Uno studio di farmacologia di rete e docking molecolare della formula TongBi per l'osteoartrite

Sommario

Questo protocollo prevede potenziali bersagli terapeutici e meccanismi molecolari della formula TongBi contro l'osteoartrite utilizzando la farmacologia di rete e il docking molecolare.

Abstract

Questo studio ha applicato la farmacologia di rete combinata con l'aggancio molecolare per prevedere i potenziali bersagli terapeutici e i meccanismi molecolari della Formula TongBi (TBF) nell'osteoartrite (OA). I componenti attivi e i bersagli corrispondenti della TBF sono stati recuperati dal database e dalla piattaforma di analisi dei sistemi di farmacologia tradizionale cinese, mentre i bersagli correlati all'OA sono stati raccolti da Online Mendelian Inheritance in Man, GeneCards, DrugBank e Therapeutic Target Database. Un software di visualizzazione e analisi di rete è stato utilizzato per costruire reti composto–bersaglio e interazione proteina–proteina (PPI). L'annotazione funzionale della Gene Ontology e le analisi di arricchimento delle vie delle vie della Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes sono state effettuate utilizzando la piattaforma Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery. L'analisi del docking molecolare è stata condotta utilizzando un software di docking molecolare per valutare l'affinità di legame prevista tra i composti attivi chiave e le proteine target centrali. Sono stati identificati in totale 47 obiettivi sovrapposti tra TBF e OA. L'analisi della rete PPI ha evidenziato JUN, RELA, IL6, MAPK1 e IL10 come potenziali obiettivi centrali. L'analisi di arricchimento ha suggerito che la TBF potrebbe regolare l'infiammazione, il metabolismo lipidico e molteplici vie di segnalazione intracellulari associate alla progressione dell'OA. I risultati del docking molecolare hanno dimostrato affinità di legame favorevoli tra i composti attivi principali e i principali bersagli proteici correlati all'OA. Questi risultati forniscono un quadro computazionale per comprendere i potenziali meccanismi della TBF contro l'OA e supportano ulteriori convalidazioni sperimentali.

Introduzione

L'osteoartrite (OA) è una malattia infiammatoria degenerativa della cartilagine^{articolare 1}. Attualmente, circa 58 milioni di adulti sono colpiti dall'OA e si prevede che questo numero aumenterà a 78,4 milioni entro il 2040^2. L'OA è una causa comune di dolore articolare e compromettenti funzionali in^{tutto il mondo 3}. A causa del dolore intenso associato all'OA, i pazienti spesso sperimentano una disabilità significativa nella vita^{quotidiana 4}. Età, sesso femminile, obesità e danni articolari sono i principali fattori di rischio per^{l'OA 5}. Sebbene la prevalenza dell'OA sia estremamente alta e abbia un impatto significativo sui sistemi sanitari, le opzioni di trattamento disponibili rimangono^{limitate 6}. La medicina moderna adotta comunemente trattamenti sintomatici come farmaci antinfiammatori non steroidei e protettivi della cartilagine. Tuttavia, la somministrazione a lungo termine causa frequentemente reazioni avverse, tra cui danni gastrointestinali e funzionalità anomala di fegato e^rene. Pertanto, è urgente sviluppare nuovi metodi di trattamento o terapie alternative per l'OA.

La Medicina Tradizionale Cinese (MTC) ha accumulato una vasta esperienza nel trattamento dell'OA, con particolare enfasi sulla differenziazione della sindrome e sulla regolazione olistica. La Formula TongBi (TBF) è una prescrizione classica composta principalmente da Danggui, Danshen, Jixueteng, Haifengteng, Tougucao, Duhuo, Weilingxian e Xiangfu. Dal punto di vista della MTC, la natura patologica dell'OA deriva principalmente dall'invasione di vento-freddo-umidità e dalla stagnazione di qi e^{sangue 8}. La compatibilità erboristica della TBF è progettata per adattarsi a questo meccanismo patologico centrale, con tutti i componenti medicinali che agiscono sinergicamente per dissipare vento e umidità, dragare meridiani e promuovere la circolazione sanguigna, corrispondendo così alle caratteristiche tipiche della sindrome della MTC dell'OA. Indagini cliniche in crescita suggeriscono che la TBF modificata possa alleviare il dolore articolare e migliorare la funzione motoria degli arti nei pazienti con^{OA 9}. Ulteriori osservazioni cliniche hanno inoltre dimostrato il suo potenziale nel regolare le risposte infiammatorie nei casi¹⁰ dell'OA, mentre una recente meta-analisi ha ulteriormente supportato la sua applicabilità clinica per l'intervento^{OA 11}.

La TBF è tradizionalmente usata per dissipare il vento, sbloccare i canali, disperdere il freddo, eliminare l'umidità e promuovere la circolazione sanguigna e il nutrimento. Tuttavia, i meccanismi specifici con cui la TBF esercita potenziali effetti terapeutici contro l'artrosi rimangono poco chiari, e i suoi componenti attivi e i principali obiettivi devono ancora essere determinati. Per indagare questi meccanismi in modo più sistematico e completo, abbiamo utilizzato un approccio di farmacologia di rete per costruire una mappa di rete che illustra le relazioni tra farmaci, bersagli e^{malattie 12}. Inoltre, sono state effettuate analisi di arricchimento della Gene Ontology (GO) e della Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) per esplorare i potenziali meccanismi molecolari e le vie di segnalazione coinvolte nell'azione farmacologica di^{TBF 13}. Per indagare sistematicamente i meccanismi farmacologici delle prescrizioni di MTC, questo studio ha stabilito un flusso di lavoro analitico completo che copre lo screening degli ingredienti attivi, la previsione dei bersagli, la costruzione di reti, l'analisi dell'arricchimento funzionale e il docking molecolare. Un tale quadro di ricerca è stato riconosciuto come un paradigma standardizzato e riproducibile per esplorare i meccanismi molecolari delle formule della MTC rispetto^{all'OA 14}. Gli studi metodologici esistenti hanno ulteriormente supportato la razionalità scientifica e l'applicabilità pratica di questa strategia^{di ricerca 15}. Oltre alla standardizzazione metodologica, il presente studio aiuta a definire le fondamenta materiali e gli obiettivi regolatori fondamentali della TBF in OA. Inoltre, fornisce riferimenti teorici per l'applicazione clinica e la futura validazione sperimentale della TBF, offrendo al contempo un quadro metodologico fattibile per l'esplorazione meccanicistica di altre prescrizioni della MTC.

In questo studio, abbiamo utilizzato un approccio di farmacologia di rete per selezionare i componenti attivi e costruire una rete composto–bersaglio combinata con geni target correlati all'OA. Successivamente furono eseguite analisi di arricchimento funzionale e agganciamento molecolare per l'esplorazione meccanicistica. La farmacologia di rete integra informazioni biologiche e farmacologiche per indagare le relazioni farmaco–bersaglio–malattia da una prospettiva completa e^{sfaccettata 16}. Riteniamo che questo approccio possa aiutare a chiarire i potenziali meccanismi farmacologici della TBF e fornire una base teorica per ricerche sperimentali successive. Il flusso di lavoro dello studio è presentato nella Figura 1.

Figura 1. Flusso di lavoro della farmacologia di rete e progettazione dello studio di docking molecolare. Panoramica schematica del flusso di lavoro analitico utilizzato per indagare i potenziali meccanismi della Formula TongBi (TBF) contro l'osteoartrite (OA). Il flusso di lavoro includeva lo screening di composti attivi, la previsione dei bersagli, la raccolta di bersagli correlata all'OA, l'analisi delle intersezioni, la costruzione di reti, l'analisi dell'interazione proteina-proteina (PPI), analisi di arricchimento per Gene Ontology (GO) e la Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), oltre alla validazione del docking molecolare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocollo

Non sono stati coinvolti in questo studio partecipanti umani, animali vertebrati o campioni di tessuto. Tutte le analisi sono state effettuate utilizzando database bioinformatici accessibili al pubblico e approcci di docking molecolare; pertanto, non era richiesta l'approvazione etica.

Screening dei componenti e dei corrispondenti obiettivi del TBF
Tutti gli ingredienti erboristici di TBF, inclusi Danggui, Danshen, Jixueteng, Haifengteng, Tougucao, Duhuo, Weilingxian e Xiangfu, sono stati ricercati nel TCM Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP) (consultato gennaio 2026). I termini esatti di ricerca corrispondevano ai nomi latini standardizzati di ogni medicina erboristica: Angelicae Sinensis Radix (Danggui), Radix Salviae (Danshen), Spatholobus suberectus Dunn (Jixueteng), Caulis Piperis Kadsurae (Haifengteng), Impatiens balsamina (Tougucao), Radix Angelicae Biseratae (Duhuo), Radix Clematidis (Weilingxian) e Cyperi Rhizoma (Xiangfu). I componenti chimici sono stati selezionati secondo le soglie fisse di biodisponibilità orale (OB) ≥ 30% e somiglianza farmacologica (DL) ≥ 0,18. Questi valori di soglia sono ampiamente utilizzati negli studi farmacologici della rete TCM per identificare composti attivi biodisponibili e simili a farmaci con potenziale attività in vivo. I composti privi di valori espliciti di OB o DL nel database sono stati esclusi per mantenere l'affidabilità e la coerenza dello screening attivo dei composti.

I corrispondenti bersagli proteici dei composti attivi selezionati sono stati successivamente recuperati dal database farmacologico della MTC. La standardizzazione dei geni target è stata effettuata utilizzando il database di annotazione delle proteine Universal Protein Resource (UniProt), con la specie limitata a Homo sapiens (consultato gennaio 2026). I nomi originali delle proteine sono stati convertiti in simboli genici umani ufficiali, mentre le voci ridondanti e non umane dei bersagli sono state escluse manualmente. I target duplicati sono stati rimossi tramite confronto manuale e colazione per generare il dataset finale dei target TBF.

Identificazione di bersagli correlati all'OA e potenziali bersagli terapeutici della TBF per l'OA
I bersagli correlati all'OA sono stati recuperati utilizzando esattamente il termine di ricerca "Osteoartrite" nei database Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM), GeneCards, DrugBank e Therapeutic Target Database (TTD) (consultati gennaio 2026). I target duplicati ottenuti da diversi database venivano rimossi manualmente tramite raccolta e confronto dei dati per generare il dataset target correlato all'OA. Per le GeneCard, sono stati mantenuti solo i target con punteggio di rilevanza ≥ 3. I target recuperati da OMIM, DrugBank e TTD utilizzando la parola chiave "Osteoartrite" non sono stati sottoposti a criteri di filtraggio aggiuntivi. I bersagli sovrapposti tra i bersagli attivi correlati al composto e quelli correlati all'OA sono stati identificati utilizzando lo strumento di analisi online Venn Venny 2.1.0. L'analisi di intersezione è stata effettuata per determinare i potenziali bersagli terapeutici della TBF contro l'OA.

Costruzione della rete TBF–Componente–Bersaglio
I dati di interazione componente–bersaglio sono stati importati nel software di visualizzazione e analisi della rete Cytoscape 3.10.2 per costruire la rete TBF–Component–Target (consultato gennaio 2026). Nella rete costruita, i nodi rappresentavano composti erbatici e geni bersaglio, mentre gli archi rappresentavano le interazioni tra composti attivi e bersagli corrispondenti. Per evitare analisi ridondanti, composti duplicati condivisi tra più erbe sono stati fusi in un unico nodo. Successivamente è stata eseguita un'analisi topologica di rete utilizzando il valore di grado come parametro di valutazione primario. I composti attivi centrali sono stati identificati in base al grado di classificazione e selezionati come candidati ligando per l'analisi successiva del docking molecolare.

Costruzione della rete PPI
I potenziali target terapeutici sono stati importati nel database STRING PPI per l'analisi PPI (consultato gennaio 2026). Il parametro della specie è stato limitato a Homo sapiens e il punteggio minimo di fiducia nell'interazione richiesto è stato fissato a 0,9, mentre tutti i parametri restanti sono stati mantenuti alle impostazioni predefinite. I dati di interazione generati venivano esportati e ulteriormente visualizzati utilizzando il software di visualizzazione e analisi della rete. L'analisi topologica della rete PPI è stata effettuata utilizzando il plugin di analisi topologica della rete CytoHubba. Sono stati calcolati gradi, centralità di intermedietà e centralità di vicinanza per valutare l'importanza dei nodi all'interno della rete di interazione. Le proteine target di core sono state identificate sulla base di caratteristiche topologiche integrate e selezionate per una successiva analisi di aggancio molecolare. L'algoritmo di Centralità Massima della Clique è stato adottato per selezionare i target dell'hub. I nodi senza partner interagenti sono stati esclusi, il che ha portato a un numero inferiore di nodi nella rete finale rispetto al dataset target importato originale.

VAI e KEGG
Sono state effettuate analisi di arricchimento funzionale GO e analisi di arricchimento delle vie KEGG per indagare le potenziali funzioni biologiche e le vie di segnalazione associate ai target terapeutici identificati di TBF contro OA. L'analisi GO includeva le tre categorie ontologiche standard: processo biologico (BP), componente cellulare (CC) e funzione molecolare (MF), con il processo biologico designato come principale focus di interpretazione.

L'analisi di arricchimento funzionale è stata condotta utilizzando il Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID) in combinazione con il software di analisi statistica R (versione 4.3.1; consultato gennaio 2026). I risultati dell'arricchimento venivano elaborati e visualizzati utilizzando il pacchetto clusterProster , con le funzioni dotplot e barplot utilizzate per generare diagrammi di arricchimento. Tutti i geni bersaglio erano annotati sul contesto di Homo sapiens . Il metodo Benjamini–Hochberg è stato applicato per la correzione molteplici di test, e un valore P aggiustato < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

La visualizzazione dei risultati di arricchimento GO e KEGG è stata effettuata utilizzando la piattaforma di analisi online MicrobiomeAnalyst/MicrobiomeNet (consultato gennaio 2026). Sono stati generati grafici a barre e diagrammi a bolle per mostrare i termini GO più significativamente arricchiti e i percorsi KEGG.

Attracco molecolare
I nomi ufficiali dei geni e i corrispondenti identificatori della Protein Data Bank (PDB) dei principali target core sono stati recuperati dal database di annotazione delle proteine17, e le loro strutture cristalline tridimensionali sono state scaricate dal RCSB PDB (consultato febbraio 2026). Per ogni proteina bersaglio, la Catena A è stata mantenuta come struttura del recettore, mentre catene proteiche ridondanti, eteroatomi e frammenti strutturali non correlati sono stati rimossi durante la preparazione del recettore. Le strutture tridimensionali dei composti attivi principali sono state recuperate dal database PubChem (consultato febbraio 2026). In questo studio, la quercetina è stata selezionata come ligando di attracco rappresentativo perché ha mostrato la più alta centralità topologica nella rete componente–bersaglio ed è un flavonoide ben caratterizzato con effetti protettivi riportati contro la patogenesi dell'OA.

La pre-elaborazione di recettori e liganti è stata eseguita utilizzando software di preparazione per l'aggancio molecolare, inclusa la rimozione di molecole d'acqua, l'aggiunta di atomi di idrogeno, il trattamento con protonazione e l'assegnazione della carica di Gasteiger. L'analisi del docking molecolare è stata successivamente condotta utilizzando il software di docking molecolare versione 1.5.7. Le dimensioni delle scatole della griglia sono state regolate per comprendere le regioni di legame previste di ciascuna proteina bersaglio. La scatola della griglia era centrata sulla tasca nativa di legame dei liganti di ciascuna proteina bersaglio, con una dimensione uniforme di 40 Å × 40 Å × 40 Å e una distanza di 0,375 Å. I calcoli di attracco sono stati eseguiti con un parametro di esaustività di 8, e sono state generate nove conformazioni di legame candidate per ciascuna coppia ligando–bersaglio. La conformazione di attracco con l'energia di legame prevista più bassa è stata selezionata come posa rappresentativa per l'interpretazione strutturale successiva. In questo studio non sono state effettuate validazioni del reaccoppaggio e confronto con i ligandi di controllo positivo. Tutte le procedure di attracco e le impostazioni dei parametri seguivano protocolli standard comunemente adottati nella ricerca in farmacologia di rete per supportare l'affidabilità delle modalità di legame previste. Le conformazioni di docking sono state visualizzate utilizzando il software di visualizzazione molecolare versione 2.5.4. Un'energia di legame di ≤−5,0 kcal/mol è stata considerata indicativa di un legame stabile tra ligando e recettore.

Risultati

Composizione chimica e screening bersaglio del TBF
Dopo lo screening sono stati identificati in totale 2 componenti attivi da Danggui, 65 da Danshen, 24 da Jixueteng, 21 da Haifengteng, 6 da Tougucao, 9 da Duhuo, 7 da Weilingxian e 18 da Xiangfu. Informazioni dettagliate sui composti attivi sottoposti alla selezione sono fornite nella Tabella Supplementare 1. Inizialmente furono recuperati in totale 2672 potenziali obiettivi, tra cui 266 per Danggui, 689 per Danshen, 236 per Duhuo, 188 per Haifengteng, 545 per Jixueteng, 192 per Tougucao, 102 per Weilingxian e 454 per Xiangfu. Informazioni dettagliate sui bersagli sono presentate nella Tabella Supplementare 2. Dopo la rimozione delle voci duplicate, sono stati ottenuti 258 obiettivi non ridondanti associati al TBF.

La rete TBF–Componente–Target
La rete TBF–Component–Target è stata costruita utilizzando dati recuperati dal database farmacologico della TCM, inclusi 152 composti attivi, 258 bersagli non ridondanti e 8 nodi di medicina erboristica. Questi dati erano organizzati in due file, designati come "rete" e "Tipo" (Tabella Supplementare 3). Dopo aver importato i file nel software di visualizzazione e analisi della rete, è stata stabilita una rete completa contenente 578 nodi e 3022 archi (Figura 2). Nella rete costruita, i nodi rappresentavano medicine erboristiche, composti bioattivi e corrispondenti proteine bersaglio, mentre i bordi rappresentavano le interazioni previste tra composti e bersagli. Dimensioni maggiori dei nodi e intensità di colore più scura indicavano valori di grado più elevati e maggiore connettività di rete. Sulla base della classifica dei gradi ottenuta dall'analisi topologica delle reti, i primi cinque composti attivi sono stati identificati come quercetina (A7-MOL000098), beta-sitosterolo (B8-MOL000358), luteolina (A1-MOL000006), kaempferolo (C1-MOL000422) e stigmasterolo (C2-MOL000449).

Figura 2. TBF–Rete di interazione Componente–Target. Visualizzazione in rete delle interazioni tra TBF, composti attivi e geni target previsti. I nodi rappresentano medicine erboristiche, composti attivi o proteine bersaglio, mentre i bordi rappresentano interazioni previste tra composti e bersagli. Dimensioni maggiori dei nodi e intensità del colore più scura indicano valori di grado più elevati e maggiore connettività di rete. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Informazioni sui target relative all'OA e potenziali obiettivi terapeutici della TBF
La parola chiave "Osteoartrite" è stata ricercata in quattro database, ottenendo 428 potenziali target correlati alla malattia, inclusi 9 da OMIM, 349 da GeneCards, 32 da DrugBank e 38 da TTD. Un diagramma di Venn che illustra la distribuzione target tra i quattro database è presentato nella Figura 3. Dopo la fusione e la rimozione delle voci duplicate, sono stati ottenuti 398 obiettivi unici correlati all'OA. L'analisi delle intersezioni tra bersagli correlati all'OA e bersagli legati al composto attivo TBF ha identificato 47 bersagli sovrapposti, considerati potenziali bersagli terapeutici della TBF contro l'OA. Il corrispondente diagramma di Venn generato utilizzando lo strumento online di analisi di Venn è mostrato nella Figura 4.

Figura 3. Diagramma di Venn dei target correlati all'OA recuperati da più database. Diagramma di Venn che mostra la sovrapposizione tra i target correlati all'OA identificati dai database OMIM, GeneCards, DrugBank e Therapeutic Target Database (TTD). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Identificazione di obiettivi sovrapposti tra TBF e OA. Diagramma di Venn che mostra l'intersezione tra bersagli attivi legati a composti TBF e bersagli correlati all'OA. I bersagli sovrapposti sono stati considerati potenziali bersagli terapeutici della TBF contro l'OA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Costruzione e analisi della rete PPI
L'analisi della rete PPI dei 47 obiettivi sovrapposti è stata effettuata utilizzando il database PPI (Figura 5) e successivamente visualizzata tramite software di visualizzazione e analisi della rete. Durante la costruzione della rete, i nodi disconnessi che rappresentavano bersagli isolati senza interazioni proteina–proteina (PPI) sono stati rimossi secondo le procedure standard di topologia della rete, risultando in una rete raffinata contenente 39 nodi e 108 spigoli (Figura 6). La dimensione del nodo e l'intensità del colore riflettevano i valori di grado, indicando l'importanza relativa dei target all'interno della rete.

Figura 5. STRING Rete PPI di bersagli sovrapposti. Rete PPI generata utilizzando il database STRING per i target sovrapposti tra TBF e OA. I nodi rappresentano proteine target e gli edge rappresentano i PPI previsti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6. Analisi della rete principale PPI. Rete PPI affinata dopo la rimozione dei nodi scollegati. La dimensione del nodo e l'intensità del colore rappresentano i valori di grado e indicano l'importanza relativa dei target all'interno della rete. I target principali tra cui JUN, RELA, IL6, MAPK1 e IL10 hanno dimostrato un'elevata connettività di rete. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

L'analisi topologica della rete PPI è stata condotta utilizzando il plugin di analisi topologica della rete con l'algoritmo Degree per calcolare le caratteristiche topologiche dei nodi. I primi 10 obiettivi classificati per valore di grado sono presentati nella Tabella 1. I cinque bersagli con il punteggio più alto, inclusi JUN, RELA, IL6, MAPK1 e IL10, sono stati selezionati come bersagli principali per l'analisi successiva dell'aggancio molecolare basata sul valore del grado, la centralità della vicinanza e la centralità tra le mezze.

Analisi della funzione biologica GO e del percorso KEGG della TBF nell'OA
L'analisi di arricchimento GO ha identificato diverse funzioni biologiche correlate all'OA, tra cui l'attività delle citochine, il legame dei fattori di trascrizione e l'attività dei fattori di crescita, suggerendo il potenziale coinvolgimento della TBF nella regolazione dell'infiammazione, dell'attività trascrizionale e dell'omeostasi della cartilagine. I primi 20 termini GO arricchiti sono stati classificati in base ai valori di conteggio e visualizzati utilizzando un grafico a barre (Figura 7). L'analisi dell'arricchimento delle vie KEGG si è concentrata sulle vie di segnalazione correlate all'OA, inclusi i prodotti finali di glicazione avanzati – la via di segnalazione dei prodotti finali avanzati del recettore per i prodotti finali di glicazione avanzati, la via di segnalazione dell'interleucina-17 (IL-17), la via di segnalazione del fattore di necrosi tumorale (TNF) e la via di segnalazione dei recettori delle cellule T, associate alla regolazione infiammatoria, al catabolismo dei condrociti e alle risposte immunitarie nell'OA. Le vie correlate alle malattie infettive identificate durante l'analisi di arricchimento non sono state interpretate come meccanismi diretti dell'artrosi nel presente studio. L'analisi dei percorsi KEGG è stata eseguita utilizzando il software di analisi statistica per generare una visualizzazione del bubble plot (Figura 8). Sono stati identificati in totale 20 vie di segnalazione significativamente arricchite. Questi risultati suggeriscono che la TBF potrebbe regolare i processi biologici correlati all'OA e le vie di segnalazione attraverso un meccanismo farmacologico multitarget.

Figura 7. Analisi di arricchimento GO di potenziali bersagli terapeutici. Grafico a barre che mostra i primi 20 termini GO arricchiti associati ai potenziali obiettivi terapeutici della TBF contro l'OA. I termini arricchiti includono processi biologici, funzioni molecolari e componenti cellulari correlati all'infiammazione, alla regolazione trascrizionale e all'omeostasi della cartilagine. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8. Analisi dell'arricchimento delle vie KEGG di potenziali bersagli terapeutici. Visualizzazione del bubble plot delle vie di segnalazione KEGG arricchite al massimo associate ai potenziali bersagli terapeutici della TBF contro l'OA. La dimensione della bolla rappresenta il numero di geni arricchiti, mentre l'intensità del colore riflette il livello di significato dell'arricchimento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Verifica dell'Attracco Molecolare
Per approfondire le potenziali interazioni di legame tra il composto attivo principale del TBF e i target core identificati dalla rete PPI, è stata effettuata un'analisi di docking molecolare tra la quercetina, il composto attivo di maggior rango nella rete componente–bersaglio, e i cinque target principali JUN, RELA, IL6, MAPK1 e IL10 (Tabella 2). La quercetina ha dimostrato la massima importanza topologica nella rete componente-bersaglio ed è stata ampiamente riportata come composto bioattivo rappresentativo associato all'attività antinfiammatoria e alla regolazione del metabolismo della^{cartilagine 18,19}. Le energie di legame previste erano −8,4 kcal/mol per JUN, −7,6 kcal/mol per RELA, −6,9 kcal/mol per IL6 e −6,7 kcal/mol sia per MAPK1 che per IL10, indicando affinità di legame favorevoli tra quercetina e i target centrali selezionati. La visualizzazione delle conformazioni di legame ligando–recettore facilitava l'interpretazione delle potenziali interazioni molecolari. Il software di visualizzazione molecolare versione 2.5.4 è stato utilizzato per visualizzare le conformazioni ottimali di attracco tra la quercetina e i cinque target principali (Figura 9–13).

Figura 9. Modello di aggancio molecolare della quercetina con JUN (PDB ID: 1JNM). Conformazione molecolare tridimensionale di aggancio della quercetina legata a JUN. Si prevedeva che la quercetina si legasse all'interno del dominio bZIP di JUN e si adattasse alla cavità di legame idrofobica con complementarità strutturale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 10. Modello di aggancio molecolare della quercetina con RELA (PDB ID: 7LEU). Conformazione di aggancio molecolare tridimensionale della quercetina legata a RELA. Si prevedeva che la quercetina interagisse con la regione attiva del dominio di omologia di Rel RELA tramite interazioni non covalenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 11. Modello di aggancio molecolare della quercetina con IL6 (ID PDB: 1ALU). Conformazione molecolare tridimensionale di quercetina legata a IL6. Si prevedeva che la quercetina occupasse il solco conservato di legame dei recettori di IL6. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 12. Modello di docking molecolare della quercetina con MAPK1 (ID PDB: 6D5Y). Conformazione molecolare tridimensionale di accoccaggio della quercetina legata a MAPK1. Si prevedeva che la quercetina occupasse la tasca di legame ATP di MAPK1, suggerendo potenziali interazioni correlate alla chinasi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 13. Modello di aggancio molecolare della quercetina con IL10 (ID PDB: 1ILK). Conformazione molecolare tridimensionale di attracco della quercetina legata a IL10. Si prevedeva che la quercetina interagisse vicino alla regione di interfaccia dimera di IL10 e potesse contribuire alla stabilizzazione del complesso proteico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Disponibilità dei dati:
Tutti i dati a supporto dei risultati di questo studio sono inclusi nel manoscritto, nelle tabelle, nelle figure e nei materiali supplementari. La Tabella Supplementare 1 contiene i composti attivi selezionati della Formula TongBi (TBF), la Tabella Supplementare 2 fornisce le corrispondenti informazioni predetti sui bersagli, e la Tabella Supplementare 3 contiene i dati di codifica e interazione della rete utilizzati per la costruzione della rete e l'analisi topologica.

Gene	Nome della proteina	Titolo	Centralità della Vicinanza	Centralità di intermedietà
GIUGNO	Fattore di trascrizione AP-1	18	0.58	0.22
RELA	Fattore di trascrizione p65	15	0.56	0.15
IL6	Interleukin 6	14	0.59	0.33
MAPK1	Proteina chinasi 1 attivata dal mitogeno	13	0.54	0.16
IL10	Interleukin 10	10	0.47	0.12
ESR1	Recettore degli estrogeni	10	0.44	0.03
IL2	Interleucina 2	9	0.53	0.05
AKT1	RAC-alfa serina/treonina-proteina chinasi	9	0.44	0.04
MMP1	Metallopeptidasi matriciale 1	8	0.44	0.03
MMP2	Metallopeptidasi matriciale 2	8	0.44	0.03

Tabella 1: Parametri topologici dei core target nella rete PPI. Parametri topologici dei principali target identificati nell'analisi della rete PPI. Grado, centralità di vicinanza e centralità tra i nodi sono stati calcolati per valutare l'importanza dei nodi e identificare i bersagli terapeutici principali associati alla TBF contro l'OA. I target con valori di grado e centralità più elevati erano considerati più importanti all'interno della rete di interazione.

Bersaglio	PDB ID	Coordinate del sito attivo (X, Y, Z)	Ligando	Affinità di Lego (kcal/mol)
GIUGNO	1JNM	X = 10,201; Y = 0,493; Z = 19,492	Quercetina	−8.4
RELA	7LEU	X = 1,717; Y = 23.889; Z = −0,778		−7.6
IL6	1ALU	X = 2,599; Y = −20,016; Z = 8,749		−6.9
MAPK1	6D5Y	X = 7,052; Y = 12.800; Z = 20.749		−6,7
IL10	1ILK	X = 17.836; Y = 46.443; Z = 38.685		−6,7

Tabella 2: Parametri di aggancio molecolare e affinità di legame tra quercetina e proteine target centrali. Risulta un aggancio molecolare tra la quercetina e le proteine target centrali selezionate JUN, RELA, IL6, MAPK1 e IL10. La tabella presenta gli identificatori della Protein Data Bank (PDB), le coordinate del centro della griglia del sito attivo utilizzate per i calcoli di attracco e i valori previsti di affinità di legame ottenuti dall'analisi dell'aggancio molecolare. Valori di energia di legame più bassi indicano un'affinità di legame ligando–recettore più forte prevista.

Tabella supplementare 1: Composti attivi identificati da TBF. Informazioni dettagliate sui composti attivi selezionati da TBF, inclusi nomi di composti, identificatori molecolari, valori OB, valori DL e corrispondenti fonti erboristiche. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 2: Bersagli previsti corrispondenti ai composti attivi di TBF. Elenco completo dei bersagli proteici previsti corrispondenti ai composti attivi selezionati di TBF, inclusi simboli genici umani standardizzati ottenuti dopo la normalizzazione e la deduplicazione del bersaglio. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 3: Informazioni sulla codifica di rete per la rete TBF–Component–Target. Informazioni dettagliate di codifica utilizzate per la costruzione della rete di interazione componente–bersaglio TBF, inclusi identificatori molecolari, informazioni sui bersaglio, relazioni di rete e dati di classificazione dei nodi utilizzati per l'analisi topologica della rete. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Questo studio ha utilizzato approcci di farmacologia di rete e aggancio molecolare per indagare i potenziali meccanismi della TBF contro l'OA. Le medicine erboristiche principali analizzate includevano Danggui, Danshen, Jixueteng, Haifengteng, Tougucao, Duhuo, Weilingxian e Xiangfu. Studi precedenti hanno dimostrato che Danggui (Angelica sinensis Radix) può alleviare i cambiamenti patologici correlati all'OA, inclusa degenerazione cartilagine, sclerosi ossea sottocondrale, andatura anomala e gonfiore del ginocchio nella destabilizzazione dei modelli del menisco^{mediale 20}. Nei modelli di cellule OA indotte da IL-1β, Danggui ha ridotto l'accumulo di specie reattive di ossigeno e aumentato l'attività degli enzimi antiossidanti, tra cui superossido dismutasi e^{glutatione 21}. Danshenindione IIA, un costituente attivo di Salvia miltiorrhiza, è stato segnalato come responsabile dell'alleviamento della degenerazione cartilagine, ripristino dell'omeostasi del rimodellamento osseo subcondrale e soppressione dell'angiogenesi anomala nei modelli murini^{OA 22}. Inoltre, componenti derivati da S. miltiorrhiza possono regolare lo stress ossidativo e il metabolismo^{osseo 23,24}. Spatholobus suberectus È stato riportato che Dunn regola le vie di segnalazione PI3K/Akt/mTOR e Ras/Raf/^{MAPK 25}, associate al metabolismo della cartilagine e alla progressione dell'OA. Gli estratti di S. suberectus Dunn inibiscono anche la produzione di chemiocine^{pro-infiammatorie 26}. Inoltre, le attività antinfiammatorie e antiossidanti riportate per Impatiens balsamina possono essere rilevanti per la patogenesi dell'OA poiché l'infiammazione cronica e lo stress ossidativo contribuiscono alla degenerazione^{della cartilagine 27}. Radix Angelicae Biseratae è stata inoltre associata a un miglioramento della circolazione sanguigna e all'alleviamento dei sintomi legati^{all'artrite 28,29}. Studi limitati hanno indagato i potenziali effetti terapeutici di Jixueteng (Spatholobus suberectus Dunn), Haifengteng (Caulis Piperis Kadsurae) e Xiangfu (Cyperi Rhizoma) nell'OA.

La previsione computazionale basata sulla rete PPI suggeriva che la TBF potesse esercitare effetti terapeutici contro l'OA attraverso la regolazione delle risposte infiammatorie e la protezione della cartilagine articolare, anche se queste previsioni richiedono ulteriori validazioni sperimentali. I target core con valori di grado relativamente elevati nella rete PPI includevano JUN, RELA, IL6, MAPK1 e IL10. Studi precedenti hanno dimostrato che JUN è associato all'invecchiamento dei condrociti e alla progressione dell'OA. I topi doppi mutanti JunB/Jun presentano infiltrazione infiammatoria nei tessuti articolari accompagnata da distruzione ossea e^{periostite 30}. Le analisi trascrivomiche della cartilagine osteoartritica e della sinovia hanno inoltre mostrato una riduzione dell'espressione^{JUN 31}. Inoltre, è stata osservata una diminuzione dell'espressione proteica JUN nei modelli di OA indotti dalla transezione del legamento crociato anteriore e nei condrociti^{senescenti 32}. Studi precedenti hanno inoltre suggerito che la segnalazione correlata al JUN potrebbe regolare la degenerazione della cartilagine, l'apoptosi, l'autofagia e il metabolismo della matrice extracellulare nei condrociti^{OA 33}. Studi precedenti hanno anche dimostrato che i frammenti derivati da RNA di trasferimento regolano la proliferazione e la sopravvivenza dei condrociti articolari attraverso le vie di segnalazione associate a^{RELA 34}. Inoltre, la regolazione all'alza del gene Sox9 combinata con l'inibizione dell'espressione di RELA nelle cellule stromali mesenchimali ha aumentato le capacità condrogeniche e immunomodulatrici e rallentato la progressione dell'OA nei modelli^{sperimentali 35}. Questi risultati supportano la potenziale rilevanza dei percorsi di segnalazione correlati a JUN e RELA identificati nella presente analisi computazionale.

IL6 è un mediatore infiammatorio chiave nell'OA e svolge un ruolo importante nel metabolismo della cartilagine influenzando sia i processi di degrado che di riparazione. In condizioni infiammatorie croniche di basso grado, livelli elevati di IL6 contribuiscono alla senescenza dei condrociti, alla riduzione della sintesi della matrice cartilaginea e alla rottura^{dell'omeostasi della cartilagine 36}. Studi precedenti hanno dimostrato che la segnalazione del recettore IL6/JAK2 partecipa alla regolazione dell'apoptosi cellulare senescenti, e la rimozione mirata delle cellule senescenti può attenuare la progressione^{dell'OA 37}. Inoltre, Li Q e colleghi hanno riferito che la regolazione all'alza di miR-186-5p regolava le risposte infiammatorie nei condrociti stimolati da IL-1β, mentre l'inibizione di miR-186-5p alleviava la progressione dell'OA tramite l'aumento dell'espressione di^{MAPK1 38}. Questi risultati supportano il potenziale coinvolgimento delle vie di segnalazione correlate a IL6 e MAPK1 identificate nella presente analisi computazionale.

IL10 svolge un ruolo protettivo nell'omeostasi della cartilagine e può contribuire al mantenimento del microambiente cartilagineare. Studi precedenti hanno dimostrato che IL10 inibisce l'apoptosi dei condrociti attraverso la regolazione delle vie apoptotiche mitocondriali, la riduzione dell'attività delle caspase e la modulazione del rapporto Bax/^{Bcl-2 39}. Inoltre, IL10 è stata associata a una riduzione della degradazione della matrice extracellulare e a una diminuzione dell'espressione di fattori correlati alla degradazione della matrice, inclusi MMP3, MMP13, ADAMTS4 e la sintasi indotta di ossido nitrico, nei modelli⁴⁰ di cartilagine articolare compressa. L'analisi di arricchimento delle vie KEGG nel presente studio ha suggerito che le vie di segnalazione IL-17, TNF e fattore ipossia-indottibile 1 (HIF-1) potrebbero essere associate agli effetti terapeutici previsti della TBF contro l'OA, sebbene queste previsioni computazionali richiedano conferma sperimentale. Studi precedenti hanno dimostrato che l'IL-17 contribuisce alla progressione dell'OA attraverso la regolazione delle risposte infiammatorie e dell'attività delle cellule^{sinoviali 41,42}. L'aumento dell'espressione di IL-17 è stato inoltre positivamente correlato con la gravità della malattia^{nell'OA 43} del ginocchio. Il TNF-α è un altro importante mediatore infiammatorio associato all'infiammazione, dolore e degenerazione cartilaginea correlate all'OA, e l'inibizione della segnalazione del TNF-α può alleviare la progressione della^{malattia 44}. Inoltre, HIF-1α svolge un ruolo importante nel metabolismo ipossico dei condrociti, nella regolazione della matrice extracellulare, nell'infiammazione sinoviale e nel rimodellamento dell'osso sottocondrale^{nell'OA 45}. Studi precedenti hanno anche suggerito che l'inibizione della segnalazione correlata a HIF-1α possa proteggere la funzione dei condrociti e ridurre la degenerazione^{cartilaginea 46}. Questi risultati sono coerenti con i percorsi di segnalazione identificati dalla presente analisi di arricchimento computazionale.

Questo studio in silico presenta diverse limitazioni importanti. Innanzitutto, l'analisi si è basata su database pubblici disponibili, che possono contenere informazioni incomplete o di parte riguardo a composti erboristici e annotazioni target. Inoltre, i metodi computazionali di predizione dei bersagli comportano un'incertezza intrinseca e le interazioni previste identificate in questo studio richiedono una verifica sperimentale. L'analisi del docking molecolare riflette un potenziale di legame teorico piuttosto che un'attività fisiologica o farmacologica diretta. Inoltre, non sono stati condotti esperimenti in vitro o in vivo per convalidare le previsioni computazionali. Non sono stati valutati anche fattori come il dosaggio delle erbe, la farmacocinetica e la biodisponibilità complessiva della formula combinata. Pertanto, tutte le conclusioni derivate dal presente studio dovrebbero essere considerate predittive e richiedere ulteriori conferme sperimentali.

Il presente studio, basato su analisi di farmacologia di rete e docking molecolare, fornisce un quadro predittivo per indagare i potenziali meccanismi della TBF contro l'OA. I risultati suggeriscono che la TBF potrebbe regolare molteplici bersagli correlati all'OA attraverso interazioni tra composti attivi derivati dalle sue otto erbe costituenti. I bersagli identificati erano arricchiti da processi biologici e vie di segnalazione associate alla regolazione infiammatoria, al metabolismo lipidico e alla segnalazione correlata all'ipossia, inclusi i percorsi IL-17, TNF e HIF-1. L'analisi dell'aggancio molecolare ha ulteriormente dimostrato affinità di legame favorevoli tra la quercetina e i bersagli principali JUN, RELA, IL6, MAPK1 e IL10. Collettivamente, questi risultati suggeriscono che la TBF possa esercitare effetti regolatori multi-componente e multi-bersaglio contro l'OA. Questo studio fornisce anche una strategia teorica e un quadro metodologico per futuri studi meccanicistici e la validazione sperimentale delle formule della MTC nella ricerca sull'OA.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
AutoDockTools	Software	Versione 1.5.7; The Scripps Research Institute	https://autodock.scripps.edu/
AutoDock Vina	Software	Versione 1.5.7; The Scripps Research Institute	https://autodock.scripps.edu/
funzione barplot	Funzione di visualizzazione R	pacchetto clusterProfiler	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/
clusterProfiler	Pacchetto R	Pacchetto Bioconductor per l'analisi di arricchimento	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/
CytoHubba	Plugin	Compatibile con Cytoscape 3.10.2	https://apps.cytoscape.org/apps/cytohubba
Cytoscape	Software	Versione 3.10.2; Cytoscape Consortium	https://cytoscape.org/
DAVID	Database	Database per l'annotazione, la visualizzazione e la scoperta integrata	https://david.ncifcrf.gov/
funzione dotplot	Funzione di visualizzazione R	pacchetto clusterProfiler	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/
DrugBank	Database	Università dell'Alberta	https://go.drugbank.com/
GeneCards	Database	Suite GeneCards	https://www.genecards.org/
MicrobiomeAnalyst / MicrobiomeNet	Piattaforma online	Piattaforma di visualizzazione di arricchimento online	https://microbiomenet.com/
OMIM	Database	Online Mendelian Inheritance in Man	https://www.omim.org/
PDB	Database	RCSB Protein Data Bank	https://www.rcsb.org/
PubChem	Database	National Center for Biotechnology Information	https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/
PyMOL	Software	Versione 2.5.4	https://pymol.org/
R	Software	Versione 4.3.1; R Foundation for Statistical Computing	https://www.r-project.org/
STRING	Database	Strumento di ricerca per il recupero di geni/proteine interagenti	https://cn.string-db.org/
TCMSP	Database	Database di farmacologia dei sistemi di medicina tradizionale cinese e piattaforma di analisi	http://tcmspw.com/tcmsp.php
TTD	Database	Database di bersagli terapeutici	https://db.idrblab.net/ttd/
UniProt	Database	Risorsa universale per le proteine	https://www.uniprot.org/
Venny	Software	Versione 2.1.0	https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html