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Articolo metodologico

Fenotipizzazione in vivo della neurodegenerazione dopaminergica nelle larve di pesce zebra tramite analisi comportamentale e imaging ad alto contenuto

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DOI:

10.3791/71516

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16 giugno 2026

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1Department of Clinical Pharmacy Practice, UC Irvine School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 2Robert A. Mah Molecular Innovation Center, University of California Irvine

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo fornisce un metodo standardizzato e ad alto rendimento di screening dei composti utilizzando pesci zebra in vivo per quantificare la perdita di neuroni dopaminergici e i deficit comportamentali locomotori, consentendo uno screening efficiente dei composti neuroprotettivi.

Abstract

La ricerca sulla scoperta di farmaci nella neurodegenerazione è limitata dall'alto costo e dal basso flusso dei modelli tradizionali di mammiferi. Questo collo di bottiglia è particolarmente osservato nella ricerca sulla malattia di Parkinson, dove studi rigorosi e scalabili sulla neurodegenerazione dopaminergica (DA) rimangono lenti e richiedono molte risorse. Per colmare questa lacuna, presentiamo una pipeline di fenotipizzazione standardizzata ad alto rendimento utilizzando un modello transgenico di pesce zebra che esprime nitroreduttasi nei neuroni DA per studiare la perdita dei neuroni DA entro cinque giorni dopo la fecondazione. I pesci zebra offrono vantaggi chiave per le neuroscienze traslazionali, tra cui lo sviluppo rapido delle larche, trasparenza ottica che consente l'imaging in vivo dell'intero cervello, una forte conservazione dei geni e delle vie rilevanti per la malattia di Parkinson e circuiti neurali integri non accessibili nei modelli di coltura cellulare. Il nostro protocollo integra ablazione chemogenetica e imaging ad alto contenuto per generare dataset rapidi da screening. I neuroni DA vengono ablati selettivamente tramite metronidazolo (MTZ), che producono neurodegenerazione specifica e sintonizzabile. Il trattamento MTZ produce riduzioni della locomozione dipendenti dalla dose, compatibili con fenotipi simili a quelli della bradicinesia, fornendo un correlato comportamentale robusto alla perdita delle cellule DA. Poiché il morbo di Parkinson è fondamentalmente un disturbo motorio, associamo le misurazioni anatomiche ai dati comportamentali funzionali. L'attività locomotoria viene registrata direttamente in una lastra e quantificata tramite tracciamento automatizzato, estraendo metriche tra cui la distanza totale percorsa, la frequenza di nuoto e l'inizio del burst. I pesci zebra forniscono un sistema modello efficiente e scalabile in cui centinaia di larve possono essere analizzate simultaneamente con una gestione minima. Abbiamo ottimizzato un protocollo di screening farmacologico ad alto rendimento basato su placche, progettato per minimizzare la variazione sperimentale nella ricerca universitaria. Questo formato standardizzato, basato su placche, per lo screening dei candidati composti per la neuroprotezione o il salvataggio funzionale garantisce che i dati raccolti da diversi ricercatori rimangano statisticamente comparabili ed efficaci per identificare candidati neuroprotettivi, migliorando la riproducibilità. Insieme, questa metodologia fornisce un quadro solido e scalabile per la ricerca sulla neurodegenerazione.

Introduzione

La ricerca sulla scoperta di farmaci nella neurodegenerazione affronta un significativo collo di bottiglia di efficienza a causa dell'elevato costo e della bassa capacità di produzione dei modelli tradizionali dimammiferi 1,2, richiedendo un'attenta pianificazione sperimentale e l'impiego di una vasta forza lavoro. L'obiettivo generale di questo metodo è fornire un approccio standardizzato ad alto rendimento utilizzando il Tg(th:Gal4; UAS:NTR-mCherry) in cui la nitroreduttasi-mCherry è specificamente espressa nei neuroni dopaminergici (DA) per studiare la perdita e i deficit di locomozione dei neuroni DA. La motivazione dietro l'uso di questa tecnica deriva dalla necessità di modelli in vivo rigorosi, scalabili ed economicamente validi per la ricerca sulla neurodegenerazione 3,4,5. Sebbene le colture cellulari in vitro permettano uno screening rapido dei farmaci, mancano del circuito neurale intatto e del contesto dell'organismo intero essenziali per la rilevanzatraslazionale 6. Al contrario, i modelli di roditori forniscono un eccellente contesto fisiologico ma sono costosi e richiedono molto tempo per lo screening iniziale ad alta produttività di compostineuroprotettivi 7,8.

I pesci zebra possiedono uno sviluppo larvale rapido, trasparenza ottica che consente l'imaging in vivo dell'intero cervello e una forte conservazione genetica delle vie rilevanti per la malattia, in particolare legate alla neurodegenerazione 9,10,11. Il protocollo integra specificamente la gestione standardizzata, l'ablazione chemogenetica tramite metronidazolo (MTZ) e immagini ad alto contenuto abbinate al tracciamento comportamentale funzionale. La misurazione diretta dell'attività locomotoria fornisce un correlato comportamentale robusto alla perdita neuronale DA, poiché la perdita del neurone dopaminergico è legata ad anomaliecomportamentali 12,13,14. Il formato standardizzato basato su placche minimizza la varianza sperimentale tra operatori e l'elevata capacità del sistema larvale del pesce zebra consente campioni di grandi dimensioni, fornendo insieme una potenza statistica sufficiente per rilevare effetti neuroprotettivi. Questo rende il protocollo particolarmente adatto ad applicazioni che richiedono screening scalabile e riproducibile, inclusi contesti in cui l'esperienza dell'investigatore può variare.

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Protocollo

Tutti i metodi che hanno riguardato l'uso di soggetti vertebrati sono stati eseguiti in conformità con le linee guida del Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali Istituzionali (approvazione IACUC AUP-25-098).

1. Allevamento dei pesci zebra

  1. Mantenere le condizioni del sistema acquatico
    1. Mantenere il sistema acquatico a ricircolo a 28,5°C (intervallo accettabile: 26°C–30°C), pH 7,1–7,8 e conducibilità 600–700 μS/cm. Mantieni i pesci zebra adulti a una densità di popolazione di circa 5 pesci/L nelle vasche domestiche.
    2. Monitora quotidianamente i livelli di ammoniaca, nitriti e nitrati utilizzando un kit colorimetrico per il test della qualità dell'acqua per acquari secondo le istruzioni del produttore. Mantieni ammoniaca e nitriti a 0 ppm e nitrato tra 10 e 20 ppm.
    3. Eseguire scambi d'acqua quando ammoniaca o nitriti superano 0 ppm, i nitrato superano i 20 ppm, sono presenti torbidità o detriti visibili, o i valori di pH/conducibilità sono fuori dagli intervalli target descritti nel Passo 1.1.1. Continuare gli scambi finché ammoniaca e nitriti non tornano a 0 ppm, il nitrato ritorna a 10–20 ppm e i valori di pH/conducibilità vengono ripristinati nell'intervallo target.
    4. Mantieni un ciclo di 14 ore luce per 10 ore buie per sincronizzare ritmo circadiano e riproduzione.
  2. Nutrire i pesci zebra in diversi stadi di sviluppo
    1. Nutrire i pesci adulti con pellet a sprofondamento lento da 0,5 mm due volte al giorno. Standardizzare l'alimentazione in base al tempo di consumo e fornire solo la quantità consumata entro 3–5 minuti. Usa la stessa dimensione di pellet e tipo di dieta in modo coerente tra le coorti sperimentali.
    2. Nutrire le larve di pesci Gemma Micro 75 ZF, o una dieta equivalente di pesce zebra larvale con una dimensione particellare di circa 75 μm, tre volte al giorno. Nutrire i pesci giovani (1 mese) con Gemma Micro 150 ZF, o una dieta equivalente di pesce zebra con una dimensione particellare di circa 150 μm, tre volte al giorno.
    3. Sostituire diete equivalenti solo se sono formulate per larve o giovani zebra, forniscono una dimensione delle particelle comparabile e forniscono un alimento ricco di proteine e ricco di nutrienti, adatto allo stadio di sviluppo.
    4. Integrare le diete larve e giovanili con naupli di gamberetti vivi appena schiusi una volta al giorno a mezzogiorno nei giorni feriali. Schiudere le cisti di gamberi in salamoia in acqua salata aerata per 24–36 ore secondo le istruzioni del produttore.
    5. Raccogli nauplii che nuotano attivamente, sciacquali con acqua di sistema e nutri solo la quantità consumata entro 5–10 minuti.
    6. Evita di nutrire troppo, poiché un eccesso di mangime aumenta i livelli di ammoniaca.
      NOTA: Rimuovere ogni giorno il cibo non mangiato e i detriti visibili con un sifonamento delicato. Ispezionare le vasche per pesci morti o malsani e pulire le superfici o i filtri quando si osservano accumuli di detriti. Mantenere costantemente la densità delle vasche, l'alimentazione, la pulizia e il monitoraggio della qualità dell'acqua tra le coorti sperimentali. Per ulteriori dettagli sull'allevamento dei pesci zebra, lo stadio di sviluppo, l'allevamento dei gamberi in salamoia e la manutenzione a lungo termine delle strutture, si riferisce a Westerfield15 e Avdesh et al.16.

2. Raccolta embrionale, preparazione dei reagenti e screening transgenico

  1. Organizza incroci di riproduzione
    1. Assemblare i serbatoi di incrocio con un divisore la sera prima della raccolta degli embrioni.
    2. Posizionare un maschio e due femmine di pesce zebra in ogni vasca di attraversamento, con maschi e femmine separati dal divisore durante la notte.
    3. Rimuovere il divisore la mattina seguente all'inizio del ciclo di luce e permettere la riproduzione per un periodo fisso di 2 ore. Raccogliere gli embrioni immediatamente dopo la finestra di deposizione per minimizzare la variabilità dello stadio di sviluppo.
  2. Raccogliere e incubare embrioni
    1. Raccogli gli embrioni versando acqua del serbatoio attraverso un filtro a rete da 400 μm. Risciacquare delicatamente gli embrioni con acqua di sistema o acqua blu di uovo (BEW) per rimuovere i detriti, poi trasferire gli embrioni in piastre di Petri da 100 mm utilizzando una pipetta di trasferimento usa e getta. Minimizza la manipolazione ed evita di esporre gli embrioni all'aria per lunghi periodi.
    2. Trasferire gli embrioni in piastre di Petri da 100 mm contenenti 30 mL di BEW a una densità di 50–60 embrioni per piattaforma. Non superare i 60 embrioni per piatto per mantenere uno sviluppo costante e una disponibilità di ossigeno.
    3. Incubare embrioni a 28,5°C in un ciclo di luce e 10 ore di 14 ore.
    4. Rimuovi quotidianamente le uova non fecondate e gli embrioni non vitali.
      NOTA: Prepara BEW usando 60 mg di sale marino oceanico istantaneo, 50 μL di blu di metilene all'1% e 1 L di acquadeionizzata 17.
  3. Preparare e applicare la soluzione di 1-fenil-2-tiourea (PTU)
    1. Prepara una soluzione PTU da 100 mM in dimetilsolfosida (DMSO).
    2. Conserva la soluzione di base PTU a 4°C protetta dalla luce.
    3. A 24–36 ore dopo la femcondazione (hpf), si aggiungono 60 μL di soluzione di stock PTU a ciascuna piastra contenente 30 mL di BEW per ottenere una concentrazione finale di 200 μM.
    4. Mescola PTU facendo roteare delicatamente la piastra di Petri in un movimento circolare 5–10 volte. Evita di pipettare direttamente sugli embrioni per minimizzare lo stress meccanico.
      ATTENZIONE: La PTU può causare irritazioni respiratorie e cutanee. Maneggia con i guanti e fai la preparazione in un'area ben ventilata.
  4. Prepara l'anestetico tricaina
    1. Sciogliere 400 mg di tricaina metanasolonato in 97,9 mL di acqua Milli-Q.
    2. Aggiungi 2,1 mL di 1 M Tris base (pH 9) alla soluzione.
    3. Regolare la soluzione a pH 7,0 usando 0,1 M idrossido di sodio o acido cloridrico.
    4. Aliquota la soluzione in tubi etichettati e conserva a 4°C.
    5. Diluire la soluzione standard 1:25 per ottenere una concentrazione operativa di 160 μg/mL oppure diluire 1:100 per ottenere 40 μg/mL per applicazioni a bassodosaggio 18.
      ATTENZIONE: Il tricaina metanasolifeno è un anestetico chimico. Maneggiare l'uso di attrezzature di protezione individuale appropriate.
  5. Eseguire l'outcrossing
    1. Incrocio omozigote Tg(th:Gal4; UAS:NTR-mCherry) con pesci zebra selvatici AB mettendo un adulto transgenico omozigote e un adulto selvatico AB del sesso opposto in una vasca incrociata con un divisore durante la notte. Rimuovi il divisore all'inizio del ciclo di luce e raccogli gli embrioni dopo una finestra fissa di deposizione di 2 ore.
  6. Screening delle larve transgeniche
    1. A 3 giorni dalla fecondazione (dpf), anestesiare le larve usando tricaina a una concentrazione finale di 160 μg/mL.
    2. Osservare le larve sotto un microscopio stereoscopico a fluorescenza usando il set di filtri mCherry (eccitazione ~587 nm, emissione ~610 nm). Utilizzare le stesse impostazioni di schermatura per tutte le larve all'interno di un esperimento, inclusi ingrandimento oggettivo, tempo di esposizione, guadagno e intensità di illuminazione.
    3. Impostare l'esposizione e il guadagno utilizzando una larva transgenica nota positiva in modo che la fluorescenza del neurone DA sia chiaramente visibile senza saturazione, quindi mantenere queste impostazioni per tutte le larve rimanenti nell'esperimento.
    4. Confermare la presenza di segnale mCherry-positivo localizzato nei gruppi di neuroni DA nel diencefalo ventrale tra gli occhi e leggermente ventrale rispetto alla linea mediana (Figura 1A).
    5. Identificare le larve positive come quelle che mostrano una fluorescenza mCherry chiaramente rilevabile nei gruppi di neuroni DA attesi del diencefalo ventrale. Classificare le larve come negative se non è visibile alcun segnale mCherry sopra il fondo sotto le impostazioni fisse di screening, utilizzando larve non transgeniche o negative note come controlli di fondo.
      NOTA: 3 dpf è lo stadio più precoce in cui i neuroni DA nel diencefalo ventrale producono un segnale fluorescente affidabile per la quantificazione.

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Figura 1: Screening transgenico, immersione larvale e progettazione delle placche. (A) Immagine di fluorescenza (canale mCherry, obiettivo 4×) di una larva di pesce zebra transgenica che esprime nitroreduttasi (NTR) in neuroni dopaminergici (DA), mostrando cluster di neuroni DA nel diencefalo ventrale tra gli occhi. (B) Punte modificate di pipetta P200 rifilate a aperture di circa 1,5 mm, utilizzate per trasferire le larve durante l'incastramento dell'agarosio. (C) Disposizione rappresentativa delle piastre a 96 pozzi per lo screening di droghe ad alta produttività, inclusi il controllo dei veicoli, i pozzi trattati con metronidazolo (MTZ) e le condizioni di screening dei composti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Ablazione chemogenetica e imaging a fluorescenza

  1. Prepara il mezzo di incastramento dell'agarosio
    1. Il giorno dell'immersione a 4 dpf, preparare un agarosio a basso punto di fusione (LMA) dell'1,2% in acqua Milli-Q.
    2. Riscaldare la soluzione di agarosio in un microonde in intervalli brevi di 5–10 secondi, ruotando delicatamente tra un intervallo e l'altro, finché l'agarosio non si scioglie completamente e la soluzione è trasparente. Evita di ebollire troppo o di riscaldare prolungamente, che può alterare la concentrazione finale di agarosio tramite evaporazione.
    3. Aliquota l'agarosio in tubi microcentrifughe da 1,5 mL.
    4. Fondere le aliquote a 70°C e bilanciarle in un blocco termico a 42°C prima dell'uso.
    5. Aggiungere 20 μL di soluzione di stock di tricaina (4 mg/mL) a ciascuna aliquota di agarosio per ottenere una concentrazione operativa di circa 40 μg/mL.
    6. Mescola la tricaina nell'agarosio fuso pipettando delicatamente su e giù 5–10 volte con una pipetta P200. Evita il vortice o l'introduzione di bolle, poiché le bolle possono interferire con il posizionamento e l'imaging delle larve.
  2. Anestesiare e incastrare le larve
    1. Aggiungere la soluzione di tricaine stock alla piastra di Petri contenente 4 larve di dpf per ottenere una concentrazione finale di 160 μg/mL.
    2. Incubare le larve nella tricaina per circa 5 minuti, o finché non mostrano perdita del nuoto spontaneo e nessuna risposta al tocco delicato con la sonda. Procedere con l'embedding solo dopo aver raggiunto questo punto finale dell'anestesia.
    3. Taglia l'estremità distale della punta di una pipetta P200 usando forbici pulite o una lama sterile per creare un'apertura di circa 1,5 mm. Verifica la dimensione dell'apertura usando un righello o una bilancia calibrata sotto uno stereomicroscopio prima dell'uso. Scartare le punte con bordi ruvidi o aperture troppo strette perché le larve possano attraversarle senza contatto (Figura 1B).
    4. Aspira una singola larva in liquido minimo usando la punta modificata della pipetta.
    5. Immergi la punta della pipetta nell'aliquota di agarosio.
    6. Distribuire 40 μL di agarosio contenente una larva in un pozzo di una piastra a fondo piatto a 96 pozzi. Usa lo stesso volume di agarosio per tutti i pozzi all'interno di un esperimento. Se viene utilizzato un tipo di piastra diverso, ottimizzare il volume di agarosio prima di iniziare l'esperimento e mantenere il volume selezionato su tutti i pozzi.
      NOTA: Usa piastre a fondo piatto per garantire un'immagine coerente. Ottimizzare il volume dell'agarosio in base alla geometria della placca.
  3. Orientare e incorporare le larve
    1. Metti la lastra sotto uno stereomicroscopio (microscopio di dissezione (microscopio di disseczione).
    2. Si utilizzano pinze a punta fine o una sonda da 0,25 mm per orientare la larva in modo che il diencefalo ventrale sia rivolto verso l'obiettivo.
    3. Posizionare le larve con il lato dorsale verso il basso per microscopi rovesciati o verso l'alto per microscopi verticali.
    4. Orientamento completo entro 1–2 minuti prima che l'agarosio si solidifichi.
    5. Inserire una larva per pozzo secondo una mappa a lastre predefinita a 96 pozzi. Riservare la fila A per i controlli del veicolo, la fila H per i controlli solo MTZ, e assegnare le righe B–G a condizioni candidate composte o gruppi dose-risposta. Randomizzare la posizione dei composti all'interno delle righe B–G quando possibile per ridurre il bias posizionale. Usa la stessa mappa a piastre per l'imaging di base e post-trattamento.
    6. Dopo la solidificazione dell'agarosio, aggiungere BEW senza tricaina a ciascun pozzo per portare il volume finale del pozzo esattamente a 200 μL. Utilizzare lo stesso volume finale per tutti i pozzi all'interno della piastra per mantenere un'esposizione costante a diffusione e trattamento.
  4. Prepara soluzioni di trattamento MTZ
    1. Preparare soluzioni operative MTZ in BEW integrate con DMSO all'1% e PTU da 200 μM. Aggiungi la polvere di MTZ alla soluzione e al vortice finché non restano particelle visibili. Mescola su un oscillatore o un rotatore a tubo protetto dalla luce per 15–30 minuti a temperatura ambiente. Verifica che la soluzione sia trasparente e priva di precipitati visibili prima dell'uso.
    2. Preparare concentrazioni di 3, 4,5 e 9 mM per l'ottimizzazione dose-risposta.
    3. Prepara un controllo veicolo contenente DMSO all'1% in BEW con PTU da 200 μM.
    4. Prepara solo la concentrazione MTZ validata per lo screening di routine dopo l'ottimizzazione.
      ATTENZIONE: MTZ è fotosensibile. Prepara le soluzioni fresche per ogni esperimento, proteggile dalla luce con la carta stagnola e non riutilizzare le soluzioni avanzate.
      NOTA: Mantenere le stesse concentrazioni finali di DMSO in tutti i gruppi di trattamento e di controllo. Non sostituire formulazioni alternative di MTZ.
  5. Acquisire immagini di fluorescenza pre-trattamento
    1. A 4 dpf, dopo l'incorporazione, acquisire immagini di fluorescenza di base utilizzando un microscopio a fluorescenza con obiettivo 20× (Figura 2).
    2. Immagini ogni pozzo usando il canale mCherry (eccitazione ~587 nm, emissione ~610 nm).
    3. Usa le stesse impostazioni di imaging per tutti i pozzi all'interno di un esperimento. Imposta il tempo di esposizione, l'intensità di illuminazione e il guadagno del rivelatore utilizzando una larva di controllo del veicolo in modo che i pixel più luminosi del neurone DA raggiungano circa il 70%–80% della gamma dinamica del rivelatore senza saturazione. Registrare il tempo di esposizione finale, l'intensità di illuminazione, il guadagno del rivelatore, l'obiettivo e il profilo di acquisizione, e mantenere queste impostazioni per tutte le immagini di base e post-trattamento.
    4. Acquisire tutte le immagini all'interno di una singola sessione quando possibile per minimizzare la variabilità dell'intensità della lampada o della sensibilità del rilevatore nei momenti temporali. Per i sistemi con controllo automatico dello stadio, si utilizza l'acquisizione multiposizione per mantenere coordinate identiche tra le sessioni di imaging.
    5. Conservare il profilo di acquisizione per il riutilizzo durante l'imaging post-trattamento (Passo 3.7) e negli esperimenti successivi.
      NOTA: Un obiettivo del 20× fornisce un equilibrio tra campo visivo e risoluzione per l'imaging del cluster di neuroni DA diencefalici.
  6. Applicare il trattamento MTZ dopo l'imaging basale
    1. Immediatamente dopo l'imaging di base a 4 dpf, si aggiunge direttamente in ciascun pozzo una soluzione contenente MTZ o una soluzione di veicolo per portare il volume finale del pozzo a 200 μL.
    2. Per gli esperimenti di screening composto, si aggiungono i composti candidati insieme alla MTZ in questa fase, così che le larve vengano esposte alla MTZ ± composto durante lo stesso periodo di trattamento di 24 ore.
    3. Incubare le piastre a 28,5°C con un ciclo di luce di 14 ore per 10 ore di buio per 24 ore, da 4 dpf a 5 dpf.
    4. Evita di disturbare le piastre durante l'incubazione.
      NOTA: Per gli esperimenti dose-risposta, valutare tempi di incubazione aggiuntivi (ad esempio, 12 e 48 ore) per ottimizzare le condizioni di trattamento.
      PUNTO DI PAUSA: Le placche possono essere mantenute in condizioni di incubazione per la durata definita del trattamento prima di procedere all'imaging (imaging).
  7. Acquisire immagini di fluorescenza post-trattamento
    1. A 5 dpf, acquisire immagini post-trattamento utilizzando le stesse impostazioni del microscopio utilizzate per l'imaging di base a 4 dpf, inclusi tempo di esposizione, intensità di illuminazione, guadagno del rivelatore, obiettivo e profilo di acquisizione (Figura 2).
    2. Non modificare il tempo di esposizione, il guadagno del rilevatore, l'intensità dell'illuminazione, la messa a fuoco, l'obiettivo o le impostazioni di acquisizione tra pozzi o tra le sessioni di imaging pre-trattamento e post-trattamento.
    3. Se il microscopio era spento tra una sessione e l'altra, ricarica il profilo di acquisizione salvato e verifica tutte le impostazioni rispetto ai parametri registrati prima dell'imaging (imaging).
    4. Visualizzare i pozzi di immagine nello stesso ordine usato durante l'imaging di base, quando possibile, e acquisire tutte le immagini post-trattamento nella stessa sessione di imaging.
    5. Questa progettazione di imaging abbinata pre-trattamento e post-trattamento controlla la variabilità interindividuale nella fluorescenza basale dei neuroni DA e garantisce che i cambiamenti nel segnale siano attribuibili al trattamento piuttosto che alle differenze di acquisizione.

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Figura 2: Riduzione dipendente dalla dose nella fluorescenza dei neuroni DA dopo il trattamento con metronidazolo. Immagini rappresentative di fluorescenza (canale mCherry, obiettivo 20×) di larve di pesce zebra transgenici che mostrano neuroni DA diencefalici dopo un trattamento di 24 ore con concentrazioni variabili di MTZ. L'intensità della fluorescenza diminuisce in modo dipendente dalla dose, indicando una riuscita ablazione chemogenetica dei neuroni che esprimono NTR. Barra della scala = 50 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Screening antidroga ad alto rendimento su placche

  1. Generare e selezionare le larve transgeniche
    1. Generare una nuova coorte di larve transgeniche omozigoti.
    2. Raccogli embrioni e allevali in BEW.
    3. Trattare gli embrioni con PTU a 200 μM alle 24–36 ore dopo la fecondazione (hpf) come descritto nello Passo 2.3.
    4. A 3 dpf, schermare le larve utilizzando il canale mCherry con impostazioni fisse del microscopio per tutte le larve all'interno dell'esperimento. Imposta il tempo di esposizione, il guadagno del rilevatore e l'intensità dell'illuminazione usando una larva nota positiva per rilevare chiaramente la fluorescenza dei neuroni DA senza saturazione, quindi mantenere queste impostazioni invariate durante lo screening.
    5. Classificare le larve come positive se la fluorescenza mCherry è chiara visibile nei gruppi di neuroni DA attesi del diencefalo ventrale sotto impostazioni fisse di screening. Scartare le larve senza segnale sopra il fondo in questa regione o con fluorescenza debole, diffusa o ectopica.
  2. Inserire larve e acquisire immagini di base
    1. A 4 dpf, inserire le larve in una piastra da 96 pozzi come descritto nei passaggi 3.2–3.3, utilizzando una larva per pozzo.
    2. Acquisire immagini di fluorescenza di base pre-trattamento come descritto nello Passo 3.5.
  3. Applica MTZ e composti candidati
    1. Dopo aver acquisito immagini di fluorescenza di base a 4 dpf, aggiungere soluzioni di trattamento direttamente ai pozzi secondo la mappa delle placche (Figura 1C).
    2. Per i pozzi di controllo veicolo, aggiungere BEW contenente la stessa concentrazione finale di DMSO utilizzata nei pozzi trattati con composti.
    3. Per pozzi di controllo solo MTZ, aggiungere soluzione MTZ senza composto candidato.
    4. Per i pozzi di selezione composta, si aggiungono MTZ e composto candidato insieme in modo che le larve siano esposte a entrambi durante lo stesso periodo di trattamento di 24 ore.
    5. Per lo screening iniziale, si utilizza una singola concentrazione composta, come 10 μM, a meno che solubilità, tossicità o dati dose-risposta specifici del composto non indichino che si dovrebbe utilizzare una concentrazione diversa.
    6. Regolare ogni pozzo a un volume finale di 200 μL. Mantenere le stesse concentrazioni finali di DMSO su tutti i pozzi, inclusi il controllo del veicolo, il controllo solo MTZ e i pozzi MTZ più composti.
    7. Incubare le piastre a 28,5°C con un ciclo di luce di 14 ore per 10 ore di buio per 24 ore, da 4 dpf a 5 dpf.
      NOTA: Questo protocollo non include la rimozione o il lavaggio dell'MTZ prima dell'esposizione al composto. I composti candidati vengono applicati contemporaneamente alla MTZ immediatamente dopo l'imaging basale.
  4. Acquisire immagini post-trattamento e calcolare la ritenzione della fluorescenza
    1. A 5 dpf, acquisire immagini di fluorescenza post-trattamento utilizzando le stesse impostazioni di acquisizione utilizzate per l'imaging di base a 4 dpf.
    2. Riempire i pozzi di immagine nello stesso ordine usato durante l'imaging di base, quando possibile.
    3. Calcolare la ritenzione della fluorescenza per ogni larva come:
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    4. Normalizzare i valori di ritenzione della fluorescenza al valore medio di controllo del veicolo dalla stessa placca.
    5. Identificare i composti protettivi candidati come quelli con valori di ritenzione della fluorescenza significativamente superiori rispetto al controllo solo MTZ.
  5. Identificare i composti colpiti
    1. Identificare i composti di colpo come quelli con rapporti di ritenzione della fluorescenza significativamente superiori rispetto al controllo negativo (solo MTZ).
    2. Eseguire analisi statistiche utilizzando il test t di Welch per confrontare i controlli solo MTZ con i gruppi trattamentali MTZ più composti.
    3. Validare i composti colpiti utilizzando repliche biologiche indipendenti e saghi dose-risposta. Confermare i corrispondenze come composti che aumentano riproducibilmente la ritenzione della fluorescenza rispetto al controllo solo MTZ, con p < 0,05 e nessuna tossicità larvale visibile o morfologia anomala.
    4. Avanzare i risultati validati per saggi secondari come l'analisi comportamentale locomotoria, la validazione dose-risposta o test biologici indipendenti di replicazione.
      NOTA: Per schermi a libreria composta, calcola il fattore Z per ciascuna piastra usando controlli positivi e negativi. Un fattore Z > 0,5 indica un saggio robusto adatto all'identificazione dei colpi.

5. Valutazione comportamentale locomotoria

  1. Assegnare le larve ai gruppi di trattamento
    1. A 4 dpf, allocare le larve di ciascun genotipo in tre gruppi di trattamento con almeno 10 larve per gruppo: solo BEW, DMSO veicolo controllo e trattamento MTZ.
    2. Assegnare i gruppi come segue: (1) solo BEW (base non trattata), (2) controllo del veicolo DMSO all'1% e (3) concentrazione ottimizzata di MTZ (4,5 mM in DMSO/BEW all'1% con PTU da 200 μM).
    3. Includere larve di tipo selvatico AB trattate con veicolo o MTZ in condizioni identiche. Confermare effetti dipendenti da NTR se MTZ riduce la locomozione in Tg(th:Gal4; UAS:NTR-mCherry) ma non nelle larve di tipo selvatico AB.
  2. Eseguire il trattamento e le larve a placca
    1. Trattare le larve per 24 ore a 28,5°C utilizzando le condizioni definite nel Passo 5.1.2: solo BEW, controllo veicolo DMSO al 1%, o 4,5 mM MTZ in DMSO/BEW all'1% con PTU da 200 μM.
    2. Trasferire cinque larve in ciascun pozzo di una piastra a 6 pozzi contenente 2,5 mL di BEW fresco utilizzando una pipetta di trasferimento a larga scala. Minimizza il volume trasportato e maneggia le larve con delicatezza per evitare stress o infortuni.
      NOTA: L'uso di cinque larve per pozzo bilancia la resa dei dati e minimizza il sovraffollamento. Densità più elevate aumentano gli incroci di percorso e introducono errori di tracciamento nell'analisi comportamentale.
  3. Impostare le condizioni di illuminazione
    1. Posizionare la piastra a 6 pozzi su un pad luminoso LED bianco con illuminazione diffusa uniforme mantenuta a 25°C–28°C. Usa lo stesso pad luminoso, impostazione della luminosità e posizione della piastra per tutte le registrazioni all'interno di un esperimento (Figura 3A).
    2. Illumina la piastra sia dal basso che dall'alto usando fonti di luce diffusa per minimizzare ombre, riflessi e riflessi.
  4. Configura l'impostazione della registrazione video
    1. Montare una fotocamera ad alta risoluzione in un'orientazione fissa dall'alto sopra la piastra utilizzando un supporto stabile (ad esempio, treppiede o supporto per braccio) (Figura 3B).
    2. Posiziona un righello adiacente alla placca nel campo visivo per la calibrazione spaziale.
    3. Assicurati che la fotocamera sia perpendicolare alla superficie della piastra per minimizzare la distorsione della parallasse.
  5. Attività locomotoria record
    1. Effettuare registrazioni durante la fase luminosa del ciclo luminoso di 14 ore per 10 ore per minimizzare la variabilità circadiana.
    2. Lascia che le larve si acclimatino per 1 ora prima di registrarle.
    3. Registra l'attività locomotoria per 60 minuti.
    4. Non disturbare l'impianto durante la registrazione.
      NOTA: Esegui registrazioni alla stessa ora della giornata tra gli esperimenti per minimizzare la variabilità circadiana.
  6. Configura il software di tracciamento comportamentale
    1. Importare il video registrato in EthoVision XT (software di tracciamento comportamentale) (Figura 3C).
    2. Configura le seguenti impostazioni: 6 arene, 5 soggetti per arena, rilevamento del punto centrale, distanza in millimetri e tempo in secondi.
    3. Calibrare la scala spaziale usando il righello presente nel fotogramma video.
    4. Definisci i confini dell'arena per ogni pozzo, assicurandoti che ogni arena copra completamente l'interno del pozzo senza estendersi oltre i bordi del pozzo.
  7. Ottimizza le impostazioni di rilevamento
    1. Genera un'immagine di riferimento usando l'interfaccia software (Impostazioni di rilevamento → Immagine di riferimento → Inizia a imparare).
    2. Regolare la soglia di rilevamento per garantire un tracciamento accurato di tutte le larve senza false rilevazioni.
    3. Esegui un breve test di acquisizione (~2 min).
    4. Ispezionare visivamente i percorsi tracciati prima di procedere all'analisi completa. Conferma che tutte le larve siano state rilevate e che bolle, detriti, riflessi o bordi del pozzo non siano erroneamente identificati come larve.
      NOTA: Artefatti comuni includono il tracciamento dei bordi causato da arene sovradimensionate, false rilevazioni da bolle o detriti e perdita di tracciamento durante inattività prolungata.
    5. Escludere i pozzi dall'analisi se un persistente guasto nel tracciamento, un incrocio eccessivo del percorso, detriti o bolle visibili, larve morte, morfologia anomala o larve intrappolate al bordo del pozzo impediscono una quantificazione affidabile.
    6. Applicare gli stessi criteri di esclusione a tutti i gruppi di trattamento prima dell'analisi statistica.
  8. Eseguire analisi complete ed esportare dati
    1. Esegui l'acquisizione completa.
    2. Generare visualizzazioni di tracciato e heatmap (Analisi → Risultati → Piste e Heatmap).
    3. Esporta il foglio di calcolo dei dati grezzi contenente metriche per argomento, inclusa distanza totale percorsa (mm), velocità media (mm/s) e numero di incontri di movimento.
    4. Utilizzare la distanza totale percorsa oltre 60 minuti come punto finale principale della locomotoria (Figura 3D).

figure-protocol-4
Figura 3: Impostazione e flusso di lavoro di analisi della registrazione comportamentale locomotoria. (A) Configurazione sperimentale che mostra una piastra a 6 pozzi contenente larve di pesce zebra posizionata su una piattaforma luminosa con un righello per la calibrazione spaziale e una fonte di calore a temperatura controllata per mantenere condizioni sperimentali. (B) Configurazione di acquisizione video con una telecamera dall'alto utilizzata per registrare i movimenti larvali, con sovrapposizione rappresentativa di tracciamento. (C) Tracciamento comportamentale eseguito utilizzando EthoVision XT (software di tracciamento comportamentale), che mostra il rilevamento e il tracciamento automatici del movimento larvale. (D) Riepilogo del flusso di lavoro che delinea i passaggi dall'acquisizione video all'analisi quantitativa del comportamento locomotore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

6. Analisi dei Dati

  1. Preparare le immagini per l'analisi
    1. Aprite coppie di immagini pre-trattamento e post-trattamento nelle Fiji (ImageJ, software di analisi delle immagini).
    2. Se le immagini vengono acquisite come Z-stack, generare proiezioni di massima intensità (Image → Stacks → Z Project → Max Intensity).
    3. Regola luminosità/contrasto usando impostazioni di visualizzazione fisse identiche per tutte le immagini all'interno di un dataset. Non utilizzare l'auto-scaling per le misurazioni quantitative e effettuare la quantificazione della fluorescenza sulle immagini originali non aggiustate.
  2. Definire le regioni di interesse (ROI)
    1. Usa lo strumento di selezione dei poligoni per tracciare un ROI attorno al cluster di neuroni DA diencefalici nell'immagine pre-trattamento. Definisci il confine ROI utilizzando punti di riferimento anatomici visibili nell'immagine di fluorescenza, inclusi i bordi mediali degli occhi e la linea mediana ventrale del diencefalo (Figura 2). Assicurati che il ROI copra l'intero cluster di neuroni DA senza estendersi nelle strutture fluorescenti adiacenti. Per coerenza tra gli operatori, salva un modello rappresentativo di ROI e distribuiscilo a tutti i membri del team come riferimento spaziale.
    2. Premi "t" per aggiungere il ROI al ROI Manager.
    3. Allineare le immagini pre-trattamento e post-trattamento utilizzando punti di riferimento anatomici, inclusi occhi e diencefalo ventrale, prima di applicare il ROI. Applica lo stesso ROI all'immagine corrispondente post-trattamento solo dopo aver confermato l'allineamento.
    4. Salva tutti i ROI per ogni lastra per permettere la riproducibilità e la ri-analisi.
  3. Quantificare l'intensità della fluorescenza
    1. Configura le impostazioni di misurazione (Analizza → imposta le misurazioni) e seleziona "Area" e "Valore grigio medio."
    2. Misura ogni immagine (Analizza → Misura).
    3. Misura la fluorescenza di fondo da una regione non neuronale adiacente all'interno della stessa immagine e sottrala dalla misurazione del ROI del neurone DA. Calcola la densità integrata corretta in base come: IntDen corretta = IntDenROI − (areaROI × media background).
    4. Calcola il rapporto di ritenzione della fluorescenza per ogni larva come IntDen (post-trattamento) / IntDen (pre-trattamento).
    5. Normalizzare i rapporti di ritenzione della fluorescenza al valore medio di controllo del veicolo dalla stessa placca. Calcola separatamente la media dei controlli del veicolo per ogni targa prima di confrontare i gruppi di trattamento19.
      NOTA: Per un'analisi ad alto throughput, eseguire la stessa quantificazione utilizzando CellProfiler (software di analisi delle immagini) con rilevamento automatico del ROI20.
  4. Eseguire analisi statistica a coppie
    1. Per confronti tra un gruppo di trattamento e un gruppo di controllo, eseguire un test di Welch a due code non accoppiato t-test, che non assume una varianza uguale tra i gruppi.
    2. Usa questo test quando la varianza varia tra i gruppi.
  5. Eseguire analisi statistiche multigruppo
    1. Eseguire ANOVA unidirezionale per esperimenti che coinvolgono più gruppi di trattamento.
    2. Applicare il test post hoc di Dunnett per confrontare ogni gruppo di trattamento con il gruppo di controllo utilizzando GraphPad Prism o software statistico equivalente.
  6. Segnala i risultati statistici
    1. Imposta la soglia di significatività a α = 0,05.
    2. Riportate i valori p esatti piuttosto che le soglie categoriche.
    3. Presentare i dati come media ± errore standard della media (SEM) con i singoli punti dati sovrapposti come diagrammi a scatter utilizzando GraphPad Prism o software di grafica equivalente.
    4. Riporta la dimensione del campione (n), il test statistico, la statistica del test, i gradi di libertà e il p-valore esatto nelle figure legendarie. Per grandi dataset, includere gli output statistici completi in una tabella supplementare.
      NOTA: Per i sami di schermo, calcola il fattore Z per ogni piastra come Z = 1 − [3(σp + σn)/|μp − μn|], dove σp e μp sono la deviazione standard e la media del gruppo di controllo del veicolo, e σn e μn sono la deviazione standard e la media del gruppo di controllo solo MTZ. Un fattore Z > 0,5 è considerato accettabile per lo screening.

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Risultati

Il trattamento MTZ provoca perdita di neuroni dopaminergici dipendente dalla dose e compromissione locomotoria

Per determinare i parametri ottimali per l'ablazione mediata da MTZ dei neuroni DA, sono state valutate l'intensità di fluorescenza, utilizzata come indicatore della sopravvivenza dei neuroni DA, e la distanza locomotoria tra concentrazioni MTZ di 3, 4,5 e 9 mM dopo un trattamento di 24 ore. Ogni gruppo di trattamento era composto da ...

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Discussione

Questo protocollo offre una pipeline scalabile e in vivo per quantificare la perdita neuronale DA e lo screening dei composti neuroprotettivi utilizzando il sistema chemogenetico NTR–MTZ nei pesci zebra transgenici. Il flusso di lavoro standardizzato basato su targhe è stato sviluppato specificamente per i team di ricerca universitari, dove il turnover degli operatori è elevato e l'esperienza degli investigatori varia tra i semestri accademici. Ogni fase del flusso di lavoro è stata stru...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non esserci conflitti di interesse finanziari.

Ringraziamenti

Ringraziamo il Dr. Su Guo (University of California, San Francisco) per aver fornito il pesce zebra transgenico, e il Dr. Daeseok Eom, il Dr. Michael Parsons ed Eddie Hallo (University of California, Irvine) per aver fornito embrioni di tipo selvatico e per le indicazioni sull'allevamento dei pesci zebra e la manutenzione delle strutture ittiche. Ringraziamo inoltre i membri dello staff del Robert A. Mah Molecular Innovation Center e del Falling Leaves Innovation Building (University of California, Irvine) per aver fornito l'infrastruttura per la struttura acquatica.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Adult zebrafish diet, 0.5 mm pelletsZeiglerAH271Usato per l'alimentazione di zebrafish adulti durante le normali cure
Agarosio, a basso punto di fusione (LMA)Sigma-AldrichA9414-10GUsato per incorporare le larve nei pozzetti per una posizione stabile durante l'imaging
Carta stagnolaULINES-20197Usato per proteggere reagenti sensibili alla luce come MTZ durante la preparazione e l'incubazione
CellProfilerBroad InstituteRRID: SCR_007358Usato per l'analisi opzionale delle immagini di fluorescenza automatizzata
Tubi conici, 15 mLCorning352097Usato per la preparazione dei reagenti e la manipolazione dei campioni
Tubi conici, 50 mLCorning352070Usato per la preparazione dei reagenti e lo stoccaggio delle soluzioni
Serbatoi per l'incrocio (1,0 L)AquaneeringZHCT100Usato per l'allevamento controllato di zebrafish e la raccolta di embrioni
Danio rerio (AB wild type)——Linea di controllo non transgenica usata per validare la specificità degli effetti dipendenti dalla nitroriduttasi
Danio rerio (Tg(th:Gal4; UAS:NTR-mCherry))——Linea di zebrafish transgenica che esprime nitroriduttasi-mCherry nei neuroni dopaminergici per l'ablazione chemogenetica mirata
Diossido di metile (DMSO), anidro (≥99,9%)Sigma-Aldrich472301-500MLSolvente per PTU, MTZ e composti di screening
EthoVision XTNoldusRRID: SCR_000441Software di tracciamento comportamentale usato per quantificare la locomozione larvale
Fiji (ImageJ)NIHRRID: SCR_003070Software di analisi delle immagini usato per la quantificazione della fluorescenza
Pinzette a punta fine o sonda da 0,25 mmWorld Precision InstrumentsWPI0118Usate per orientare le larve durante l'incorporazione in agarosio
Microscopio a fluorescenzaZeiss11845460Usato per immagine dei neuroni dopaminergici tramite fluorescenza mCherry
Gemma Micro 150 ZF (dieta per giovani, 100–200 μm)Skretting10818945Usato per nutrire zebrafish giovani
Gemma Micro 75 ZF (dieta per larve, 50–100 μm)Skretting10818935Usato per nutrire larve zebrafish
GraphPad PrismGraphPadRRID: SCR_002798Software di analisi statistica usato per l'analisi dei dati e la creazione di grafici
Blocco riscaldante (capace di 42°C e 70°C)Thermo Fisher88870001Usato per sciogliere e mantenere l'agarosio a temperature controllate
Fotocamera ad alta risoluzione (compatibile con montaggio dall'alto)Basler88-327Usata per registrare l'attività locomotoria larvale
Acido cloridrico (HCl), 0,1 MFisher ScientificSA48-500Usato per regolare il pH durante la preparazione del tricaine
Incubatore (28,5°C, fotoperiodo 14 h luce:10 h buio)MilliporeZ763314Mantiene condizioni ambientali controllate per lo sviluppo dei zebrafish
Sale marino Instant OceanInstant OceanSS15-10Usato per preparare l'acqua degli uova blu (BEW)
Foglio diffusore di luce (o equivalente)Edmund Optics27-103Usato per fornire un'illuminazione uniforme e minimizzare l'abbagliamento durante la registrazione comportamentale
Pannello luminosoLightcraftLC2004LEDFornisce illuminazione inferiore durante il tracciamento locomotore
Metronidazolo (MTZ)Sigma-AldrichM3761-100GUsato per l'ablazione chemogenetica dei neuroni dopaminergici
Blu di metilene, soluzione acquosa 1%Sigma-AldrichM9140Aggiunto al BEW per prevenire la crescita microbica negli embrioni
Tubi per microcentrifuga, 1,5 mLEppendorf22363204Usati per la suddivisione e lo stoccaggio dei reagenti
Micropipetta, P200GilsonFP10005SUsata per la manipolazione delle larve e la preparazione delle soluzioni
Piatti Petri, 100 mmCorningCLS430167Usati per la raccolta e l'incubazione degli embrioni
Punta per pipette, 200 μLRAININ30389188Usate con le micropipette per la manipolazione dei liquidi e il trasferimento delle larve
Cloruro di sodio (NaCl), ≥99,0%Sigma-AldrichS9888-500GUsato per preparare tamponi e soluzioni acquose
Idrossido di sodio (NaOH), 0,1 MFisher ScientificSS256-500Usato per regolare il pH durante la preparazione del tricaine
StereomicroscopioNikonSMZ-745Usato per la manipolazione e l'orientamento delle larve durante l'incorporazione
Tappetino termico a temperatura controllata (25°C–28°C)VivosunV-SHMDTMantiene una temperatura stabile durante la registrazione comportamentale
Tricaine metanosulfonato (MS-222)Sigma-AldrichE10521-10GUsato come anestetico per le larve di zebrafish
Base di trisFisher ScientificBP152-1Usato nella preparazione della soluzione tamponata di tricaine
Sistema di purificazione dell'acquaMilliporeZIQ7003T0Usato per generare acqua deionizzata per la preparazione delle soluzioni
Serbatoi per zebrafishAquaneeringZS560Usati per mantenere le popolazioni di zebrafish adulti
1-Fenil-2-tiourea (PTU)Sigma-AldrichP7629-10GUsato per inibire la melanogenesi e mantenere la trasparenza ottica
Piastra a 6 pozzetti, fondo piattoCorning07-200-83Usata per i test comportamentali locomotori
Piastra a 96 pozzetti, fondo piattoGreiner Bio-One655096Usata per gli assay di imaging

Riferimenti

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