Meccanismi della formula 3 di Qu per migliorare la ricettività endometriale nella PCOS: una combinazione di farmacologia di rete e simulazione della dinamica molecolare

Sommario

Questo protocollo mira a esplorare il meccanismo attraverso cui QUF3 migliora la ricettività endometriale nella PCOS utilizzando la farmacologia di rete, il docking e la simulazione MD.

Abstract

La ricettività endometriale compromessa è una delle principali cause di infertilità nella sindrome dell'ovaio policistico (PCOS). La Formula 3 di Qu (QUF3) è una formula cinese di medicina erboristica utilizzata clinicamente per migliorare la ricettività endometriale nei pazienti con PCOS. Questo studio ha utilizzato la farmacologia di reti, il docking molecolare e simulazioni di dinamica molecolare (MD) per indagare i meccanismi sottostanti. I costituenti attivi di QUF3 sono stati identificati utilizzando il database TCMSP, e potenziali bersagli relativi alla recetività endometriale e alla PCOS sono stati recuperati da DrugBank e altre risorse. Una rete di interazione composto-bersaglio e una rete di interazione proteina-proteina (PPI) sono state costruite tramite Cytoscape per identificare i target chiave. I bersagli principali sono stati sottoposti ad analisi di arricchimento GO e KEGG. Sono stati utilizzati l'aggancio molecolare, le simulazioni MD, l'analisi delle componenti principali (PCA), il paesaggio di energia libera (FEL) e la matrice dinamica di correlazione incrociata (DCCM) per valutare le interazioni di legame. Da 91 principi attivi e 294 potenziali target farmacologici, sono stati identificati 60 target correlati alla malattia. Luteolina e sesamin sono stati tra i principali componenti farmacodinamici. Sono stati identificati dieci obiettivi principali: AKT1, EGFR, TNF, TP53, IL6, BCL2, ESR1, IL1B, STAT3 e MMP9. L'arricchimento KEGG ha rivelato 132 vie di segnalazione e l'analisi GO ha identificato 678 entrate. Le simulazioni MD indicarono che il legame tra i cinque principali costituenti attivi e i rispettivi obiettivi era stabile. PCA, FEL e DCCM hanno ulteriormente dimostrato un'elevata stabilità termodinamica e rigidità strutturale di questi complessi. In conclusione, QUF3 migliora la recetività endometriale nella PCOS attraverso interazioni multicomponenti, multibersaglio e multipercorso. Questo studio fornisce una base teorica, da una prospettiva di simulazione computazionale, per lo sviluppo di terapie mirate di medicina erboristica cinese per l'infertilità correlata alla PCOS, e potrebbe avere implicazioni positive per migliorare gli esiti della gravidanza nelle donne con PCOS in futuro.

Introduzione

La sindrome dell'ovaio policistico (PCOS) è uno dei disturbi endocrini più comuni nelle^{donne 1}. Le sue caratteristiche principali includono disfunzione ovulatoria cronica persistente, iperandrogenemia clinica o biochimica e morfologia ovarica policistica, con manifestazioni cliniche come amenorrea, infertilità, irsutismo, acne e obesità. Negli ultimi anni, i progressi nella tecnologia dell'induzione dell'ovulazione e nella riproduzione assistita (ART) hanno migliorato significativamente i tassi di gravidanza nelle pazienti con PCOS; tuttavia, i risultati della gravidanza restano peggiori rispetto a quelli delle donne^{sane 2,3}. La ricettività endometriale è un fattore chiave che influenza gli esiti^{ART 4}. La ricettività endometriale si riferisce alla capacità dell'endometrio di accettare un embrione in una specifica fase fisiologica, che gioca un ruolo decisivo nell'impianto e nello sviluppo successivo^{dell'embrione 5,6}. Le condizioni patologiche comunemente osservate nella PCOS, come obesità, resistenza all'insulina e infiammazione cronica, possono compromettere la ricettività endometriale, ostacolare l'impianto degli ovuli fecondati e lo sviluppo embrionale, e infine portare a infertilità e aborto^{spontaneo 7,8}. Tuttavia, i meccanismi regolatori alla base della ricetività endometriale nella PCOS rimangono in gran parte poco chiari, e la rete di interazione tra i vari fattori influenti deve ancora essere chiara. La Formula 3 di Qu (QUF3), una formula di medicina erboristica cinese utilizzata clinicamente per migliorare la ricettività endometriale nei pazienti con PCOS, è supportata da solide teorie classiche della medicina tradizionale cinese (MTC) in ginecologia. La formula è composta da Paeoniae Radix Alba (Baishao), Rehmanniae Radix Praeparata (Shudihuang), Cuscutae Semen (Tusizi), Fructus Ligustri Lucidi (Nvzhenzi), Herba Taxilli (Sangjisheng), Radix Salviae (Danshen) e Cornus Officinalis Sieb. et Zucc. (Shanzhuyu) in un rapporto di 2:4:3:4:3:3:2:2, preparato con estrazione da etanolo. QUF3 esercita effetti sinergici di più erbe, tonificando il rene, arricchendo l'essenza, nutrindo il sangue e favorendo la circolazione^{sanguigna 9}. La sua efficacia clinica nel migliorare la ricettività endometriale nei pazienti con PCOS è stata ben convalidata, ma i suoi meccanismi farmacologici fondamentali restano da approfondire.

La farmacologia delle reti è un approccio analitico basato sulla biologia dei sistemi che costruisce reti multilivello "componente-erba-bersaglio-malattia" per rivelare, da una prospettiva olistica, gli effetti di intervento dei farmaci sulle reti di malattie. A differenza del tradizionale modello "farmaco singolo-singolo bersaglio", la farmacologia di rete può catturare in modo completo le caratteristiche sinergiche delle azioni "multi-componente, multi-bersaglio e multi-percorso" delle formule della MTC, rendendola particolarmente adatta per l'indagine dei complessi meccanismi della MTC. La simulazione della dinamica molecolare (MD), al contrario, è una tecnica computazionale basata sulla meccanica newtoniana che simula, a livello atomico, i cambiamenti conformazionali e il comportamento dinamico dei complessi proteina-ligando nel tempo. Rispetto all'aggancio molecolare statico, la simulazione MD può valutare parametri dinamici, come la stabilità del legame, i paesaggi di energia libera e la rigidità strutturale, fornendo così una valutazione più realistica delle interazioni tra molecole di farmaci e proteine bersaglio. La farmacologia delle reti è adatta per lo screening globale dei potenziali target e delle vie delle formule della MTC, mentre la simulazione MD può valutare dinamicamente la stabilità del legame tra componenti chiave e proteine bersaglio. La combinazione di questi due approcci consente un'analisi più affidabile dei meccanismi sinergici multi-componente e multi-bersaglio delle formule della MTC. Sulla base di questa logica, questo studio ha utilizzato un approccio combinato di farmacologia di rete e simulazione della MD per esplorare sistematicamente i potenziali meccanismi farmacologici alla base del miglioramento della ricettività endometriale di QUF3 nei pazienti con PCOS.

Questo flusso di lavoro computazionale combinato è più adatto per l'esplorazione iniziale dei meccanismi multi-componente e multi-bersaglio delle formule erboristiche o dei prodotti naturali cinesi, in particolare per sistemi complessi in cui gli ingredienti attivi e i target sono in gran parte sconosciuti. Gli utenti dovrebbero possedere conoscenze di base in bioinformatica, inclusa la ricerca nei database e l'analisi delle reti, oltre alla capacità di eseguire analisi fondamentali di biologia computazionale come il docking molecolare e simulazioni di dinamica molecolare utilizzando pacchetti software comuni. Si raccomanda un ambiente di calcolo basato su Linux con almeno 16 GB di RAM, insieme all'accesso a database pubblici rilevanti come il Traditional Chinese Chinese Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP), PubChem e UniProt. Tutto il software utilizzato in questo flusso di lavoro (ad esempio, Cytoscape, AutoDockTools, GROMACS) è open source o gratuito per uso accademico, e i lettori possono ottenerlo dalle informazioni fornite nella Tabella dei Materiali.

Protocollo

Screening dei costituenti attivi e dei potenziali bersagli di QUF3
I componenti chimici attivi di Baishao, Shudihuang, Tusizi, Nvzhenzi, Sangjisheng, Danshen e Shanzhuyu nel farmaco QUF3 sono stati identificati tramite il TCMSP il 1^{° aprile 2025 10}. I principi attivi sono stati preliminarmente selezionati in base alle condizioni di biodisponibilità orale (OB) ≥30% e somiglianza farmacologica (DL) ≥ 0,18¹¹. Queste soglie sono state scelte come criteri empirici standard per garantire un'assorbimento sufficiente e proprietà simili a quelle dei farmaci. La sequenza canonica SMILES di ciascun composto è stata ricercata nel database PubChem, e la sequenza risultante è stata utilizzata per prevedere i target dei composti nel database online Swiss Target Prediction, seguita dalla raccolta dei nomi dei geni delle proteine target e degli ID UniProt dal database^UniProt 12,13,14. Come checkpoint intermedio, è stato registrato il numero di bersagli unici ottenuti dopo la deduplicazione.

Identificazione di obiettivi d'azione per la ricettività endometriale nella PCOS
Le parole chiave "sindrome delle ovaie policistiche" e "ricetività endometriale" sono state utilizzate come termini di ricerca negli online Mendelian Inheritance in Man (OMIM), DrugBank, Therapeutic Target Database (TTD) e GeneCard database per identificare potenziali target 15,16,17,18. Per le GeneCard, sono stati mantenuti solo i target con un punteggio di rilevanza >5; Per gli altri database, tutti i target recuperati erano inclusi. Dopo la fusione e la rimozione delle voci duplicate, il numero di target unici associati alla malattia veniva registrato come output intermedio.

Costruzione di componenti e target in rete
I target di intersezione sono stati generati inserendo i possibili target per QUF3, PCOS e ricetività endometriale in uno strumento online per il diagramma di Venn. Questi bersagli di intersezione sono stati considerati i principali bersagli attraverso cui QUF3 esercita la sua efficacia nel migliorare la recetività endometriale nella PCOS. Successivamente, è stata creata una rete "herb-constituent-target" (H-C-T) abbinando questi target di intersezione con i dati attivi costituente-target di QUF3 utilizzando Cytoscape¹⁹. La rete veniva visualizzata utilizzando lo strumento "Network Analyzer".

Costruzione di reti di interazione proteina-proteina (PPI)
I geni potenzialmente target di QUF3 per migliorare la recetività endometriale nella PCOS sono stati inviati come input alla piattaforma dati^{STRING 20}. La specie era impostata su "Homo sapiens" e la soglia di confidenza era impostata su "media fiducia (0,4)", producendo un file TSV di dati di interazione proteina-proteina. Questo file veniva poi importato in un software di analisi di rete per costruire e analizzare la rete^{PPI 21}. L'importanza dei nodi nella rete è indicata dal valore "Degree": un valore di Degree più alto indica un nodo più significativo. Successivamente, gli ingredienti attivi principali sono stati classificati per Grado e i primi 10 obiettivi principali sono stati selezionati in base alla classifica del Grado.

Analisi dell'ontologia genica (GO) e dell'enciclopedia di geni e genomi di arricchimento dei percorsi (KEGG)
Le analisi di arricchimento delle vie GO e KEGG sono state condotte utilizzando il database DAVID per esplorare le vie biologiche e i meccanismi con cui QUF3 migliora la ricettività endometriale nella^{PCOS 22}. La specie fu impostata su "Homo sapiens" e la soglia di significatività fu fissata a P < 0,05. L'analisi GO ha coperto il processo biologico (BP), la componente cellulare (CC) e la funzione molecolare (MF)²³. I risultati sono stati ordinati in base al numero di bersagli arricchiti. Le vie relative al metabolismo umano e alle malattie sono state quindi escluse, e le prime 20 vie KEGG sono state selezionate per la visualizzazione. Successivamente fu costruita una rete multidimensionale "componente-malattia-KEGG" utilizzando software di analisi di rete.

Analisi dell'agganciamento molecolare
I primi 10 costituenti attivi principali e i primi 10 target principali sono stati selezionati per l'analisi del docking molecolare utilizzando AutoDockTools e il software^{PyMOL 24,25}. I file PDB dei target chiave sono stati scaricati da un database di strutture^{proteiche 26}, e i file SDF dei principali componenti attivi sono stati ottenuti da un database^{chimico 27}. Le molecole proteiche venivano poi preprocessate utilizzando software di docking molecolare, che includeva desalinizzazione, idrogenazione e calcolo della carica. L'attracco semi-flessibile veniva eseguito utilizzando una griglia che copriva l'intero sito di legame proteico. Il processo di attracco fu considerato positivo quando l'energia di legame era negativa e la deviazione quadratica media (RMSD) della posa superiore era ≤ 2,0 Å. Dopo l'aggancio, i risultati dei principali componenti attivi di QUF3 con i bersagli principali sono stati visualizzati utilizzando software di visualizzazione molecolare.

Simulazioni di dinamica molecolare (MD)
Le simulazioni MD del complesso proteina–ligando sono state effettuate utilizzando il software GROMACS per esplorare l'interazione tra recettori e^{liganti 28,29}. Il campo di forza ambra99sb-ildn e il campo di forza generale Amber (GAFF) sono stati utilizzati per generare rispettivamente i parametri e le topologie di proteine e liganti. La dimensione della scatola di simulazione è stata impostata in modo che la distanza tra ciascun atomo proteico e il bordo della scatola fosse superiore a 1,0 nm. La scatola veniva riempita con un solvente esplicito utilizzando il semplice modello di carica puntuale (molecole d'acqua SPC216), e le molecole d'acqua venivano sostituite con contatori Na⁺ e Cl⁻ per rendere il sistema di simulazione elettricamente neutro. L'intero sistema fu ottimizzato con il metodo della discesa più ripida per ridurre contatti irragionevoli o sovrapposizioni atomiche. Un pre-bilanciamento sufficiente del sistema di simulazione è stato raggiunto eseguendo ensemble NVT e NPT per 100 ps ciascuno a 300 K e 1 bar, rispettivamente. Successivamente, è stata eseguita una simulazione MD a 100 ns in condizioni al contorno periodiche, con temperatura (300 K) e pressione (1 bar) controllate rispettivamente dai metodi V-rescale e Parrinello-Rahman,^{rispettivamente a 30}. Le equazioni newtoniane del moto furono risolte usando l'integratore leapfrog con un passo temporale di 2 fs. Le interazioni elettrostatiche a lungo raggio sono state calcolate utilizzando il metodo Particle Mesh Ewald (PME) con una spaziatura di Fourier di 0,16 nm, e tutte le lunghezze dei legami sono state vincolate usando il metodo LINCS. Il software VMD veniva utilizzato per visualizzare, analizzare e animare le^{traiettorie 31}. L'energia libera di legame di ciascun composto veniva calcolata utilizzando uno script di calcolo dell'energia libera di legame.

Analisi delle componenti principali (PCA), paesaggio energetico libero (FEL) e analisi dinamica a matrice di correlazione incrociata (DCCM)
La PCA è stata condotta utilizzando software di simulazione MD per analizzare i movimenti conformazionali dominanti dei complessi apo e legati ai ligandi. Sono state generate matrici di covarianza delle fluttuazioni atomiche Cα, dalle quali sono stati ottenuti autovettori (moti collettivi) e autovalori (magnitudine del movimento^{) 32}. Attraverso questa analisi sono state identificate regioni dinamiche chiave e flessibilità strutturale associate al legame dei liganti. Le traiettorie molecolari sono state proiettate sui primi due componenti principali (PC1 e PC2) utilizzando lo strumento GMX Anaeig, catturando così i movimenti^{essenziali 33}. Solo i 100 ns finali equilibrati (fase stabile RMSD) sono stati utilizzati per i calcoli PCA e FEL. FEL è stato derivato dai dati PCA utilizzando GMX sham per calcolare l'energia libera^{di Gibbs 34}, rivelando conformazioni stabili e minimi energetici che riflettono la diversità conformazionale e le transizioni di stato. L'analisi dinamica a matrice di correlazione incrociata (DCCM) degli atomi di Cα è stata effettuata per valutare la dinamica strutturale e l'accoppiamento del movimento^{inter-residuo 35}. Questa analisi ha chiarito la stabilità, le interazioni intermolecolari e i movimenti collettivi dei complessi proteina-ligando. Il coefficiente di correlazione incrociato Cij tra i e j è stato calcolato come:

Nella formula, le lettere i e j rappresentano gli atomi di Cα di due residui. Quando il valore di Cij è positivo e maggiore di zero; i due atomi che si muovono nella stessa direzione sono considerati in moto correlato. Quando il valore di Cij è negativo e inferiore a zero, i due atomi che si muovono in direzioni opposte sono considerati in moto anticorrelato. Un valore Cij pari a zero indica che non c'è alcuna relazione tra i movimenti dei due atomi. Inoltre, i valori di Cij superiori a 0,7 sono stati interpretati come movimenti fortemente correlati (positivi) o fortemente anti-correlati (negativi). Per verificare la convergenza, sono stati esaminati i profili RMSD e Rg. I profili stabili confermarono che gli ultimi 100 ns erano sufficienti per l'analisi DCCM. Questi schemi di movimento hanno rivelato come il legame dei liganti moduli la comunicazione intramolecolare e i riarrangiamenti dei domini. Per garantire stabilità dinamica e convergenza, sono stati analizzati solo gli ultimi 100 ns di traiettorie equilibrate e sono state visualizzate mappe di correlazione per evidenziare regioni con interazione dinamica significativa.

Per spiegare meglio l'energia di interazione tra proteine e ligandi, è stato utilizzato uno script di calcolo dell'energia libera di legame per calcolare l'energia di legame di tutti i complessi proteina-ligando in equilibrio. Nell'applicazione del metodo di calcolo dell'energia libera^{di legame 36}, l'energia totale di legame è stata scomposta in quattro parti indipendenti: interazione elettrostatica, interazione di van der Waals, solvatazione polare e interazione di solvtazione non polare. Il termine di solvtazione non polare è solitamente chiamato SASA.

Conclusione del punto finale procedurale per la selezione del bersaglio e del percorso
Al termine del workflow, sono stati selezionati i target e i percorsi validati finali sulla base dei seguenti criteri: target core con i valori di grado più alti di 10 nella rete PPI e costituenti attivi chiave con i valori di grado più alti di 10 nella rete H-C-T. Per i percorsi KEGG, escludendo quelli relativi al metabolismo umano e alle malattie, i primi 20 percorsi sono stati classificati e selezionati in base al numero di bersagli arricchiti. I risultati della simulazione MD sono stati utilizzati per confermare un legame stabile tra i costituenti superiori e i bersagli centrali. Questi passaggi definivano collettivamente l'output finale del protocollo.

Risultati

Screening dei costituenti attivi e dei potenziali bersagli di QUF3
Utilizzando OB ≥ 30% e DL ≥ 0,18 come criteri di screening, dopo aver consultato il database TCMSP, QUF3 ha identificato 126 componenti chimici. Tra questi, Paeoniae Radix Alba (Baishao) conteneva 13 costituenti attivi, Rehmanniae Radix Praeparata (Shudihuang) ne conteneva 2, Cuscutae Semen (Tusizi) ne conteneva 13, Fructus Ligustri Lucidi (Nvzhenzi) ne conteneva 13, Herba Taxilli (Sangjisheng) ne conteneva 2, Radix Salviae (Danshen) n...

Discussione

Ci sono sempre più evidenze che l'endometrio delle pazienti con PCOS mostra una funzione compromessa, che può correlata a tassi più elevati di fallimento dell'impianto e esiti avversi alla^{gravidanza 40}. Le differenze endometriali nelle donne con PCOS sono principalmente caratterizzate da una diminuzione dell'espressione di pinopodi, sistemi di canali nucleolari, recettori per estrogeni e recettori del progesterone durante la finestra di impiantamento (WOI)

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (Versione 2.3)	Lab of Systems Pharmacology	https://www.tcmsp-e.com/load_intro.php?id=43	Database per lo screening dei componenti attivi
Swiss Target Prediction online database (versione 2019)	Molecular Modelling Group, University of Lausanne & SIB Swiss Institute of Bioinformatics	http://www.swisstargetprediction.ch/	Database di previsione dei target online
PubChem database	National Library of Medicine, NIH	https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/	Database chimico per il recupero di SMILES/SDF dei composti
UniProt database	NIH	https://www.uniprot.org/uniprotkb	Database di proteine per ID UniProt e nomi di geni
Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM)	Johns Hopkins University	https://www.omim.org/	Database di target delle malattie
DrugBank	University of Alberta	https://www.drugbank.ca/	Database di target delle malattie
Therapeutic Target Database (TTD)	Zhejiang University	https://ttd.idrblab.cn/	Database di target delle malattie
GeneCards (Versione 5.26)	Weizmann Institute of Science, LifeMap Sciences	https://www.genecards.org/	Database di target delle malattie (punteggio di rilevanza >5)
Venny visualization platform (Versione 2.1.0)	Centro Nacional de Biotecnología (CNB-CSIC)	https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/	Strumento online di diagramma di Venn per la visualizzazione dell'intersezione dei target
Cytoscape (Versione 3.10.3)	National Resource for Network Biology, NHGRI	https://cytoscape.org/	Software di analisi e visualizzazione di rete per H-C-T, PPI e reti di vie
STRING database (Versione 12.0)	STRING Consortium	https://string-db.org/	Database di interazione proteina-proteina per la costruzione di reti PPI
DAVID database (Versione v2025-2)	U.S. Department of Health & Human Services, NIH	https://davidbioinformatics.nih.gov/	Database di analisi di arricchimento genico per GO e KEGG
AutoDockTools (Versione 1.5.7)	The Scripps Research Institute	https://autodock.scripps.edu/	Software di docking molecolare per il pre-processing e il calcolo
PyMOL software (Versione 3.0.3)	Schrödinger	https://pymol.org/	Software di visualizzazione molecolare per la visualizzazione del docking
Protein Data Bank (PDB)	RCSB	https://www.rcsb.org/	Database di strutture proteiche per il download dei file PDB dei target
GROMACS (Versione 2023.2)	GROMACS development team	https://www.gromacs.org/	Software di simulazione dinamica molecolare
VMD (Versione 1.9.3)	University of Illinois	https://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/	Software di visualizzazione molecolare e analisi delle traiettorie
gmx_MMPBSA	Open-source (GitHub)	https://github.com/Valdes-Tresanco-MS/gmx_MMPBSA	Strumento di calcolo dell'energia di legame libera dalle traiettorie MD
Science Data Bank	Chinese Academy of Sciences, Computer Network Information Center	https://www.scidb.cn/	Repository di dati scientifici per la disponibilità e la deposizione dei dati