamica limitate. Inoltre, non forniscono informazioni sul fenotipo o sullo stato di attivazione delle cellule effettrici. Più recentemente, le piattaforme di imaging a cellule vive e la citometria a flusso sono state adottate sempre più perché permettono la quantificazione diretta della sopravvivenza delle cellule bersaglio, il monitoraggio delle uccisioni nel tempo e l'analisi fenotipica simultanea delle cellule effettrici e^{bersaglio 13,14}. Tuttavia, anche tra questi approcci più recenti, esiste una variabilità sostanziale tra laboratori e studi pubblicati, incluse differenze nella preparazione cellula bersaglio, nei rapporti effettore-bersaglio (E:T) e nei tempi di co-incubazione, limitando la riproducibilità e confronti tra studi, in particolare nelle valutazioni precliniche delle immunoterapie basate su cellule NK.

Questo articolo presenta un flusso di lavoro standardizzato per la valutazione quantitativa della citotossicità delle cellule NK utilizzando due piattaforme indipendenti e complementari: imaging in tempo reale, a cellule vive (IncuCyte SX5) e test endpoint basati su citometria di flusso. L'imaging a cellule vive consente un monitoraggio continuo della sopravvivenza delle cellule bersaglio durante la co-coltura con le cellule effettrici, consentendo la valutazione cinetica della citotossicità su molteplici rapporti E:T e condizioni sperimentali con una manipolazione minima del saggio¹⁵. Al contrario, la citometria a flusso fornisce una misurazione estrema altamente sensibile della morte della cellula bersaglio, insieme a una caratterizzazione fenotipica simultanea delle cellule NK e delle cellule target tramite un pannello di colorazione multimarcatore.

Inoltre, questo protocollo incorpora parametri sperimentali standardizzati, tra cui rapporti E:T, condizioni di incubazione, formato della lastra e flussi di lavoro analitici, per migliorare la riproducibilità e facilitare il confronto delle misurazioni di citotossicità tra laboratori e studi. Il flusso di lavoro consente la valutazione quantitativa di molteplici funzioni degli effettori NK, inclusa citotossicità naturale, uccisione mediata da CAR e ADCC, ed è compatibile con cellule NK umane primarie e linee cellulari NK. Questo protocollo fornisce un quadro pratico per studi sulla biologia delle cellule NK e la valutazione preclinica dello sviluppo di immunoterapia basata sulle cellule NK.

Protocollo

L'uso dei campioni di donatori umani per la ricerca è stato approvato dall'Institutional Review Board e condotto in conformità con le linee guida istituzionali (Approval #2022P000699).

1. Saggio di uccisione a immagini in tempo reale con cellule vive

1. Placche per cappotto
   1. Aggiungere 50 μL/poli-D-lisina (0,1 mg/mL in soluzione salina tamponata con fosfato [PBS]) a una griglia 6 × 10 in una piastra a fondo piatto da 96 pozzi. Scuoti delicatamente la piastra per assicurarti che il fondo di ogni pozzo sia completamente coperto.
   2. Incubare il piatto per 2 ore a temperatura ambiente (RT; 18°C–26°C) con il coperchio aperto.
   3. Lavare i pozzi 3× con PBS da 200 μL/pozzo e scartare il sovrandante.
      NOTA: Le lastre rivestite possono essere sigillate con parafilm e conservate a 4°C per un massimo di 1 settimana con 200 μL di PBS aggiunti a ciascun pozzo. Assicurati che le piastre rimangano sterili, scartate i PBS e lasciate che si equilibrino con RT prima dell'uso.
2. Preparare le celle target
   1. Preparare 10 mL di 2× SYTOX Orange (200 nM) diluendo la soluzione di stock di SYTOX Orange (250 μM in DMSO) in un mezzo di coltura NK-92 (aggiungere 8 μL di stock a 10 mL di volume totale) in un tubo centrifuga a fondo conico da 15 mL.
      NOTA: I mezzi di coltura per cellule NK-92 sono costituiti da medium RPMI-1640 avanzato, siero bovino fetale al 10% (FBS), 2 mM di L-alanil-L-glutamina, 100 μg/mL di primocina e 500 U/mL di IL-2 umana.
      ATTENZIONE: SYTOX Orange è un colorante fluorescente e può comportare rischi per l'esposizione alla pelle o agli occhi. Gestire con l'attrezzatura di protezione individuale appropriata e in conformità con le linee guida di sicurezza istituzionali.
   2. Contare le celle target utilizzando un metodo di conteggio basato sull'esclusione dei coloranti (ad esempio, trippan blue) o un metodo equivalente validato (ad esempio, contatore automatico di cellule).
      NOTA: In questo saggio, le cellule bersaglio erano cellule di Ramos, una linea cellulare di linfoma B-cellulare di maturazione di antigeni (BCMA⁺), che abbiamo ingegnerizzato per esprimere la proteina fluorescente nel vicino infrarosso (NIR) emiRFP670.
   3. Trasferire la quantità richiesta in un tubo centrifuga a fondo conico da 15 mL.
   4. Centrifuga (5 min, 300 × g, RT, accelerazione = massimo; decelerazione [frenata] = massimo).
   5. Scartate il soprannatante.
   6. Risospendere le cellule target a una concentrazione finale di 2,5 × 10⁵ cellule/mL (2,5 × 10⁴ cellule/100 μL) in 2× substrati SYTOX Orange.
      NOTA: Le celle target risospese possono essere mantenute a 37°C con il 5% di CO₂ nel tubo fino a 30 minuti durante la preparazione delle diluizioni delle cellule effettrici.
      NOTA: Per una piastra piena, 60 pozzi × 2,5 × 10⁴ celle/pozzo = 1,5 ×^{10 6} celle target totali. Prepara 2.0 × 10⁶ celle per compensare la perdita. Regola il numero di cellule in base alla dimensione del saggio e alla densità di semina desiderata.
3. Preparare le celle effettrici
   1. Valutare la concentrazione e la vitalità delle cellule NK-92 utilizzando un metodo di conteggio cellulare basato sull'esclusione dei coloranti (ad esempio, blu di tripano) o un metodo validato equivalente. Procedere solo se la fattibilità è ≥80%, poiché una minore vitalità potrebbe influire sulle prestazioni del saggio.
      NOTA: Cellule NK-92 ingegnerizzate per esprimere stabilmente la proteina fluorescente ZsGreen, sia da sole (controllo) sia con costrutti CAR mirati a BCMA, sono state utilizzate come cellule effettrici.
   2. Contare e trasferire il numero richiesto di celle in singoli tubi centrifuga a fondo conico da 15 mL.
      NOTA: Calcola il numero totale di celle effettori necessarie sommando il numero di celle necessarie in tutti i rapporti E:T per una replica, moltiplicando per il numero di replicate e aggiungendo il 50% di eccesso per compensare la perdita cellulare. Tonda i numeri quando necessario per facilitare la preparazione. Ad esempio, per rapporti E:T che vanno da 2:1 a 0,25:1, si usano 1,5 × 10 celle^{da 5} NK per replica. Per i triplicati, preparare 4,5 × 10⁵ celle per condizione basandosi sulla disposizione delle lastre descritta nella Figura Supplementare 1A.
   3. Celle centrifughe (5 min, 300 × g, RT, accelerazione = massimo; decelerazione [freno] = massimo).
   4. Scartate il soprannatante.
   5. Sospendere le cellule a una concentrazione finale di 5,0 × 10⁵ cellule/mL (5,0 × 10⁴ cellule/100 μL).
4. Preparare le diluizioni delle celle degli effettori
   1. Preparare diluizioni delle celle effettori, incluso un controllo solo bersaglio, in una piastra a fondo rotondo a 96 pozzi (vedi Figura Supplementare 1A per una disposizione rappresentativa delle piastre con quattro condizioni in triplice). Ogni condizione viene preparata in triplice.
   2. Aggiungere 240 μL/pozzo di celle effettori (5,0 × 10⁵ celle/mL) ai pozzi corrispondenti a un rapporto E:T di 2:1.
   3. Aggiungi 120 μL/pozzo di substrato a tutti i pozzi rimanenti.
   4. Eseguire diluizioni seriali a 2 file da pozzi E:T = 2:1 fino a pozzi E:T = 0,25:1. Mescola accuratamente pipettando ≥5 volte e cambia le punte tra un transfer e l'altro.
      NOTA: Se le esecuzioni di imaging non sono state programmate sul sistema di imaging, programmale prima di impostare la co-coltura. Le diluizioni preparate delle celle effettori possono essere mantenute a 37°C con il 5% di CO₂ in una piastra a fondo arrotondato da 96 pozzi per fino a 30 minuti durante l'installazione del sistema di imaging a cellule vive.
5. Creare una co-cultura
   1. Ottenere la piastra a fondo piatto rivestita in poli-D-lisina, a 96 pozzi.
   2. Aggiungi 100 μL/pozzo di sospensione a celle target a tutti i pozzi. Sospendere accuratamente le celle bersaglio immediatamente prima della dispensazione, pipettando su e giù ≥5 volte usando una pipetta appropriata (ad esempio, 200 μL) ed evitare la formazione di bolle durante il trasferimento.
   3. Aggiungere 100 μL/pozzo di sospensione a celle effettori ai pozzi corrispondenti. Sospendere accuratamente le celle effettrici immediatamente prima della dispensazione, pipettando su e giù ≥5 volte usando una pipetta appropriata (ad esempio, 200 μL) ed evitare la formazione di bolle durante il trasferimento.
   4. Aggiungere 200 μL/pozzo PBS ai pozzi circostanti inutilizzati.
   5. Centrifugare la piastra (2 min, 100 × g, RT, accelerazione = basso [ad esempio, 2]; decelerazione [frenata] = basso [ad esempio, 2]).
      NOTA: Questa rotazione morbida è fondamentale per depositare rapidamente e uniformemente le cellule sul fondo del pozzo per immagini accurate sull'IncuCyte SX5. Usiamo una centrifuga Eppendorf 5810R da banco compatibile con un rotore oscillante con le impostazioni di accelerazione e decelerazione impostate a 2 (su 9).
   6. Inserire la piastra nel sistema di imaging a cellule vive e acquisire immagini ogni 1 ora per 24 ore (estendibile fino a 72 ore se necessario). Assicurarsi che l'imaging venga eseguito in condizioni standard di incubazione (37°C/5% CO₂).
      NOTA: Per garantire che l'imaging a t = 0 h rifletta accuratamente il conteggio basale delle cellule bersaglio, iniziare l'acquisizione dell'immagine entro 10–15 minuti dopo la preparazione della co-coltura e la centrifugazione. Per una piastra intera con tre canali di imaging (cioè verde, arancione e NIR), il tempo di scansione è di circa 10 minuti all'ora per 3 immagini/pozzo a ingrandimento del 20×.
   7. Verifica la qualità dell'immagine dopo la prima scansione e regola le impostazioni se necessario.
6. Impostazioni degli strumenti
   1. Imposta lo smagnetizzazione spettrale per correggere il fuoriuscita di fluorescenza di SYTOX Orange nel canale verde. Regolare il valore di unmixing nel software confrontando i canali verde e arancione e confermare che le cellule morte Orange⁺ non vengano erroneamente rilevate come Green⁺. Per l'esperimento rappresentativo (Figura 1), il contributo del canale arancione al canale verde è stato impostato all'8,5%. Questi valori sono specifici per dataset e dovrebbero essere ottimizzati per ogni esperimento.
   2. Configurare l'analisi non aderente cellula per cella per garantire una segmentazione e un mascheramento accurati di tutte le celle all'interno di ciascun campo visivo (vedi la Figura Supplementare 1B per una configurazione rappresentativa). I seguenti parametri sono raccomandati per il sistema di imaging a cellule vive utilizzando modelli a effettori di sospensione e linea cellulare bersaglio:
      1. Imposta il diametro atteso dell'oggetto a 15 μm (diametro approssimativo della cella).
      2. Imposta la sensibilità di soglia e la sensibilità delle texture a 5.
      3. Imposta la sensibilità dei bordi a 10 per facilitare la separazione dei cluster cellulari.
      4. Imposta l'intervallo accettato di area di filtro a 50–2000^μm2 per escludere detriti e oggetti di grandi dimensioni.
      5. Imposta il massimo eccentrico a 0,95 per escludere oggetti non cellulari.
   3. Configurare le soglie di classificazione (vedi la Figura Supplementare 1C per il gating rappresentativo). Utilizzare pozzi di controllo solo bersaglio per definire la popolazione di base NIR⁺/Orange⁻ viva di cellule bersaglio. Successivamente si utilizzano pozzi di co-coltura in momenti successivi (ad esempio, t = 4 h) per confermare la separazione chiara con una sovrapposizione minima tra le popolazioni ^NIR+/− e Orange⁺/⁻. Esempi di soglie di classificazione e parametri di analisi sono mostrati nella Figura Supplementare 1C.
      1. Imposta la soglia di intensità arancione a circa 15.
      2. Imposta la soglia di intensità NIR a circa 0,1.
         NOTA: I parametri e i valori di soglia possono variare a seconda dello strumento, del software, del modello della linea cellulare e dell'intensità del segnale di fluorescenza.
         NOTA: Questo protocollo può essere adattato per saggi primari di citotossicità umana delle cellule NK o ADCC se le cellule bersaglio esprimono stabilmente la fluorescenza NIR (ad esempio, emiRFP670). Può anche essere adattato per saggi di uccisione basati su citometria a flusso omettendo il rivestimento in poli-D-lisina e utilizzando piastre a fondo piatto o arrotondato a 96 pozzi.

Figura 1. Quantificazione della cinetica e della potenza della citotossicità cellulare mediata da NK-92 tramite immagini in tempo reale con cellule vive. (A) Panoramica schematica del saggio di imaging a cellule vive IncuCyte per il monitoraggio della citotossicità mediata dalle cellule NK. Le cellule bersaglio ^di BCMA+ Ramos che esprimono emiRFP670 (canale nel prossimo infrarosso [NIR]) vengono co-colte con cellule effettrici NK-92 che esprimono ZsGreen (canale verde), e la morte cellulare viene rilevata tramite SYTOX Orange (canale arancione). (B) Immagine rappresentativa a fluorescenza di un pozzo di co-coltura con un rapporto effettore-bersaglio (E:T) di 1:1 a 12 ore. Le cellule bersaglio vive (emiRFP670⁺) sono mostrate in blu, le cellule effettrici NK-92 (ZsGreen⁺) in verde e le cellule morte (SYTOX Orange⁺) in rosso. Le immagini sono state acquisite utilizzando il modulo di analisi Cell-by-Cell non aderente con un ingrandimento del 20×. Barra della scala = 100 μm. (C) Quantificazione della crescita e della sopravvivenza delle cellule bersaglio nel tempo a rapporti E:T variabili per le cellule NK-92 di controllo ed esprimenti CAR. (D) Quantificazione della sopravvivenza della cella bersaglio in funzione del rapporto E:T in più momenti temporali (4, 8, 16 e 24 ore). Il conteggio delle celle target veniva normalizzato a pozzi solo target (E:T = 0:1) in ogni momento temporale. (E) Rappresentazione schematica delle metriche quantitative utilizzate per valutare la citotossicità: KR₅₀, rapporto killer-target necessario per raggiungere il 50% di uccisione in 12 ore; KT₅₀, tempo necessario per raggiungere il 50% di uccisioni con un rapporto E:T di 1:1; e IKI₅₀, indice killer integrato definito come l'area della heatmap al di sotto dell'isoclina di sopravvivenza al 50%. (F) Mappe di calore che mostrano la crescita e la sopravvivenza della cellula target in funzione del rapporto E:T e del tempo per ciascuna condizione dell'effettore. Valori quantitativi per KR₅₀, KT₅₀ e IKI₅₀ sono indicati per ogni condizione. I conteggi grezzi delle cellule target vive sono stati ottenuti ^{dalla popolazione NIR+}/SYTOX Orange– con accesso tramite l'analisi di classificazione Cell-by-Cell nel software IncuCyte 2021C. Tutte le condizioni sono state eseguite in triplicata (n = 3). I dati sono presentati come media ± deviazione standard. L'analisi di regressione non lineare è stata utilizzata per modellare le tendenze di citotossicità nei pannelli D e F. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Quantificazione della citotossicità cellulare dipendente da anticorpi tramite citometria a flusso

1. Preparare le cellule NK primarie umane
   NOTA: Le cellule NK primarie umane sono state isolate dal sangue periferico arricchito da leucociti ottenuto da donatori adulti sani utilizzando un metodo di arricchimento delle cellule NK seguito da centrifugazione a gradiente di densità, come descritto^{in precedenza 3}. Le cellule NK purificate sono state criopreservate a 5 × 10⁶ cellule/mL in soluzione congelante (90% FBS e 10% dimetilsolfosida [DMSO]) come aliquote da 0,5 mL in crioviali e conservate a meno di −150°C fino^{all'uso 3}.
   1. Scongelare una fiala contenente 5 ×^{10 6} cellule NK umane primarie agitando delicatamente il cryovial in un bagno d'acqua a 37°C per circa 1 minuto, finché non rimane solo un piccolo cristallo di ghiaccio.
      ATTENZIONE: Maneggiare tutti i campioni di origine umana utilizzando procedure di biosicurezza appropriate e dispositivi di protezione individuale in conformità con le linee guida istituzionali.
      ATTENZIONE: Il DMSO facilita l'assorbimento delle sostanze chimiche per la pelle. Indossa l'attrezzatura protettiva adeguata ed evita il contatto diretto.
   2. Trasferire le cellule scongelate in un tubo centrifuga conico da 15 mL contenente 10 mL di mezzo di coltura NK preriscaldato (37°C) e mescolare con un leggero vortice.
      NOTA: I substrati di coltura di cellule NK sono costituiti da RPMI-1640 avanzato integrato con FBS al 10%, siero AB umano al 10%, 2 mM di L-alanyl-L-glutamina, 100 μg/mL primocina e 50 U/mL di IL-2 umana.
   3. Celle centrifughe (5 min, 300 × g, RT, accelerazione = massimo; decelerazione [freno] = massimo).
   4. Scartate il soprannatante.
   5. Risospendere il pellet in 5 mL di mezzo di coltura NK preriscaldato (37°C).
   6. Celle centrifughe (5 min, 300 × g, RT, accelerazione = massimo; decelerazione [freno] = massimo).
   7. Scartate il soprannatante.
   8. Risospendere il pellet in 1 mL di mezzo di coltura NK preriscaldato.
   9. Trasferire la sospensione in un pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzi.
   10. Aggiungi 1 mL di PBS sterile ai pozzi circostanti per minimizzare l'evaporazione.
   11. Incubare la piastra a 24 pozzi a un angolo di 45° (utilizzando una cremaglieria o supporto per mantenere l'angolo) a 37°C con il 5% di CO₂ per 16–24 ore per consentire il recupero delle cellule NK.
       NOTA: Le cellule NK primarie umane richiedono un contatto cellulare stretto per la massima sopravvivenza e recupero, che può essere ottenuto inclinando la piastra a 24 pozzi e permettendo l'accumulo ai margini dei pozzi. Mantenere un tempo di incubazione costante tra gli esperimenti.
       NOTA: Dopo il periodo di recupero, procedere direttamente alla preparazione delle cellule bersaglio e all'installazione della co-coltura.
2. Tingere le cellule bersaglio con estere succinimidile di carbossifluoresceina (CFSE).
   1. Ottieni 5 × 10⁵ celle target e trasferisci in un tubo centrifuga a fondo conico da 15 mL.
      NOTA: Una linea cellulare di linfoma derivato dal paziente CD38⁺ è stata utilizzata come cellula^{bersaglio 16}.
   2. Lava le cellule una volta con 10 mL PBS.
   3. Celle centrifughe (5 min, 300 × g, RT, accelerazione = massimo; decelerazione [frenata] = massimo).
   4. Preparare una soluzione di lavoro di CFSE a 0,5 μM in PBS utilizzando una soluzione di calcio da 5 mM, diluendo 1 μL di calcio CFSE da 5 mM in 10 mL di PBS in un tubo centrifuga a fondo conico da 15 mL.
      ATTENZIONE: Il CFSE è un colorante fluorescente reattivo che lega le amine e può comportare rischi per l'esposizione alla pelle o agli occhi. Maneggiare con le attrezzature di protezione individuale appropriate e smaltire i reagenti inutilizzati secondo le linee guida locali sulla biosicurezza.
   5. Scartate il soprannatante.
   6. Risospendere il pellet a circa 1 × 10⁶ cellule/mL nella soluzione CFSE.
   7. Incubare per 15 minuti a 37°C con il tubo avvolto in carta stagnola o posizionato all'interno di un contenitore opaco per proteggerlo dalla luce.
   8. Spegni la reazione aggiungendo 5–10 volumi di mezzo di coltura.
   9. Incubare per 5 minuti a 37°C.
   10. Celle centrifughe (5 min, 300 × g, RT, accelerazione = massimo; decelerazione [frenata] = massimo).
   11. Scartate il soprannatante.
   12. Risospendere le celle a 2,5 × 10⁵ cellule/mL in modo che 100 μL contenga 2,5 × 10⁴ celle.
       NOTA: Procedere direttamente alla placcatura per mantenere un'intensità costante del segnale CFSE e la vitalità della cella bersaglio.
3. Celle target a placca
   1. Ottieni una piastra a fondo rotondo con 96 pozzi.
   2. Aggiungere 100 μL/pozzo di celle target (2,5 × 10⁵ celle/mL) ai pozzi designati utilizzando una pipetta multicanale (vedi Figura Supplementare 2). Ogni condizione è placcata in triplice.
      NOTA: Assicurati che la sospensione della cella sia omogenea prima della placcatura.
4. Prepara e aggiungi anticorpi
   1. Preparare 200 μL di soluzione di anticorpi 4× (100 μg/mL) in un mezzo di coltura per cellule NK per ogni anticorpo di test e controllo isotipo abbinato.
      NOTA: Questo passaggio è modulare e può essere adattato a qualsiasi anticorpo che medi ADCC contro la linea cellulare target scelta. Le concentrazioni e le formulazioni di stock di anticorpi possono variare; Regola le diluizioni di conseguenza. Conservanti come l'azide possono influenzare la sopravvivenza delle cellule bersaglio e la funzionalità delle cellule NK. Sebbene sia possibile testare una gamma di concentrazioni di anticorpi, qui viene utilizzata una concentrazione finale di 25 μg/mL.
   2. Trasferire soluzioni di anticorpi a una piastra a pozzo profondo.
   3. Aggiungi 50 μL/pozzo di soluzione di anticorpi alle cellule bersaglio e mescola accuratamente pipettando ≥5 volte.
   4. Aggiungi 50 μL/pozzetto di mezzo di coltura NK a pozzi di controllo senza anticorpi e mescola accuratamente pipettando ≥5 volte.
   5. Incubare per 25–30 minuti a 37°C con il 5% di CO₂.
5. Prepara e aggiungi le cellule NK
   1. Contare e ottenere 2 × 10 celle^{da 5} NK utilizzando un metodo di conteggio delle cellule basato sull'esclusione dei coloranti (ad esempio, blu di tripano) o un metodo validato equivalente. Il numero è sufficiente per tre condizioni contenenti celle NK placcate in triplice, con un eccesso per compensare la perdita da pipetto (vedi Figura Supplementare 2). Procedere se la vitalità è ≥75%, poiché una minore vitalità potrebbe influire sulle prestazioni del saggio.
   2. Risospendere le cellule a 2,5 × 10⁵ cellule/mL in 800 μL di mezzo primario di coltura NK umana (concentrazione finale = 1,25 × 10⁴ cellule/50 μL).
   3. Aggiungi 50 μL/pozzo di celle NK ai pozzi corrispondenti e mescola accuratamente pipettando ≥5 volte.
      NOTA: Assicurati che la sospensione della cella sia omogenea prima della placcatura.
   4. Aggiungi 50 μL/pozzo di mezzo di coltura per controllare i pozzi e mescola accuratamente pipettando ≥5 volte.
6. Impostare la co-cultura finale
   1. Ispezionare attentamente la piastra a fondo rotondo da 96 pozzi per confermare che tutti i pozzi contengano 200 μL con livelli di menisco uniformi e senza bolle.
   2. Centrifugare la piastra (2 min, 100 × g, accelerazione = basso [ad es., 2]; decelerazione [freno] = basso [es., 2]).
      NOTA: Questa spin morbida è importante per stabilizzarsi rapidamente le cellule e aumentare il contatto cellula-cellula. Usiamo una centrifuga Eppendorf 5810R da banco compatibile con un rotore oscillante con le impostazioni di accelerazione e decelerazione impostate a 2 (su 9).
   3. Incubare per 16–18 ore (durante la notte) a 37°C con il 5% di CO₂.
      NOTA: Questa durata di incubazione è ottimizzata per la lettura della citotossicità piuttosto che per la degranulazione, che si valuta meglio misurando l'espressione di CD107a in momenti temporali più precoci (2–6 ore). Pertanto, le risposte di degranulazione al picco possono essere sottostimate.
      NOTA: Non estendere l'incubazione oltre le 18 ore, poiché una co-coltura prolungata può causare una morte eccessiva delle cellule target nei pozzi di controllo e una riduzione dell'intervallo dinamico tra le condizioni sperimentali.
7. Eseguire la citometria a flusso
   1. Centrifuga (5 min, 300 × g, accelerazione = massimo; decelerazione [frenata] = massimo).
   2. Scartate il soprannatante.
   3. Lavare tutti i pozzi con 200 μL/pozzo di FACS buffer (2% FBS, 2 mM EDTA in PBS).
   4. Prepara un master mix di anticorpi superficiali in FACS buffer aggiungendo CD56-BV421 a 1:50 di diluizione, CD16-BV785 a 1:50 di diluizione e CD107a-PE-Cy7 a 1:25 di diluizione.
      NOTA: Calcola il volume totale del master mix basandosi sul progetto sperimentale della piastra (numero di pozzi × 50 μL/pozzo + 20% di eccesso). I cloni di anticorpi possono variare in intensità di colorazione e accessibilità dell'epitopo. I cloni utilizzati nei dati rappresentativi sono elencati nella Tabella dei Materiali, mentre i cloni alternativi possono richiedere la titolazione. Possono essere inclusi anticorpi aggiuntivi per il fenotipizzazione dei sottoinsiemi delle cellule NK (ad esempio, KIR, NKG2A/C/D e CD57) e per i marcatori di attivazione (ad esempio, CD69 e HLA-DR).
   5. Risospendere le cellule in 50 μL/pozzo di miscela master di anticorpi e mescolare accuratamente pipettando ≥5 volte.
   6. Incubare per 15 minuti a 4°C con il piatto avvolto in carta stagnola o posizionato in un contenitore opaco per proteggerlo dalla luce.
   7. Aggiungi 150 μL/pozzo di buffer FACS.
   8. Centrifuga (5 min, 300 × g, accelerazione = massimo; decelerazione [frenata] = massimo).
   9. Scartate il soprannatante.
   10. Risospendere le cellule in 100 μL/pozzo di 5 μM 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) nel buffer FACS e procedere immediatamente all'acquisizione della citometria in flusso. Non è richiesta incubazione pre-acquisizione.
   11. Acquisire dati tramite citometria di flusso e registrare i canali di fluorescenza per CFSE, BV421, BV785, PE-Cy7, DAPI e eventuali fluorofori aggiuntivi.
       NOTA: Le impostazioni di acquisizione (ad esempio, tensioni del rilevatore, compensazione e gating) possono richiedere ottimizzazione. Utilizzare controlli non colorati e a tinta singola per la compensazione e l'installazione del gate, con perle di compensazione o celle rappresentative secondo opportunità. I controlli fluorescenti meno uno dovrebbero essere considerati per marcatori con espressione continua o fioca (ad esempio, CD107a). Mantenere impostazioni e strategie di gate coerenti, inclusi il gating live/dead e l'identificazione delle popolazioni target ed effector, tra gli esperimenti.
       NOTA: Sia lo Step 1 che il Step 2 possono essere adattati per le cellule target aderenti. Le cellule bersaglio dei semi (con i rispettivi mezzi di coltura) in una piastra a fondo piatto di 96 pozzi un giorno prima della co-coltura a una densità che raggiunge circa il 70% di confluenza il giorno del saggio. Dopo aver confermato l'aderenza, si elimina il materiale cellulare bersaglio e si sostituisce con 100 μL di substrato NK-cell fresco, poi si aggiungono cellule effettrici per avviare la co-coltura. A causa delle differenze nella dimensione e morfologia della cellula, i parametri di analisi cellula per cellula di IncuCyte dovrebbero essere ottimizzati per ciascuna linea cellulare aderente.
       NOTA: Per saghi basati su citometria di flusso con cellule aderenti, dopo la co-coltura, centrifugare la piastra (300 × g, 5 min) e scartare il soprandante. Aggiungi 100 μL/pozzo di TrypLE e incuba a 37°C con il 5% di CO₂ per circa 5–15 minuti (a seconda della linea cellulare) per staccare le cellule. Aggiungere 100 μL/pozzo di buffer FACS, mescolare pipettando su e giù in un movimento circolare, e trasferire tutte le celle su una piastra a fondo rotondo da 96 pozzi. Ispezionare i pozzi microscopicamente per confermare il completo distacco prima di procedere con la colorazione (Passo 2, Sotto-passo 7). Ottimizzare il tempo di incubazione del TrypLE secondo necessità per ottenere una sospensione a singola cella.

Risultati

Per quantificare la citotossicità delle cellule NK in tempo reale, le cellule effettrici NK-92 ingegnerizzate per esprimere CAR anti-BCMA sono state co-colte con cellule bersaglio Ramos ^BCMA+ in una piastra nera, trasparente a fondo piatto a 96 pozzi e monitorate tramite imaging a cellule vive (Figura 1A e Figura Supplementare 1A). Le celle effettori sono state aggiunte con rapporti E:T di 0:1 (solo bersaglio), 0,25:1, 0,5:1, 1:1 e 2:1, con ogni condizione eseguita in triplice. Sono stati valutati tre diversi costrutti CAR NK-92: CAR1 senza dominio co-stimolatorio, CAR2 con un dominio co-stimolatore 4-1BB (CD137) e CAR3 con dominio co-stimolatore DAP10, insieme a cellule di controllo NK-92 che esprimono un vettore solo ZsGreen. Tutte le cellule effettrici sono state generate tramite trasduzione lentivirale, come descritto^{in precedenza, utilizzando} cassette transgenice ZsGreen-P2A-CAR. Le cellule bersaglio di Ramos sono state trasdotte in modo simile con un vettore lentivirale codificante con emiRFP670. La crescita e la sopravvivenza delle cellule target sono state monitorate ogni ora in un periodo di 24 ore utilizzando lo strumento di imaging delle cellule vive, misurando la fluorescenza verde per le cellule ZsGreen⁺ NK-92, la fluorescenza arancione per le cellule morte SYTOX Orange⁺ e la fluorescenza NIR per le cellule target emiRFP670⁺ (Figura 1A e Figuri Supplementari 1B e 1C).

Immagini microscopiche sono state acquisite a intervalli di tempo definiti per visualizzare cellule effettrici, cellule bersaglio vive e cellule morte durante la co-coltura (Figura 1B). La quantificazione della crescita e della sopravvivenza delle cellule target ha dimostrato che le cellule CAR2 e CAR3 NK-92 hanno mostrato cinetiche di uccisione più rapide rispetto alle cellule CAR1 NK-92, in particolare nei momenti temporali precedenti con un rapporto E:T di 1:1. La morte delle cellule target è aumentata con rapporti E:T più elevati, inclusi quelli di controllo NK-92, che hanno dimostrato citotossicità naturale (Figura 1C). Queste misurazioni evidenziano la capacità dell'imaging a cellule vive di catturare cambiamenti dinamici nell'attività citotossica. La sopravvivenza della cellula bersaglio è stata inoltre analizzata in funzione del rapporto E:T in momenti temporali definiti per confrontare la potenza del CAR NK-92. Le celle CAR2 e CAR3 NK-92 hanno mostrato una maggiore potenza a rapporti E:T più bassi nei momenti successivi (ad esempio, E:T = 0,25:1 a 24 ore) e in rapporti intermedi E:T in momenti temporali precedenti (ad esempio, E:T = 1:1 a 4 ore) (Figura 1D). Non sono state osservate differenze significative nell'uccisione tra le cellule effettrici NK-92 di CAR2 e CAR3 tra le analisi.

Una heatmap che integra il rapporto E:T, il tempo di co-incubazione e la sopravvivenza delle cellule target fornisce una visualizzazione completa della citotossicità naturale e mediata dalla CAR in tutte le popolazioni di effettori e consente una valutazione quantitativa. Furono definiti tre parametri per quantificare potenza e cinetica: KR₅₀, il rapporto killer-target che raggiunge il 50% di uccisione (a 12 ore); KT₅₀, il tempo di co-incubazione richiesto per raggiungere il 50% di uccisione (con un rapporto E:T di 1:1); e IKI₅₀, l'indice killer integrato che rappresenta l'area della mappa termica sotto il 50% di sopravvivenza, definita dall'isoclina del 50% di sopravvivenza (Figura 1E). Queste metriche permettono il confronto tra la potenza delle cellule CAR NK-92 (KR₅₀), la cinetica di uccisione (KT₅₀) e la prestazione citotossica integrata (IKI₅₀) (Figura 1F). Questa analisi dimostra come il saggio possa confrontare quantitativamente le piattaforme ingegnerizzate per cellule NK su più parametri all'interno di un unico esperimento.

La citometria a flusso con conteggio cellulare è stata utilizzata per misurare l'ADCC co-coltivando cellule target marcate fluorescenti con cellule NK primarie umane in presenza o senza di anticorpi terapeutici e quantificando la popolazione residua viva di cellule bersaglio dopo 16–18 ore di incubazione (Figura 2A). Possono essere utilizzati citometri a flusso come Cytek Aurora, BD Symphony o BD Fortessa con un campionatore ad alta produttività. Nella configurazione rappresentativa (Figura Supplementare 2), le cellule bersaglio del linfoma derivato dal paziente CD38⁺ sono state impiegate in una piastra a fondo rotondo a 96 pozzi, e il daratumumab (o anticorpo isotipo) è stato aggiunto ai pozzi appropriati. Le cellule NK sono state quindi co-colte con un rapporto E:T di 0,5:1, un rapporto ottimizzato per queste cellule bersaglio, al fine di minimizzare l'uccisione naturale permettendo al contempo il rilevamento dell'ADCC. Dopo l'incubazione, è stata eseguita la citometria a flusso per risolvere le popolazioni cellulari tramite scatter frontale e laterale, escludere eventi non vitali tramite DAPI e separare le cellule target ^CFSE+ da celle NK CD56⁺CD16⁺ per analisi parallela (Figura 2B). Questo design consente la misurazione simultanea della citotossicità e la caratterizzazione fenotipica.

Figura 2. Il saggio di citotossicità cellulare dipendente da anticorpi (ADCC) basato su citometria a flusso consente la quantificazione simultanea della sopravvivenza della cellula bersaglio e dell'attivazione delle cellule NK. (A) Panoramica schematica del saggio ADCC. Le cellule target del linfoma CD38⁺ marcate con CFSE sono state placcate a 2,5 × 10⁴ cellule per pozzo e coltivate in cinque condizioni: sole cellule target; cellule bersaglio con daratumumab (25 μg/mL); celle target con celle NK (E:T = 0,5:1); le cellule di bersaglio con cellule NK e daratumumab; e cellule bersaglio con cellule NK e anticorpi di controllo isotipo (25 μg/mL). (B) Strategia rappresentativa di gating della citometria a flusso. Gli eventi sono stati inizialmente bloccati dalla diffusione diretta e laterale, seguiti dall'esclusione delle celle non vitali tramite DAPI. Le cellule bersaglio sono state identificate come eventi ^CFSE+, mentre le cellule NK sono state identificate come eventi CD56⁺ e CD16⁺. La degranulazione delle cellule NK è stata valutata tramite l'espressione di CD107a. (C) Quantificazione della sopravvivenza della cellula target, espressa come percentuale rispetto alla condizione di controllo solo target (impostata al 100%). (D) Quantificazione della degranulazione delle cellule NK, mostrata come percentuale di cellule CD107a⁺ all'interno della popolazione di cellule NK. Le barre rappresentano la deviazione media ± standard, mentre i punti sovrapposti rappresentano singoli pozzi replicati (n = 3). L'analisi statistica è stata effettuata utilizzando un'analisi unidirezionale della varianza con il test di confronto multiplo post hoc di Tukey. La significatività statistica è indicata come segue: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

L'endpoint primario è la sopravvivenza della cella bersaglio, calcolata all'interno della porta ^CFSE+ live e normalizzata alla condizione solo bersaglio, impostata al 100% di sopravvivenza. Questa normalizzazione controlla la perdita spontanea di cellula bersaglio e consente il confronto diretto tra condizioni. Nei dati rappresentativi (Figura 2C), l'aggiunta di daratumumab da sola non ha ridotto la sopravvivenza delle cellule bersaglio, confermando che l'anticorpo non ha un effetto diretto sulla vitalità delle cellule bersaglio in assenza di cellule effettrici. La co-coltura con le sole cellule NK ha ridotto la sopravvivenza delle cellule bersaglio a circa il 70%, indicando una citotossicità naturale di base. L'aggiunta di daratumumab ha ulteriormente ridotto la sopravvivenza a circa il 37%, coerente con un aumento della morte mediata dagli anticorpi, mentre la condizione di controllo dell'isotipo ha mostrato una sopravvivenza di circa il 62%, paragonabile alla condizione solo NK. Esperimenti riusciti mostrano una netta separazione tra condizioni trattate con anticorpi e condizioni di controllo con alta riproducibilità tra repliche.

La fenotipizzazione secondaria delle cellule NK fornisce una conferma complementare del legame tra la morte delle cellule bersaglio e l'attivazione degli effettori. La degranulazione delle cellule NK, misurata come percentuale di cellule NK CD107a⁺ , è stata più bassa nella co-coltura cellula–bersaglio cellula NK senza anticorpi e più alta nella condizione trattata con daratumumab (circa 31%), con il controllo isotipo che mostrava una degranulazione intermedia (circa 19%), a supporto dell'attivazione mediata dagli anticorpi (Figura 2D). Questi risultati dimostrano che il test può distinguere l'uccisione delle cellule bersaglio dall'attivazione degli effettori. Sebbene le tendenze di degranulazione e sopravvivenza siano generalmente allineate, non si sovrappongono completamente, indicando che rappresentano processi biologici correlati ma distinti.

Esperimenti subottimali mostrano tipicamente una riduzione della separazione tra le condizioni, variabilità nel conteggio cellulare tra i pozzi, alta morte delle cellule target nei pozzi di controllo, debole colorazione CFSE o elevata degranulazione di fondo. Questi esiti possono derivare da scarsa vitalità delle cellule bersaglio, recupero incoerente delle cellule NK, miscelazione inadeguata o variabilità nella colorazione e nell'acquisizione. Poiché il saggio identifica indipendentemente i compartimenti bersaglio ed effettore, può essere esteso per includere un fenotipaggio aggiuntivo delle cellule bersaglio (ad esempio, densità di antigeni o espressione di ligandi) e una caratterizzazione più ampia delle cellule NK. L'inclusione di una condizione "solo NK" può ulteriormente quantificare la degranulazione di base e la vitalità delle cellule NK. Questo design multiparametro rappresenta un vantaggio chiave, che consente di interpretare la citotossicità funzionale insieme ai fenotipi immunitari meccanicistici.

Figura supplementare 1. Disposizione rappresentativa delle placche e flusso di lavoro di analisi per il saggio di citotossicità di imaging a cellule vive. (A) Schema rappresentativo a 96 pozzi per il saggio CAR NK-cell killing. Quattro condizioni della cella effettore sono disposte in quadranti, ciascuna testata con rapporti E:T di 0:1 (controllo solo bersaglio), 0,25:1, 0,5:1, 1:1 e 2:1, con ogni condizione eseguita in triplicata (totale di 60 pozzi di saggio). (B) Configurazione rappresentativa dell'analisi Cell-by-Cell non aderente nel software IncuCyte 2021C, illustrando i parametri di dismixaggio, segmentazione e mascheramento spettrali utilizzati per identificare singole cellule effettori e bersaglio, escludendo detriti e aggregati. (C) Strategia rappresentativa di gating di classificazione cellula per cellula utilizzando la fluorescenza NIR rispetto a SYTOX Orange per definire la popolazione viva di cellule target. Pozzi solo target e pozzi di co-coltura in un momento di esempio (t = 4 h) vengono utilizzati per confermare la separazione tra popolazioni di cellule vive e morte. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 2. Disposizione rappresentativa delle lastre per il saggio ADCC basato su citometria di flusso. Disposizione rappresentativa delle piastre a 96 pozzi che illustra cinque condizioni sperimentali placcate in triplicata tra le righe B–D e colonne 2–6 (pozzetti totali = 15): (1) controllo solo bersaglio, (2) cellule target con daratumumab, (3) cellule target con cellule NK, (4) cellule target con cellule NK e daratumumab, e (5) cellule target con cellule NK e anticorpo di controllo isotipo. Le celle target sono state placcate a 2,5 × 10^{4 celle} per pozzo, e le NK sono state aggiunte a 1,25 × 10⁴ celle per pozzo per ottenere un rapporto E:T di 0,5:1. Gli anticorpi sono stati utilizzati a una concentrazione finale di 25 μg/mL. I pozzi circostanti furono riempiti di PBS per minimizzare l'evaporazione. La condizione solo bersaglio è stata utilizzata per normalizzare la sopravvivenza delle cellule bersaglio, e il controllo isotipo ha tenuto conto degli effetti della formulazione degli anticorpi indipendentemente dalla specificità dell'antigene. L'ottimizzazione del rapporto E:T può essere necessaria a seconda della suscettibilità della linea cellulare bersaglio. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Questi protocolli forniscono due approcci complementari per quantificare la citotossicità delle cellule NK in un formato standardizzato a 96 pozzi a piastra piane. Lo Step 1 utilizza imaging in tempo reale delle cellule vive per monitorare continuamente la perdita bersaglio-cellula ed è molto adatto per valutare la cinetica delle uccisioni naturali e mediate da CAR su molteplici rapporti E:T. Il Passaggio 2 utilizza la citometria a flusso per quantificare l'ADCC dopo un periodo di co-incubazione definito, separando contemporaneamente i compartimenti target ed effettori per l'analisi^{fenotipica 17}. Questi metodi, presentati come piattaforme complementari per il test che possono essere utilizzate per modellare processi biologici distinti, sono anch'essi facilmente intercambiabili. Le cellule NK umane primarie possono essere utilizzate per saggi ADCC basati su imaging di cellule vive e possono anche essere ingegnerizzate per la morte mediata da CAR in saghi di citometria a flusso. Inoltre, sebbene le cellule NK-92 di tipo selvatico non espongano l'espressione^{CD16 18}, l'introduzione di CD16 (ad esempio, tramite trasduzione lentivirale) permette facilmente alle cellule NK-92 di mediare ADCC potenti. Pertanto, entrambi i saghi possono essere adattati alle esigenze scientifiche e traslazionali individuali.

Ci sono diversi passaggi particolarmente importanti per la riproducibilità in entrambi gli sani. Piccoli cambiamenti nel numero di cellule effettrici e nel fenotipo possono alterare drasticamente la sopravvivenza delle cellule bersaglio. Un conteggio accurato delle cellule e una risospensione accurata durante la placcatura sono essenziali per minimizzare le deviazioni nel conteggio cellulare e la miscelazione incompleta. Analogamente, la preparazione cellulare deve essere mantenuta coerente tra gli esperimenti, inclusa la vitalità, i tempi di recupero e l'esposizione precedente alle citochine, per garantire una funzionalità uniforme degli effettori. La geometria della lastra è un altro fattore chiave che determina le prestazioni del saggio. Nel flusso di lavoro di imaging a cellule vive, le lastre a fondo piatto supportano l'acquisizione stabile dell'immagine e un'analisi costante sul campo, mentre nel flusso di lavoro della citometria a flusso, le piastre a fondo arrotondato favoriscono il contatto cellula-cellula e facilitano il recupero di co-colture non aderenti al punto terminale. Inoltre, la qualità dell'etichettatura fluorescente deve essere confermata prima del saggio, poiché una scarsa discriminazione cellula-bersaglio tramite imaging o una debole separazione CFSE tramite citometria a flusso compromettono la quantificazione e l'interpretazione.

Questi due flussi di lavoro presentano considerazioni tecniche distinte. Nel saggio di imaging a cellule vive, le cause comuni di scarsa qualità dei dati includono placcatura cellulare disomogenea, raggruppamento o aggregazione cellulare densa e soglie subottimali per l'analisi delle immagini, tutte facilmente correggibili. Questi problemi possono distorcere il conteggio cellulare e causare un tracciamento incoerente nel tempo. Nel saggio basato su citometria a flusso, gli esiti subottimali sono più spesso causati da un'elevata morte cellulare bersaglio di fondo, una debole separazione tra popolazioni target ed effettori, scarsa colorazione degli anticorpi o pipetting incoerente tra pozzi replicati. Poiché questi saghi sono progettati per l'analisi comparativa, l'inclusione di controlli interni appropriati è essenziale per l'interpretazione, inclusi controlli solo bersaglio per la normalizzazione e controlli negativi abbinati per condizioni specifiche di anticorpi o CAR.

Con questi metodi devono essere considerate diverse limitazioni condivise e specifiche per analisi. Il saggio di imaging a cellule vive fornisce risoluzione temporale ma dipende da parametri accurati di marcatura fluorescente e analisi delle immagini, entrambi influenzati da clustering cellulare, sovrapposizione spettrale o cambiamenti morfologici durante^{la co-coltura 15}. In alcuni casi, soprattutto quando gli saggi coinvolgono cellule effettrici primarie, ottenere un'adeguata marcatura fluorescente senza alterare la dinamica di uccisione è difficile o non fattibile. Il saggio basato su citometria di flusso fornisce una risoluzione fenotipica più elevata a un punto finale definito, ma non distingue indipendentemente l'uccisione precoce da quella tardiva a meno che non vengano raccolti più punti temporali corrispondenti, il che può essere costoso e richiedere tempo¹⁷. Inoltre, le misurazioni degli endpoint possono riflettere non solo la morte delle cellule bersaglio, ma anche differenze nella proliferazione delle cellule bersaglio, nell'attrito degli effettori o nel recupero durante la gestione del campione. Letture meccanicistiche come CD107a sono quindi meglio interpretate come indicatori complementari dell'attivazione delle cellule effettrici piuttosto che come sostituti diretti^{dell'eliminazione} 19 delle cellule bersaglio. Più in generale, nessuna delle due piattaforme riproduce completamente l'architettura spaziale, le interazioni stromali, i gradienti di citochine o i vincoli di traffico che influenzano la funzione delle cellule NK in vivo.

Devono essere inoltre presi in considerazione diversi fattori biologici nell'interpretazione degli saggi di uccisione delle cellule NK. La variabilità donatore a donatore è intrinseca agli esperimenti con cellule NK primarie umane, che differiscono per potenziale citotossico e composizione di sottoinsieme a causa dell'età del donatore, sesso, storia di malattie infettive e polimorfismi dei^{recettori 20}. L'uso delle cellule NK-92 riduce notevolmente la variabilità, ma queste cellule possono comunque mostrare cambiamenti legati alla sorgente e al passaggio¹⁸. Il nostro protocollo mitiga le differenze tecniche o sperimentali attraverso parametri standardizzati e confronti tra le stesse placche per valutare con maggiore precisione questi fattori biologici. Dove possibile, raccomandiamo di utilizzare intervalli di passaggio definiti per NK-92 con soglie di vitalità fisse. Per le cellule NK primarie, i saghi dovrebbero utilizzare cellule NK di più donatori per ogni condizione, con analisi statistiche che tengono conto della variabilità donatore a donatore (ad esempio, modelli a pareti o a effetti misti), dato che le differenze relative tra le condizioni sono generalmente preservate tra i donatori. Inoltre, ulteriori marcatori delle cellule NK (ad esempio, KIR, NKG2A/C/D e CD57) possono essere incorporati nei pannelli di anticorpi utilizzati per la citometria di flusso per confrontare le frequenze dei sottoinsiemi tra donatori e valutare l'attivazione specifica delle cellule NK per sottoinsieme (cioè l'espressione di CD107a e CD69), facilitando ulteriormente l'interpretazione dei risultati. Infine, per tutti gli saggi di uccisione delle cellule NK, devono essere considerati alcuni scenari aggiuntivi. L'espressione di antigeni mirati sulle cellule NK, sia per espressione endogena sia per acquisizione di antigeni dalle cellule target tramite trogocitosi, può portare a un fratricide delle cellule NK e confondere risultati. Ad esempio, il daratumumab può colpire CD38 espresso sulle cellule NK e indurre il^{fratricide 21}, limitando la grandezza dell'ADCC rispetto ai bersagli previsti. Fortunatamente, l'imaging a cellule vive e i saggi di citometria a flusso permettono di quantificare le cellule NK per valutare il fraccionismo.

Nonostante queste limitazioni, l'uso combinato di imaging a cellule vive e citometria a flusso fornisce un quadro pratico per il test funzionale delle cellule NK riproducibili in una gamma di applicazioni di base e precliniche. Il flusso di lavoro di imaging è vantaggioso quando il comportamento temporale è importante, come distinguere risposte citotoxiche rapide da ritardate o confrontare la cinetica di uccisione tra i progetti^{CAR 22}. Il flusso di lavoro basato sulla citometria di flusso è vantaggioso quando le letture funzionali devono essere interpretate insieme ai fenotipi delle cellule effettori e delle cellule target all'interno dello stesso campione. Insieme, questi approcci permettono una valutazione quantitativa del natural killing, della citotossicità mediata dalla CAR e dell'ADCC utilizzando piattaforme sperimentali ampiamente accessibili. Stabilendo un quadro standardizzato e scalabile, questo sistema facilita un rigoroso benchmarking e un'interrogazione meccanicistica tra le modalità basate sulle cellule NK, accelerando lo sviluppo e la traduzione clinica delle immunoterapie di nuova generazione.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Advanced RPMI-1640 medium	Thermo Fisher Scientific	12633020	Basal medium per NK-92 e media di coltura per NK umani primari (vedere il protocollo per la formulazione completa)
Anti-human CD107a antibody, PE-Cy7 conjugated (clone H4A3)	BioLegend	328618	Marcatore di degranulazione per citometria a flusso
Anti-human CD16 antibody, BV785 conjugated (clone 3G8)	BioLegend	302046	Citometria a flusso
Anti-human CD56 antibody, BV421 conjugated (clone HCD56)	BioLegend	318328	Citometria a flusso
Benchtop centrifuge with swinging bucket rotor compatible with 15-mL tubes and 96-well plates (Eppendorf Centrifuge 5810R)	Eppendorf	5811000015	Usato per il pelleting delle cellule e la centrifugazione delle piastre (100–300 × g)
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)	Thermo Fisher Scientific	C34554	Colorante per la proliferazione cellulare per l'etichettatura delle cellule bersaglio
Cytek Aurora spectral flow cytometer (or equivalent)	Cytek Biosciences	N7-00003	Usato per l'acquisizione e l'analisi della citometria a flusso
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)	BioLegend	422801	Colorante nucleare per la discriminazione vivo/morto
Deep-well 96-well plate	USA Scientific	1896-2110	Usato per la preparazione degli anticorpi
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	BP231-100	Reagente per la criopreservazione
Fetal bovine serum (FBS)	Avantor	76419-584	Supplementazione del mezzo basale; usato nel buffer FACS (2% FBS)
General Purpose Water Bath, 10 L (37 °C)	PolyScience	WBE10	Per lo scongelamento delle cellule
GlutaMAX (L-alanyl-L-glutamine supplement)	Thermo Fisher Scientific	35050061	Fonte stabile di glutammina
Human AB serum	Sigma-Aldrich	H4522-100ML	Supplemento per i media di coltura per NK umani primari
IncuCyte SX5 live-cell imaging system	Sartorius	4816	Imaging live delle cellule in tempo reale e analisi Cell-by-Cell
LUNA-FL dual fluorescence cell counter (or equivalent)	Logos Biosystems	L20001	Conteggio cellulare automatizzato
Parafilm M (4 in × 250 ft roll)	Genesee	16-101	Sigillatura e conservazione delle piastre
Phosphate-buffered saline (PBS), sterile (pH 7.2–7.4)	Corning	21-020-CV	Usato per lavaggi e preparazione del buffer FACS
Poly-D-lysine (0.1 mg/mL)	Thermo Fisher Scientific	A3890401	Reagente per il rivestimento delle piastre
Primocin	InvivoGen	ant-pm-2	Antibiotico
Recombinant human interleukin-2 (IL-2)	R&D Systems	202-IL-500	Citochina
RosetteSep Human NK-cell enrichment kit	STEMCELL Technologies	15065	Cocktail per l'arricchimento delle cellule NK umane
SYTOX Orange dead cell stain	Thermo Fisher Scientific	S34861	Colorante di vitalità per l'imaging delle cellule vive
Trypan Blue 0.4%	Gibco	15250-061	Colorante di vitalità per il conteggio delle cellule
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red	Thermo Fisher Scientific	12604039	Per il distacco delle cellule aderenti
UltraPure EDTA (0.5 M, pH 8.0)	Thermo Fisher Scientific	15575020	Usato per la preparazione del buffer FACS
15-mL conical-bottom centrifuge tubes	Corning	352097	Sterili
24-well tissue culture plate (tissue culture–treated)	Corning	3524	Usato per il recupero delle cellule NK
96-well clear round-bottom plate (tissue culture–treated)	Corning	3799	Usato per co-colture e saggi di citometria a flusso
96-well flat clear-bottom black polystyrene plate (tissue culture–treated)	Corning	3603	Compatibile con i sistemi di imaging delle cellule vive