Test unitario formativo di colonie adattato per cellule mononucleari derivate dal paziente nel midollo osseo e nel sangue periferico

Sommario

Questo protocollo delinea una procedura per indurre la differenziazione delle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche umane derivate dal midollo osseo del paziente e dalle cellule mononucleari del sangue periferico. Il test utilizza un mezzo di coltura semisolida che supporta l'impegno della linea eritroide e mieloide e incorpora metriche standardizzate per la classificazione delle colonie riproducibili per la caratterizzazione preclinica dei farmaci.

Abstract

Il saggio dell'unità formativa di colonie (CFU) è una tecnica fondamentale per studiare le malattie ematologiche, incluse le sindromi mielodispasiche (MDS) e la leucemia mieloide acuta (LMA). Questo saggio impiega mezzi semisolidi integrati con combinazioni definite di citochine per supportare la crescita tridimensionale e la differenziazione specifica per linea di linea di cellule progenitrici eritroidi e mieloidi. Tuttavia, i campioni di sangue periferico e midollo osseo derivati dal paziente presentano sfide tecniche a causa della ridotta viabilità, dell'aumento della sensibilità alla manipolazione e della variabilità nella crescita delle colonie. Inoltre, le linee guida esistenti per l'identificazione e il conteggio delle colonie mostrano una notevole variabilità nella definizione della dimensione e dei tipi di linea di discendenza della colonia, limitando la riproducibilità tra gli studi. Il protocollo qui descritto è ottimizzato per la crescita e la differenziazione di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche isolate da campioni di pazienti con MDS e AML. Il protocollo enfatizza una gestione delicata delle cellule, l'elaborazione sterile dei campioni del paziente, condizioni di coltura ottimizzate e durate di crescita adattate alle cellule derivate dal paziente. Questo protocollo fornisce un quadro pratico per i test CFU utilizzando campioni derivati dal paziente e stabilisce una metrica standard per il conteggio e l'analisi coerenti delle colonie nella ricerca sulle malignità ematologiche.

Introduzione

L'ematopoiesi è un processo strettamente regolato in cui le cellule staminali ematopoietiche (HSC) presenti nelle nicchie del midollo osseo danno origine a tutte le linee cellulari sanguigniche mature. Attraverso una serie gerarchica di eventi di differenziazione, gli HSC generano progenitori multipotenti che si impegnano progressivamente nelle linee eritroide, mieloidi e linfoidi prima di maturare terminalmente in cellule sanguigni funzionali circolanti. Questo processo è governato da segnalazione coordinata all'interno del microambiente del midollo osseo e da meccanismi intrinseci di regolazione trascrizionale ed epigenetica. Le interruzioni di queste vie regolatorie, in particolare attraverso l'accumulo di mutazioni genetiche o somatiche negli HSC, possono compromettere la differenziazione normale e portare all'espansione clonale di progenitori anomali. Tali alterazioni possono infine portare a disturbi ematologici caratterizzati da ematopoiesi e citopenie inefficaci, incluse le sindromi mielodisplastiche (MDS) e la leucemia mieloide acuta (^LMA)1,2,3,4,5.

Il saggio dell'unità formatrice di colonie (CFU) è una tecnica ben consolidata in vitro per valutare il potenziale di differenziazione delle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC). Originariamente sviluppato come test a breve termine per misurare la capacità proliferativa e di differenziazione dei progenitori ematopoietici ^6,7,8, il test CFU è diventato da allora uno strumento ampiamente utilizzato sia nell'ematologia clinica che^{in quella sperimentale 9}. In ambito di laboratorio preclinico, il saggio viene frequentemente utilizzato per valutare l'impatto di perturbazioni genetiche o di terapie candidate sulla differenziazione ematopoietica. Nel contesto della ricerca su MDS e AML, i test CFU forniscono una lettura funzionale per comprendere come le alterazioni molecolari e genetiche influenzino la capacità di differenziazione del midollo osseo o delle cellule del sangue periferico derivate dal paziente.

Il saggio CFU prevede la coltura degli HSPC in un mezzo semisolido a base di metilcellulosa, integrato con fattori di crescita definiti che supportano l'espansione e la differenziazione specifiche per linea. In queste condizioni, le cellule progenitrici proliferano e danno origine a colonie discrete, che possono essere classificate morfologicamente in base all'identità della linea di discendenza. In questo protocollo viene utilizzato un mezzo semisolido a base di metilcellulosa disponibile e ottimizzato per la differenziazione eritroide e mieloide. Il mezzo contiene una combinazione di citochine, tra cui interleuchina-3 (IL-3), interleuchina-6 (IL-6), fattore delle cellule staminali (SCF), eritropoietina (EPO), fattore stimolante della colonia granulocita (G-CSF) e fattore stimolante della colonia granulociti-macrofagi (GM-CSF). Insieme, questi fattori supportano la crescita dei progenitori eritroidi come i progenitori unitari-formanti di colonie (CFU-E) e gli eritroidi unitari burst-forming (BFU-E), i progenitori dei granulociti-macrofagi mieloidi (CFU-GM) e i progenitori multipotenti come i progenitori di granulociti, eritrociti, monociti, megacariociti (CFU-GEMM^)10,11.

Nonostante la sua ampia utilità, il mezzo semisolido sopra menzionato è limitato nella sua capacità di differenziazione, poiché non supporta adeguatamente la differenziazione di megacariociti e piastrine. Per queste applicazioni, sono più appropriate formulazioni più specializzate contenenti fattori di crescita piastrinica; tuttavia, essi sono fuori dalla portata del protocollo descritto. Nel complesso, attraverso un'attenta selezione della formulazione dei mezzi combinata con la valutazione morfologica e analisi a valle come la citometria a flusso, i ricercatori possono valutare efficacemente la sensibilità dei farmaci attraverso l'analisi dell'impegno della linea e del potenziale^{di differenziazione 12}.

In questo studio, il saggio CFU viene utilizzato per indagare il potenziale terapeutico delle terapie combinate per il trattamento della MDS ricadente/refrattaria ad alto rischio. La pirimetamina è un antifolato clinicamente approvato utilizzato per trattare la toxoplasmosi e la malaria parassita, ed è stato recentemente studiato come agente anticancro 13,14,15. Studi recenti hanno dimostrato che il trattamento con pirimetamina può agire attraverso l'inibizione di vie chiave che regolano la sintesi de novo della^{pirimidina 16}. In questo protocollo, i saghi CFU vengono utilizzati per indagare l'efficacia clinica della pirimetamina come terapia a singolo agente e come terapia combinata con Venetoclax, che è attualmente una terapia di prima linea per il trattamento MDS e^{AML 17,18}.

Nonostante la sua ampia utilità, il test CFU presenta diverse limitazioni tecniche. L'identificazione e la classificazione delle colonie si basano fortemente su criteri morfologici, che possono introdurre variabilità tra osservatori e tra i centri^{di ricerca} 6,19,20,21. Inoltre, i campioni derivati da pazienti da individui con MDS o AML spesso mostrano una ridotta vitalità cellulare, maggiore fragilità ed eterogeneità, il che può complicare la formazione delle colonie e le analisi a^{valle 9}. La preparazione delle colonie per ulteriori caratterizzazioni, inclusa la citometria a flusso, può quindi richiedere una gestione attenta per preservare l'integrità cellulare. L'assenza di procedure standardizzate per l'identificazione, il conteggio e l'analisi a valle contribuisce ulteriormente alla variabilità tra gli studi. Queste considerazioni tecniche evidenziano la necessità di procedure standardizzate ottimizzate specificamente per campioni ematopoietici derivati dal paziente.

Questo protocollo delinea un flusso di lavoro ottimizzato per l'esecuzione di saghi CFU utilizzando cellule mononucleari derivate da campioni di midollo osseo primario o di sangue periferico di pazienti con neoplasie ematologiche. L'approccio si concentra su strategie pratiche per la gestione di cellule sensibili derivate dal paziente, l'istituzione di condizioni di coltura affidabili e l'implementazione di criteri coerenti per l'identificazione e quantificazione delle colonie. Fornendo indicazioni metodologiche dettagliate e enfatizzando pratiche di analisi riproducibili, questo protocollo mira a facilitare una valutazione più affidabile della differenziazione ematopoietica e della risposta terapeutica negli studi preclinici di MDS e AML.

Protocollo

Questo studio utilizza biocampioni umani deidentificati ottenuti da una biobanca secondo un protocollo approvato dall'Institutional Review Board, "Biologia Molecolare dei Disturbi Ematologici Benigni e Maligni" (Protocollo IRB #200536), presso l'Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center. Tutte le procedure sono state condotte in conformità con le linee guida etiche istituzionali. Tutti i reagenti e le attrezzature sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione di cellule mononucleari derivate dal paziente del midollo osseo o del sangue periferico

NOTA: Secondo le linee guida comuni per la gestione dei campioni dei pazienti, si raccomanda indossare un camice lungo e usa e getta resistenti alle lacerazioni da laboratorio e lavorare sotto un cappuccio per la coltura cellulare di laboratorio per protezione personale dall'esposizione a patogeni trasmessi dal sangue. Tutte le punte delle pipette e le pipete sierologiche che entrano a contatto con le cellule del paziente devono essere immerse in una soluzione di candeggina al 10% per almeno 30 minuti prima dello smaltimento nei rifiuti biologici.

1. Preparazione sperimentale
   1. Mediano IMDM caldo, siero bovino fetale (FBS) e antibiotici penicillina-streptomicina (Pen-streptococco) a 37 °C per almeno 30 minuti.
   2. Scongelare il substrato semisolido a 4 °C durante la notte. Il giorno della impiattazione, riscalda la bottiglia a temperatura ambiente (RT) per almeno 30 minuti.
   3. Sterilizza la cappa di coltura cellulare con sterilizzazione UV per 15 minuti, poi spruzza le superfici della cappa, le pipette e i rack a tubi con etanolo al 70% (EtOH).
   4. Prepara un becher di scarto contenente una soluzione di candeggina al 10% abbastanza grande da poter raccogliere le punte e le pipette sierologiche contaminate.
   5. Ottenete cellule mononucleari del midollo osseo o del sangue periferico isolate tramite centrifugazione a gradiente di densità. Le cellule possono essere utilizzate lo stesso giorno della raccolta o da campioni congelati bio-bancati.
2. Se i campioni sono congelati, si scongelano rapidamente in un bagno d'acqua a 37 °C finché la maggior parte del ghiaccio non si scioglie e rimane solo un piccolo cristallo di ghiaccio. Metti immediatamente i campioni sul ghiaccio dopo lo scongelamento.
   NOTA: I campioni dei pazienti sono molto sensibili allo scongelamento. È importante scongelare i campioni il più rapidamente possibile e a lotti per minimizzare la morte cellulare.
3. Sospendere le cellule in 5 mL di mezzo di crescita completo riscaldato (mezzo IMDM integrato con FBS al 4% e 1% Pen-Strep).
4. Determina la concentrazione e la vitalità cellulare usando colorante AO/PI e un contatore cellulare automatico.
5. Centrifuga le celle a 350 x g per 5 minuti a temperatura ambiente per pelletare le cellule. Scarta il soprantantante.
6. Risospendere le cellule in soluzione salina di Dulbecco sterile (DPBS) sterile di Dulbecco. Ripeti la centrifugazione con le celle pellet e scarta il soprannatante.
7. Sospendere le cellule in un mezzo di crescita completo fino a una concentrazione di 2 milioni di cellule vive/mL. Prepara abbastanza celle per 100K celle per pozzo di una piastra a 6 pozzi.

2. Preparazione e somministrazione dei farmaci.

NOTA: La pirimetamina si ottiene come polvere liofilizzata ed è ricostituita internamente in dimetilsolfosida (DMSO) a una concentrazione di 100 mM; le aliquote sono immagazzinate a −80 °C. Venetoclax viene acquistato predisciolto in DMSO a una concentrazione di 10 mM ed è conservato a -20 °C. Per questo esperimento, venetoclax e pirimetamina vengono somministrati come dose singola tramite libera assorbimento in parallelo a una condizione di trattamento DMSO a controllo veicolo.
ATTENZIONE: Pirimetamina, venetoclax e DMSO sono agenti biopericolosi. Maneggiare solo sotto il cappuccio, indossare DPI e usare con particolare cautela.

1. Il giorno della piattinatura, scongela l'aliquota del farmaco su un turbine con il vortice e gira alla massima velocità su una mini centrifuga da tavolo per 30 secondi.
2. Vortice e mescolare vigorosamente una bottiglia di substrato semisolido finché tutti i componenti non sono omogeneizzati. Lascia indisturbata nella cappa a temperatura ambiente per 30 minuti per permettere alle bolle di salire in superficie.
3. Prepara 3 mL aliquote di substrato semisolido in tubi conici sterili da 15 mL. Lascia che i tubi rimangano indisturbati per 30 minuti per permettere alle bolle di salire in superficie. Le aliquote di mezzo semisolido extra possono essere ricongelate e conservate a -20 °C per un uso successivo.
4. Non aggiungere più di 10 μL di volume del farmaco al mezzo semisolido. Per questo esperimento, le concentrazioni di venetoclax e pirimetamina vengono regolate in base a condizioni sinergiche determinate empiricamente. A un gruppo di controllo veicolo, aggiungi volumi equivalenti di DMSO. Prepara duplicati di 3 mL aliquote per ogni condizione.
   NOTA: È importante mantenere il volume di farmaco aggiunto trascurabile in modo che non influisca sulla concentrazione finale del farmaco nel mezzo semisolido.
5. Media vortice in 4–5 brevi raffiche per incorporare completamente il farmaco nel substrato.
   NOTA: Non tenere la miscela cellulare sul vortexe per lunghi periodi di tempo, poiché ciò potrebbe causare la morte cellulare.
6. Aggiungere 100 μL di celle o un volume equivalente di 200.000 celle ai 3 mL aliquote di mezzo semisolido. Miscela vortice in brevi raffiche fino a quando non è completamente incorporata/omogeneizzata.
7. Attacca un ago smussato da 16 G a una siringa da 3 mL e inserisci l'ago e la siringa nella miscela cellulare. Lascia indisturbare per 30 minuti per permettere alle bolle di salire in superficie.

3. Placcatura della sospensione cellulare trattata con farmaci.

1. Utilizzando un ago sommerso e una siringa, raccogli la miscela di cellule e farmaci, facendo attenzione a non aspirare bolle d'aria. Aspettare 3–5 minuti, poi raccogliere la miscela residua che si è raccolta sui lati del tubo conico da 15 mL.
2. In una piastra sterile a 6 pozzi, si aggiunge la miscela cellulare a gocce, alternando grandi gocce tra due pozzi di una colonna esterna della piastrella. Distribuisci la miscela inclinando delicatamente la piastra in movimenti circolari per coprire uniformemente l'intero fondo dei pozzi. Questi due pozzi costituiscono repliche tecniche.
   NOTA: Se si formano bolle o vengono accidentalmente aggiunte ai pozzi, usa una punta filtro a pipetta per far scoppiare o spostare delicatamente le bolle sul bordo della piastrella. Eventuali bolle grandi rimaste nella placca possono influenzare la crescita delle colonie.
3. Aggiungere la miscela per il saggio coloniale solo alle colonne esterne della piastra a 6 pozzi. Alla colonna centrale, aggiungi 5 mL di acqua sterile in ogni pozzo. Aggiungere acqua ai pozzi garantirà che sia presente abbastanza umidità per evitare che il mezzo semisolido si secchi.
4. Incubare la piastra in un incubatore a 37 °C con il 5% di_CO2. Monitora la crescita cellulare e i livelli di acqua 2 volte a settimana. Le cellule dovrebbero formare colonie visibili a occhio nudo intorno ai 7 giorni dopo la placcatura, e le placche dovrebbero raggiungere una confluenza del 75%–80% tra i 14 e i 21 giorni dopo la placcatura.

4. Imaging e conteggio delle colonie

NOTA: Questo protocollo descrive parametri validati per l'uso sul sistema di imaging EVOS M7000. Queste impostazioni potrebbero dover essere ottimizzate o adattate per essere compatibili con altri sistemi di imaging a lastre.

1. Rimuovi il coperchio protettivo del filtro luminoso dalla piattaforma del microscopio. Accendi il microscopio e apri il programma software associato.
2. Inserire un diffusore di luce nella lente superiore dell'apparecchio microscopico.
3. Inserisci la posizione della piastra sulla piattaforma in modo che il pozzo A1 sia nell'angolo in alto a sinistra.
4. Nel software di imaging, inserisci le seguenti impostazioni di messa a fuoco:
   1. Seleziona il recipiente da fotografare. In questo protocollo viene utilizzata una piastra a 6 pozzi.
   2. Imposta l'obiettivo su 4X.
   3. Seleziona la sorgente luminosa come Trans o imposta il microscopio in modalità campo luminoso.
   4. Accendi la luce del microscopio e regola manualmente l'intensità della luce usando il cursore grossolan. Per lo strumento utilizzato in questo protocollo, l'intervallo ottimale per le colonie di imaging è intorno a 0,03.
   5. Se c'è una funzione di autofocus sullo strumento, usala per regolare la messa a fuoco. Se necessario, regola ulteriormente la messa a fuoco usando le impostazioni manuali di messa a fuoco fine.
5. Inserisci le seguenti impostazioni di cattura automatica dell'immagine:
   1. Seleziona l'intera area del pozzo da fotografare in ciascun pozzo.
   2. Seleziona la cattura automatica dell'immagine per iniziare dal centro del pozzo e spingersi verso i bordi del pozzo.
   3. Seleziona le impostazioni di autofocus in modo che lo strumento si rifocali in ogni pozzo.
   4. Seleziona che le immagini raw in ogni pozzo vengano tillate/unite insieme.
   5. Seleziona che le immagini siano invertite orizzontalmente e verticalmente.
   6. Seleziona le impostazioni di salvataggio dati per raccogliere "immagine a tiled" e "immagine fusa"
   7. Esegui la scansione automatica delle targhe. Lo strumento utilizzato in questo protocollo funzionerà a una velocità di 1,5 min/pozzo.
   8. Rimuovi la placca, posiziona il coperchio protettivo del filtro sulla piattaforma del microscopio, spegni il microscopio e chiudi il software.
   9. Dopo l'imaging, contare manualmente il totale delle singole colonie, così come i sottotipi mieloidi ed eritroidi in ciascun pozzo utilizzando le immagini del pozzo fuso a tielle.
6. Definire le colonie secondo la seguente caratterizzazione morfologica:
   1. Si consideri una singola colonia o un gruppo di colonie distinto quando è sufficientemente lontano da un'altra popolazione cellulare, a una distanza pari alla propria lunghezza. Le popolazioni che si trovano entro questo limite di distanza sono raggruppate in un unico conteggio di colonie.
   2. Assicurati che le colonie eritroidi siano profondamente pigmentate e appaiono di colore rosso scuro. Queste colonie appaiono come popolazioni singole o gruppi di crescita densa con bordi chiaramente definiti. Le colonie eritroidi più piccole costituite da popolazioni cellulari immature a crescita lenta sono classificate come CFU-E. Le colonie più grandi con popolazioni più mature sono classificate come BFU-E.
   3. Controlla che le colonie mieloidi contengano cellule che appaiono più traslucide e di colore più chiaro. Le colonie mieloidi sono più disperse e non contengono bordi ben definiti. Le colonie mieloidi tendono a crescere più spesso come singole popolazioni piuttosto che come cluster, anche se occasionalmente possono essere osservati gruppi. In entrambi i casi, le colonie mieloidi sono classificate come CFU-GM.
   4. Classificare le colonie miste che contengono sia sottotipi eritroidi che mieloidi come CFU-GEMM.

5. Raccolta e congelamento cellulare per analisi a valle tramite citometria di flusso

1. Esegui i passaggi seguenti prima di iniziare:
   1. a. Prepara e riscalda il tampone di selezione delle celle attivate dalla fluorescenza (FACS buffer, composto da DPBS/4% FBS) e il mezzo congelante (FBS/10% DMSO) in un bagno d'acqua a 37 °C per almeno 30 minuti.
2. Aggiungi 5 mL di tampone FACS riscaldato alla superficie di ogni pozzo. Incubare le piastre per almeno 30 minuti in un incubatore a 37 °C per sciogliere il substrato semisolido.
3. Sospensa completamente le cellule usando una pipetta da 5 mL e trasferisci in un tubo conico sterile da 50 mL.
4. Utilizzando 5 mL di tampone FACS riscaldato, lava ogni pozzo 3 volte e trasferisci l'intero volume nel tubo conico da 50 mL.
5. Risospendere bene le celle vortexando in 4–5 brevi raffiche, poi centrifugare a 400 x g per 10 minuti a RT verso le celle del pellet. Se il pellet non è visibile dopo la centrifugazione, le cellule rimangono sospese in un mezzo semisolido. Senza aspirare, aggiungere un DPBS extra di 10–15 mL al tubo per diluire ulteriormente il mezzo semisolido e risospendere bene. Se necessario, incubare a 37 °C per 10–15 minuti per sciogliere completamente il mezzo, poi riapplicare le cellule a pellet.
6. Aspirare il soprandanante e risospendere le cellule in un buffer FACS da 10 mL. Centrifugare a 400 x g per 10 minuti a RT verso le celle del pellet.
7. Sospenso cellule in mezzo congelante e aliquota 3 milioni di cellule/crioviale. Congelare le fiale in un contenitore di congelamento a tasso controllato a -80 °C per 24 ore per ottenere un tasso di raffreddamento di 1 °C /min.
8. Trasferire i cryovials nella stoccazione di azoto liquido il prima possibile.
   NOTA: I campioni conservati a -20 °C per lunghi periodi avranno una vitalità ridotta. È importante spostare le celle in azoto liquido per la conservazione a lungo termine.

Risultati

La Figura 1 illustra la pipeline di saggio delle colonie dall'isolamento del campione del paziente fino all'analisi del conteggio e della morfologia delle colonie. La Figura 2 mostra le impostazioni chiave per l'imaging delle colonie su un microscopio da campo chiaro. La Figura 3 e la Figura 4 mostrano immagini rappresentative della formazione d...

Discussione

Il protocollo descritto qui delinea un flusso di lavoro ottimizzato per eseguire i test CFU utilizzando campioni primari di midollo osseo e sangue periferico dei pazienti, con particolare attenzione al mantenimento della vitalità cellulare e alla garanzia della crescita riproducibile della colonia. Diversi passaggi del protocollo sono fondamentali per ottenere una formazione affidabile delle colonie quando si lavora con campioni derivati dal paziente. Lo scongelamento rapido delle cellul...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Blunt-End 16 G needles	STEMCELL Technologies	28110	per l'erogazione e la messa in piastra dei media MethoCult
Cellometer Auto 2000	Nexelcom Bioscience	26407	contatore cellulare
CHT4 Counting Chambers (diapositive per contatore cellulare)	Revvity	CHT4-SD100-002	diapositive per contatore cellulare
Dimethyl sulfoxide	Fisher Bioreagents	BP231-100	utilizzato per la ricostituzione dei farmaci e il media per il congelamento cellulare
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537	per la coltura cellulare
Ethanol 200 proof	Decon Laboratories, Inc.	2701	per la sterilizzazione delle superfici di coltura cellulare
EVOS M7000 imaging system	ThermoFisher Scientific	AMF7000	per l'imaging di colonie e piastre
Fetal bovine serum	BenchMark	100-106	supplemento media per la coltura cellulare e il congelamento
IMDM Modified Culture media	Cytiva	SH30228.01	media di coltura arricchita adatta per la gestione di campioni di pazienti
LuerLok Tip 3 mL Syringes	BD	309657	per l'erogazione e la messa in piastra dei media MethoCult
MethoCult H4435 Enriched	STEMCELL Technologies	04435	media semisolido a base di metilcellulosa per l'analisi delle colonie
Multiwell 6-well plate	FALCON	353046	per la messa in piastra dell'analisi delle colonie
Nikon Eclipse TS2FL Inverted Trinocular Phase Contrast Fluorescence Microscope	Coastal Microscopes	51623	Per l'imaging e la caratterizzazione della morfologia delle colonie
Pen Strep	Gibco	15140-122	supplemento antibiotico per la coltura cellulare
pyrimethamine	Sigma-Aldrich	46706	antifolato approvato dalla FDA
UltraPure Distilled water	Invitrogen	10977-015	per la messa in piastra dell'analisi delle colonie
venetoclax	Selleck Chemical LLC	50-136-6419	chemioterapia approvata dalla FDA
ViaStain AOPI Staining Solution	Revvity	CS2-0106	colorazione per la vitalità per il conteggio delle cellule vive