Analisi bioinformatica pan-oncologica combinata con validazione sperimentale del cancro del colon: uno studio su TMED3 come biomarcatore diagnostico e prognostico

Sommario

Questo protocollo combina analisi bioinformatica pan-oncologica con validazione immunoistochimica nel cancro al colon per valutare l'espressione del Dominio 3 di trasporto proteico Transmembrana Emp24, la significanza prognostica, le associazioni immunitarie e le vie biologiche correlate utilizzando database multiomici pubblici e campioni di tessuto clinico.

Abstract

Il Dominio di Trasporto Proteico Transmembrana Emp24 3 (TMED3), membro della famiglia delle proteine p24, è stato implicato nella proliferazione, invasione e migrazione tumorale. Questo studio mirava a valutare i modelli di espressione, la rilevanza prognostica, le associazioni immunitarie e le potenziali funzioni biologiche di TMED3 in più tipi di cancro, utilizzando analisi bioinformatica pan-oncologica combinata con la validazione immunoistochimica (IHC) nel cancro al colon. Sono stati analizzati dataset multiomiche provenienti da The Cancer Genome Atlas, Genotype-Tissue Expression, UALCAN, Human Protein Atlas e cBioPortal per indagare l'espressione di TMED3 e le alterazioni genetiche nel pan-tumore. È stata eseguita un'immunoistochimica per valutare l'espressione della proteina TMED3 nei tessuti tumorali del colon. L'analisi di sopravvivenza di Kaplan–Meier e l'analisi di regressione di Cox sono state utilizzate per valutare il valore prognostico di TMED3. L'analisi di correlazione di Spearman è stata condotta per valutare le associazioni di TMED3 con il carico mutazionale tumorale, l'instabilità dei microsatelliti (MSI), l'infiltrazione delle cellule immunitarie e i checkpoint immunitari. È stata effettuata un'analisi di arricchimento del set genico per indagare potenziali vie biologiche associate a TMED3 nel cancro al colon. L'espressione di TMED3 era elevata nella maggior parte dei tipi tumorali ed era associata a una sopravvivenza complessiva sfavorevole e specifica per la malattia nel carcinoma adrenocorticale, adenocarcinoma del colon e melanoma uveale. La massima frequenza di alterazioni genetiche di TMED3 è stata identificata nel mesotelioma, con l'amplificazione che rappresenta il tipo di alterazione predominante. Inoltre, l'espressione di TMED3 ha mostrato correlazioni significative con il carico mutazionale tumorale e l'instabilità dei microsatelliti nel carcinoma a cellule chiare renali, nell'adenocarcinoma gastrico e nel carcinoma endometriale del corpo uterino. L'espressione di TMED3 era inoltre associata all'infiltrazione immunitaria e all'espressione dei checkpoint immunitari in diversi tumori. L'analisi IHC ha mostrato un aumento dell'espressione di TMED3 nei tessuti del tumore del colon rispetto ai tessuti normali del colon e ha mostrato un'associazione con lo stadio T. L'analisi dell'arricchimento funzionale ha identificato vie correlate al ribosoma, al processamento e alla presentazione dell'antigene, alla fosforilazione ossidativa e al pentosio fosfato. Questi risultati indicano che TMED3 potrebbe rappresentare un biomarcatore promettente per la diagnosi e la valutazione prognostica del cancro al colon e di altri tipi di tumori.

Introduzione

La famiglia proteica Transmembrane Emp24 Domain (TMED) è composta da quattro sottofamiglie (α, β, γ e δ) che comunemente esistono come monomeri, dimeri o complessi oligomerici nelle cellule eucariotiche. I membri della famiglia TMED sono coinvolti nel traffico intracellulare di vescicole e sono stati implicati in una varietà di malattie umane, tra cui cancro, disturbi immunitari, diabete, malattie neurodegenerative, fegato grasso non alcolico, cardiomiopatia dilatata, malattia renale mucina 1 (MKD) e sindrome di Sjögren (SS⁾¹. La proteina transmembrana contenente il dominio EMP24 3 (TMED3), membro della famiglia delle proteine p24, è una proteina transmembrana di tipo I a passaggio singolo altamente conservata, codificata sull'esercizio del cromosoma 15q25.1 nell'uomo ^2,3. L'accumulo di evidenze ha dimostrato che TMED3 è espresso in modo aberrante in diverse neoplasie maligne ed è coinvolto nell'iniziazione, proliferazione, invasione, metastasi e progressione tumorali. Un'espressione elevata di TMED3 è stata segnalata nell'osteosarcoma⁴, nel carcinoma squamoso^{polmonare 5}, nel cancro^{al seno nel 6}, nel carcinoma endometriale⁷ e nel cancro del^{colon-retto 8}. Studi sperimentali hanno dimostrato che la soppressione dell'espressione di TMED3 inibisce la proliferazione delle cellule tumorali, la capacità metastatica e l'attività anti-apoptotica, limitando così la progressione tumorale. Nel glioma, la sovraespressione di TMED3 è stata associata a un grado tumorale più elevato e a una prognosi inferiore, e TMED3 è stato riportato come favorendo la progressione del glioblastoma attraverso la regolazione di ZBTB7A9. Sebbene indagini precedenti abbiano esplorato il ruolo biologico di TMED3 in specifici tipi tumorali, i suoi modelli di espressione, la sua rilevanza prognostica e le sue funzioni molecolari nel pan-cancro non sono ancora stati caratterizzati sistematicamente.

I recenti progressi nei database multiomici e nell'analisi bioinformatica hanno permesso una valutazione sistematica dell'espressione genica, della prognosi, delle caratteristiche immunitarie e delle alterazioni molecolari tra diversi tipi di tumori. Rispetto agli studi a coorte singola, l'analisi pan-tumorale integrata utilizzando database pubblici offre un approccio più ampio per identificare potenziali biomarcatori e target terapeutici tra i tumori. Nel presente studio sono state condotte analisi bioinformatiche complete per esplorare il ruolo di TMED3 in molteplici tipi di cancro utilizzando database multiomici pubblici disponibili, tra cui The Cancer Genome Atlas (TCGA), Genotype-Tissue Expression (GTEx), UALCAN, Human Protein Atlas e cBioPortal. Lo studio ha valutato sistematicamente i modelli di espressione di TMED3, le caratteristiche clinicopatologiche, la rilevanza prognostica, le associazioni immunodinamiche e le potenziali funzioni biologiche nel pan-cancro. Inoltre, è stata effettuata un'analisi immunoistochimica (IHC) nei tessuti del tumore del colon per convalidare l'espressione della proteina TMED3 e la sua associazione con caratteristiche clinicopatologiche. La nostra analisi pan-tumorale funge da strategia di screening per identificare i biomarcatori candidati. Abbiamo poi effettuato la validazione sperimentale specificamente nel cancro colorettale (CRC). I risultati dimostrano che TMED3 è un promettente biomarcatore prognostico nel CRC, anche se la sua rilevanza per altri tipi di cancro richiede ulteriori indagini.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgevano tessuti umani venivano eseguite in conformità con le linee guida istituzionali per la biosicurezza e l'etica e all'interno di un armadietto certificato per la sicurezza biologica. Il protocollo dello studio è stato approvato dal Comitato Etico della Ricerca dell'Ospedale Centrale di Tangshan (n. TZYL/K/2023-16), e il consenso informato scritto di tutti i partecipanti è stato ottenuto prima della raccolta del campione.

Raccolta dati
I dati del profilo di espressione TMED3 da diversi tumori e tessuti normali non accoppiati sono stati ottenuti dai database TCGA e^{GTEx 10,11} (TCGA: https://portal.gdc.cancer.gov/; GTEx: https://gtexportal.org/; consultato il 1° luglio 2025). Sono stati eseguiti test di Wilcoxon a somma di rangi per analizzare l'espressione differenziale di TMED3 tra tumori e tessuti normali non abbinati. Le matrici di sequenziamento dell'RNA normalizzate tramite trascrizione per milione (TPM) scaricate da UCSC Xena sono state utilizzate per analisi a valle. I valori di espressione sono stati armonizzati utilizzando la trasformazione log₂(TPM + 1) prima dell'analisi statistica. I dati di espressione TMED3 per 33 tipi di tumori e tessuti normali corrispondenti sono stati successivamente scaricati dal database TCGA. Sono stati impiegati test Wilcoxon con rango segnato per valutare l'espressione differenziale di TMED3 tra tumori e tessuti normali corrispondenti. L'espressione differenziale della proteina TMED3 tra tessuto tumorale e normale è stata ottenuta dal database^{UALCAN 12} (http://ualcan.path.uab.edu; consultato il 1° luglio 2025). È stato accesso al modulo di analisi proteomica e è stata selezionata l'opzione "Pan-Cancer View" per l'analisi. Le analisi di espressione proteica sono state effettuate utilizzando i dataset CPTAC disponibili tramite il modulo UALCAN "Pan-cancer View" con impostazioni predefinite della piattaforma e senza filtraggio aggiuntivo dei campioni.

Analisi delle caratteristiche clinicopatologiche
Sono state raccolte informazioni clinicopatologiche di 33 tipi tumorali nel database TCGA per indagare la relazione tra l'espressione di TMED3 e lo stadio patologico. Gli stadi tumorali sono stati suddivisi in gruppi di stadio iniziale (stadio I–II) e stadio avanzato (stadio III–IV). Le differenze nell'espressione di TMED3 tra i gruppi di stadio sono state valutate utilizzando test Wilcoxon di somma dei rangi su più tipi di cancro.

Analisi prognostica
I dati sul tempo di sopravvivenza e sullo stato di sopravvivenza di 33 tipi di tumori sono stati raccolti per l'analisi prognostica. Sono stati esclusi casi normali e casi senza informazioni cliniche. I valori mancanti venivano gestiti in base alla mancanza di ogni variabile. L'espressione di TMED3 è stata suddivisa in gruppi ad alta e bassa espressione in base al valore mediano di espressione. Il pacchetto survival (Versione 3.2-7) nel software di analisi statistica R (versione 4.2.1) è stato utilizzato per eseguire l'analisi di regressione dei rischi proporzionali di Cox. I risultati sono stati visualizzati utilizzando i pacchetti survminer e ggplot2. La sopravvivenza complessiva (OS) è stata definita come l'intervallo dalla diagnosi alla morte per qualsiasi causa, mentre la sopravvivenza specifica alla malattia (DSS) è stata definita come l'intervallo dalla diagnosi alla morte attribuibile al cancro specifico, con i decessi non correlati alla malignità trattati come eventi censurati. Successivamente sono state effettuate analisi di sopravvivenza Kaplan–Meier per valutare le relazioni tra l'espressione di TMED3 e sia OS che DSS nell'adenocarcinoma del colon (COAD).

Analisi delle mutazioni
Il database cBioPortal (www.cbioportal.org; consultato il 5 luglio 2025) è stato utilizzato per analizzare la frequenza delle alterazioni genetiche di TMED3 in 33 tipi di cancro¹³. È stato accessibile al sito cBioPortal e "TMED3" è stato inserito nella barra di ricerca rapida per analizzare il profilo mutazionale di TMED3 su più tipi di tumore. Le alterazioni genetiche di TMED3 includevano principalmente mutazione, amplificazione, delezione profonda e alterazioni multiple. Gli studi pan-tumorali predefiniti e le impostazioni di query disponibili in cBioPortal sono stati utilizzati per l'analisi delle mutazioni senza filtraggio aggiuntivo.

Analisi di correlazione della metilazione del DNA
È stata effettuata un'analisi di metilazione del DNA per valutare lo stato di metilazione del promotore TMED3 nei tumori e nei tessuti normali utilizzando il database UALCAN (https://ualcan.path.uab.edu/; consultato il 5 luglio 2025). Lo stato di metilazione del DNA della regione promotrice TMED3 è stato analizzato utilizzando dati di metilazione di Livello 3 generati dalla piattaforma Illumina Infinium HumanMethylation450K in TCGA. I livelli di metilazione sono stati espressi come β valori, calcolati come β = intensità della sonda metilata / (intensità della sonda metilata + intensità della sonda non metilata), con valori che vanno da 0 (non metilato) a 1 (completamente metilato). Le sonde CpG situate entro 1500 bp a monte del sito di inizio della trascrizione (TSS), incluse le regioni TSS200 e TSS1500 definite da UALCAN, sono state analizzate per valutare lo stato di metilazione del promotore. UALCAN estraeva automaticamente tutte le sonde CpG disponibili nella regione promotrice del gene bersaglio senza filtraggio aggiuntivo. Sono stati ottenuti valori di metilazione β tessuti pan-tumorali e normali, e sono stati eseguiti test T a due campioni non accoppiati per confrontare le differenze tra i gruppi. È stata utilizzata una soglia di significatività di α = 0,05, e P < 0,05 è stata considerata statisticamente significativa.

Analisi dell'interrelazione tra TMED3, carico mutazionale tumorale e instabilità dei microsatelliti
Sono stati analizzati il carico mutazionale tumorale (TMB) e l'instabilità dei microsatelliti (MSI) per indagare le loro associazioni con l'espressione di TMED3 in diversi tipi di cancro. I dataset pan-tumorali elaborati uniformemente sono stati scaricati dal database UCSC Xena (https://xenabrowser.net/; consultato il 5 luglio 2025), e i profili di espressione TMED3 sono stati estratti per analisi successive. I dati di Livello 4 sulla Variazione Nucleotidica Semplice per campioni TCGA generati con MuTect2 sono stati ottenuti dal database Genomic Data Commons (GDC) (https://portal.gdc.cancer.gov/)¹⁴. I dati di espressione TMED3 sono stati integrati con i dataset TMB e i valori di espressione sono stati normalizzati utilizzando la trasformazione log₂(x + 1) prima dell'analisi statistica. I punteggi MSI per i singoli tipi tumorali sono stati raccolti da studi^{precedentemente pubblicati 15} e successivamente fusi con i dati di espressione TMED3 seguendo la stessa procedura di normalizzazione. Le associazioni tra espressione di TMED3 e TMB/MSI sono state valutate utilizzando l'analisi di correlazione di Spearman nei dataset^{pan-tumorali 16,17}.

Analisi delle caratteristiche immunitarie di TMED3
L'algoritmo ESTIMATE è stato applicato per calcolare i punteggi stromali, immunitari e ESTIMATE per molteplici tipi di tumori. I punteggi di infiltrazione stromale e immunitaria nei dataset pan-tumorali sono stati generati utilizzando il pacchetto di stima (Versione 1.0.13) nel software di analisi statistica. Le differenze nel punteggio stromale, nel punteggio immunitario e nel punteggio ESTIMATE tra gruppi ad alta e bassa espressione TMED3 sono state valutate utilizzando i test Wilcoxon a somma dei rangi. Inoltre, sono state condotte analisi relative ai checkpoint immunitari per indagare le relazioni tra l'espressione di TMED3 e le molecole di checkpoint immunitari, inclusi la proteina di morte cellulare programmata 1 (PD-1), il ligando di morte programmata 1 (PD-L1) e la proteina citotossica associata ai linfociti T 4 (CTLA4), tra diversi tipi di cancro. I dati di espressione del conteggio STAR e le relative informazioni cliniche per COAD sono stati scaricati dal database TCGA. Le matrici di espressione formattate in TPM sono state estratte e normalizzate usando la trasformazione log₂(TPM + 1). Successivamente sono stati ottenuti profili di espressione di otto geni correlati ai checkpoint immunitari da campioni COAD, e le correlazioni tra espressione TMED3 e marcatori di checkpoint immunitario sono state analizzate tramite l'analisi di correlazione di Spearman.

Analisi della sensibilità farmacologica
L'analisi della sensibilità ai farmaci è stata condotta utilizzando la piattaforma GSCALite per indagare la relazione tra l'espressione di TMED3 e la risposta anticancerosa ai farmaci tra vari tipi di cancro¹⁸. I dati di sequenziamento dell'RNA di livello 3 e le corrispondenti informazioni cliniche per i campioni COAD sono stati ottenuti dal dataset TCGA. Le risposte chemioterapiche previste per ciascun campione sono state generate utilizzando dati del database Genomics of Drug Sensitivity in Cancer (GDSC) (https://www.cancerrxgene.org/). La previsione della risposta ai farmaci è stata effettuata utilizzando il pacchetto pRRophetic nel software di analisi statistica. I valori stimati della concentrazione inibitoria a mezza massimala (IC₅₀) sono stati calcolati utilizzando la regressione della cresta con impostazioni predefinite, inclusa correzione dell'effetto batch tramite l'algoritmo di combattimento e analisi di aggiustamento specifica per tessuto. Le misurazioni dell'espressione genica replicata sono state mediate prima dell'analisi a valle.

Espressione e prognosi di TMED3 nel cancro al colon
I profili di espressione TMED3 e i relativi dati clinicopatologici per l'adenocarcinoma del colon sono stati ottenuti dal database TCGA. L'espressione differenziale di TMED3 tra tessuti tumorali del colon e tessuti normali non abbinati è stata valutata utilizzando i test di Wilcoxon a somma dei rangi, mentre le associazioni tra espressione di TMED3 e caratteristiche clinicopatologiche sono state analizzate tramite test chi-quadrato. I pazienti sono stati stratificati in gruppi ad alta e bassa espressione secondo il livello mediano di espressione TMED3. Successivamente è stata effettuata un'analisi di sopravvivenza di Kaplan–Meier per confrontare le differenze prognostiche tra i due gruppi. Sono state condotte analisi di regressione dei rischi proporzionali di Cox univariate e multivariate per valutare il significato prognostico dell'espressione di TMED3 nel cancro al colon. Inoltre, è stata effettuata un'analisi della curva ROC (Receiver Running Characteristic Dependent Time Line) per valutare le prestazioni predittive dell'espressione TMED3 per sistemi operativi a 1, 3 e 5 anni. Le analisi ROC sono state eseguite utilizzando il pacchetto timeROC nel software di analisi statistica, e la visualizzazione grafica è stata generata utilizzando il pacchetto ggplot2.

Analisi immunoistochimica
Un totale di 60 campioni di tessuto per il cancro del colon e 20 tessuti non cancerosi sono stati selezionati casualmente dall'Ospedale Centrale di Tangshan. Lo studio è stato approvato dal comitato di revisione istituzionale locale (n. TZYL/K/2023-16), e il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i pazienti prima dell'intervento. Tutti i campioni di tessuto sono stati prelevati da pazienti sottoposti a resezione chirurgica senza chemioterapia o immunoterapia preliminari. La coorte comprendeva 39 pazienti maschi e 21 femmine di età compresa tra 20 e 87 anni. Secondo i criteri di stadiazione di Duke, 33 pazienti sono stati classificati come stadio I+II e 27 pazienti come stadio III+IV. La distribuzione degli stadi della coorte può introdurre un potenziale bias di selezione verso stadi avanzati della malattia; Pertanto, i risultati legati alla sopravvivenza devono essere interpretati con cautela.

I campioni di tessuto incorporati in paraffina sono stati sezionati in fette da 4 μm, seguite da deparaffinizzazione e reidratazione. L'attività endogena della perossidasi è stata stemperata usando il 4% di_H2O2, e il legame aspecifico è stato successivamente bloccato con siero di capra. Le sezioni sono state poi incubate durante la notte a 4°C con anticorpo primario TMED3 a una diluizione di 1:100. Il giorno seguente è stato applicato per 30 minuti il polimero IgG anti-coniglio per pecore (PV-6000) a temperatura ambiente. L'immunoreattività è stata visualizzata tramite colorazione con diaminobenzidina e le sezioni sono state montate con resina neutra. La colorazione istologica è stata esaminata al microscopio ottico ad alto ingrandimento. L'intensità dell'immunocolorazione è stata valutata come 0 (negativa), 1 (debole), 2 (moderata) e 3 (forte), mentre la proporzione di cellule tumorali positive è stata classificata come 1 (1%–25%), 2 (26%–50%), 3 (51%–75%) o 4 (76%–100%). I punteggi finali immunoistochimici sono stati calcolati moltiplicando l'intensità della colorazione per il punteggio percentuale delle cellule tumorali positive. I livelli di espressione di TMED3 sono stati classificati come negativi/bassi (punteggio ≤ 6) o sovraespressione (punteggio > 6)¹⁹.

Analisi dell'arricchimento genico di TMED3 nel cancro al colon
È stata effettuata un'analisi di arricchimento genico per valutare le potenziali funzioni biologiche e le vie di segnalazione associate all'espressione di TMED3 nel cancro al colon. I geni espressi differenzialmente tra gruppi ad alta e bassa espressione TMED3 sono stati selezionati utilizzando il pacchetto DESeq2 nel software di analisi statistica. I dati grezzi ottenuti dal TCGA sono stati normalizzati utilizzando il metodo di normalizzazione del rapporto mediano implementato in DESeq2. I geni a bassa espressione con conteggi <10 in oltre il 50% dei campioni sono stati esclusi prima dell'analisi. I geni espressi differenzialmente sono stati identificati utilizzando soglie di |log₂ (FC)| ≥ 1 e aggiustato P < 0,05 dopo la correzione dei test multipli Benjamini–Hochberg (BH). Tutti i parametri analitici sono stati fissati per garantire la riproducibilità dell'analisi.

Successivamente, è stata eseguita l'Analisi di Arricchimento del Set Genico (GSEA) utilizzando il pacchetto clusterProfiler in R, basato sui set genici della Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) (versione 7.5.1) ottenuto dal Molecular Signatures Database (MSigDB). È stata generata una lista genica pre-classificata secondo i valori di variazione di fold log2 tra i gruppi ad alta e bassa espressione TMED3. L'analisi di arricchimento è stata condotta utilizzando 1000 permutazioni fenotipiche, e nell'analisi sono stati inclusi set genici contenenti 15–500 geni. I percorsi con valori assoluti di arricchimento normalizzato (NES) pari a >1, P < aggiustato 0,05 e tasso di false scoperte (FDR) < 0,25 sono stati considerati significativamente arricchiti. L'arricchimento della via della malattia di Parkinson è stato mantenuto perché questa via è strettamente associata a disfunzioni mitocondriali e a processi biologici correlati alla fosforilazione ossidativa, che sono anch'essi coinvolti nella riprogrammazione metabolica tumorale e nella progressione del cancro.

Analisi statistica
Tutte le analisi statistiche sono state condotte utilizzando il software di analisi statistica. L'espressione differenziale tra i gruppi è stata valutata utilizzando test Wilcoxon a due facce per campioni non accoppiati e test Wilcoxon a rango firmato per campioni accoppiati. Le associazioni tra l'espressione di TMED3 e le variabili clinicopatologiche sono state valutate utilizzando test chi-quadrato. Le analisi di sopravvivenza sono state effettuate utilizzando il pacchetto survival (versione 3.3-1), e le curve di sopravvivenza di Kaplan–Meier sono state generate con il pacchetto survminer. Le differenze negli esiti di sopravvivenza tra i gruppi sono state confrontate utilizzando il test log-rank. Sono stati applicati modelli di regressione dei rischi proporzionali di Cox per identificare fattori prognostici associati alla SO. I pazienti sono stati suddivisi in gruppi ad alta e bassa espressione secondo il livello mediano di espressione TMED3. Le analisi ROC dipendenti dal tempo venivano effettuate utilizzando il pacchetto timeROC, e le figure venivano generate con il pacchetto ggplot2. Salvo diversa indicazione, la significatività statistica è stata definita come un valore P bilaterale di < 0,05.

L'analisi di correlazione di Spearman è stata effettuata per valutare le correlazioni tra espressione e caratteristiche immunitarie di TMED3, TMB e MSI. Per tutte le analisi di correlazione sono stati utilizzati dati di espressione quantitativa normalizzati ottenuti dai relativi database pubblici. Per i dati di sequenziamento dell'RNA TCGA, i valori di espressione formattati in TPM sono stati trasformati utilizzando la normalizzazione log₂(TPM + 1) prima dell'analisi, dove applicabile. I campioni con dati clinici o molecolari mancanti sono stati esclusi prima dell'analisi statistica. Le analisi di correlazione di Spearman sono state condotte come test non parametrici a due code. I valori grezzi di P sono stati utilizzati per analisi che coinvolgevano confronti limitati, inclusi test di Wilcoxon, analisi di correlazione di Spearman e analisi di sopravvivenza. Per analisi bioinformatiche su larga scala ad alto rendimento, inclusa l'analisi differenziale dell'espressione genica, l'analisi di arricchimento KEGG e la GSEA, è stata eseguita una correzione con test multipli utilizzando il metodo BH FDR. I valori FDR corretti di <0,05 sono stati considerati statisticamente significativi.

Risultati

Analisi dell'espressione di TMED3 nel pan-cancro
L'analisi dei dataset TCGA e GTEx ha dimostrato che l'espressione dell'acido ribonucleico messaggero (mRNA) TMED3 era significativamente elevata nella maggior parte dei tessuti tumorali rispetto ai tessuti normali corrispondenti, inclusi carcinoma adrenocorticale (ACC), carcinoma uroteliale della vescica (BLCA), carcinoma invasivo del seno (BRCA), carcinoma squamoso cervicale e adenocarcinoma endocervicale (CESC), colangiocarcinoma (CHOL), adenocarcinoma del colon (COAD), linfoma diffuso a grandi cellule B (DLBC), carcinoma esofageo (ESCA), glioblastoma multiforme (GBM), carcinoma a cellule chiare renali renali (KIRC), carcinoma renale a cellule papilari renali (KIRP), glioma cerebrale di grado inferiore (LGG), carcinoma epatocellulare epatico (LIHC), adenocarcinoma polmonare (LUAD), carcinoma a cellule squamose polmonari (LUSC), cistadenocarcinoma seroso ovarico (OV), adenocarcinoma pancreasico (PAAD), feocromocitoma e paraganglioma (PCPG), adenocarcinoma prostatico (PRAD), adenocarcinoma del retto (READ), melanoma cutaneo cutaneo (SKCM), adenocarcinoma gastrico (STAD), tumori delle cellule germinali testicolari (TGCT), carcinoma tiroideo (THCA), timoma (THYM), carcinoma endometriale del corpo uterino (UCEC) e carcinosarcoma uterino (UCS), mentre una riduzione dell'espressione è stata osservata nel carcinoma a cellule squamose di testa e collo (HNSC) e nella leucemia mieloide acuta (LAML) (Figura 1A). I tessuti normali adiacenti abbinati hanno servito come controllo per le analisi di espressione accoppiata. L'analisi TCGA abbinata ha ulteriormente confermato un aumento significativo dell'espressione di TMED3 nei tessuti BLCA, BRCA, CHOL, COAD, cromofobia renale (KICH), KIRP, KIRC, LIHC, LUAD, LUSC, PRAD, STAD e UCEC rispetto ai tessuti normali accoppiati (Figura 1B). Inoltre, l'analisi dell'espressione proteica utilizzando il database UALCAN/Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC) ha dimostrato un aumento dei livelli di proteine TMED3 nei tessuti tumorali BRCA, COAD, GBM, KIRC, LIHC, LUAD, LUSC, OVV e UCEC, mentre una riduzione dell'espressione proteica è stata osservata nel PAAD rispetto ai tessuti normali (Figura 1C). Tuttavia, l'espressione della proteina TMED3 era inferiore nella PAAD rispetto ai tessuti normali. Questa discrepanza tra i modelli di espressione di mRNA e proteine può riflettere meccanismi regolatori post-trascrizionali o post-traduzionali. Questi risultati suggeriscono che TMED3 è aberrantemente sovraregolata in più tumori e potrebbe essere associata a caratteristiche diagnostiche e prognostiche in più tipi di tumori.

Figura 1. Profili di espressione TMED3 nei tumori umani. (A) Espressione differenziale di mRNA TMED3 tra tumori e tessuti normali tra molteplici tipi di cancro basata sui dataset TCGA e GTEx. I livelli di espressione sono presentati come log₂(TPM + 1). (B) Analisi accoppiata dell'espressione dell'mRNA TMED3 tra tessuti tumorali e tessuti normali adiacenti da dataset TCGA. (C) Espressione differenziale della proteina TMED3 tra tessuti normali e tumori primari nei dataset CPTAC/UALCAN, inclusi carcinoma invasivo del seno (BRCA), adenocarcinoma del colon (COAD), glioblastoma multiforme (GBM), carcinoma a cellule chiare renali (KIRC), carcinoma epatocellulare epatico (LIHC), adenocarcinoma polmonare (LUAD), carcinoma squamoso polmonare (LUSC), cistadenocarcinoma seroso ovarico (OV), adenocarcinoma pancreatico (PAAD) e carcinoma endometriale del corpo uterino (UCEC). I dati sono presentati come diagrammi a scatole. La significatività statistica è stata analizzata utilizzando i test di Wilcoxon a somma dei rangi o a segni Wilcoxon, secondo le opportunità. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001; NS, non significativi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Analisi delle caratteristiche clinicopatologiche
L'analisi clinica dello stadio ha dimostrato che l'espressione di TMED3 era significativamente più alta nei tumori in stadio avanzato (stadio III–IV) rispetto a quelli in stadio iniziale (stadio I–II) in ACC, KIRC, KIRP e LUAD (Figura 2). Al contrario, l'espressione di TMED3 è stata significativamente ridotta nei tessuti UCEC in stadio avanzato. Questi risultati suggeriscono che un'espressione elevata di TMED3 possa essere associata alla progressione tumorale in diversi tipi di cancro.

Figura 2. Associazione tra espressione di TMED3 e stadio patologico in più tumori. Grafici a violino che mostrano i livelli di espressione dell'mRNA TMED3 in tumori in stadio iniziale (stadio I–II) e in stadio avanzato (stadio III–IV) nel carcinoma adrenocorticale (ACC), carcinoma a cellule chiare renali (KIRC), carcinoma papillare renale (KIRP), adenocarcinoma polmonare (LUAD) e carcinoma endometriale del corpo uterino (UCEC). I livelli di espressione sono presentati come log₂(TPM + 1). La significatività statistica è stata valutata utilizzando i test di somma dei rangi di Wilcoxon. *P < 0,05, ***P < 0,001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Analisi prognostica
Le analisi di regressione di Cox e di sopravvivenza hanno dimostrato che un'elevata espressione di TMED3 era associata a un sistema operativo più scadente in ACC, COAD, LUAD e UVM (Figura 3A). L'analisi DSS ha inoltre rivelato che un'espressione elevata di TMED3 era significativamente associata a DSS sfavorevole in ACC, COAD, GBM, KIRP e UVM (Figura 3B). In particolare, ACC, COAD e UVM hanno costantemente mostrato una prognosi scadente sia per OS che per DSS nei pazienti con alta espressione di TMED3. Sono state osservate anche associazioni prognostiche a livello di tendenza in tipi tumorali selezionati, tra cui LUAD, KIRC e LGG. Questi risultati suggeriscono che l'espressione di TMED3 possa avere rilevanza prognostica in molteplici neoplasie maligne.

Figura 3. Significato prognostico dell'espressione di TMED3 nell'analisi pan-tumorale. (A) Grafico forestale che mostra l'associazione tra l'espressione di TMED3 e la sopravvivenza complessiva (OS) tra diversi tipi di cancro. (B) Grafico forestale che mostra l'associazione tra l'espressione di TMED3 e la sopravvivenza specifica per malattia (DSS) tra diversi tipi di cancro. I rapporti di rischio (HR) e gli intervalli di confidenza al 95% (IC 95%) sono stati calcolati utilizzando l'analisi di regressione dei rischi proporzionali di Cox. HR > 1 indica una prognosi negativa associata a un'elevata espressione di TMED3. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Analisi delle mutazioni
L'analisi delle alterazioni genetiche utilizzando il database cBioPortal ha dimostrato che le alterazioni TMED3 tra i tumori consistevano principalmente in mutazioni, amplificazioni, delezioni profonde e alterazioni multiple (Figura 4). La frequenza più alta di alterazioni di TMED3 è stata osservata nel mesotelioma (MESO), principalmente dovuto all'amplificazione genica (2,3%). L'ESCA ha mostrato tipi di alterazione misti, inclusi mutazione (0,55%), amplificazione (1,1%) e delezione profonda (0,55%). Al contrario, non sono state identificate alterazioni genetiche rilevabili di TMED3 nei dataset LIHC, KICH, THCA, PCPG, CHOL, UVM, LAML, UCS, DLBC, KIRC, TGCT e GBM. Questi risultati indicano che le alterazioni genomiche di TMED3 avvengono in modo specifico per tumori e possono contribuire all'eterogeneità del cancro.

Figura 4. Paesaggio di alterazione genetica di TMED3 nei tumori. Frequenza e tipi di alterazioni genetiche di TMED3 tra i dataset pan-tumorali ottenuti dal database cBioPortal. Le categorie di alterazione includevano mutazione, amplificazione, delezione profonda e alterazioni multiple. L'asse y indica la frequenza di alterazione (%) tra i tipi di cancro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Analisi della metilazione del DNA
L'analisi del database UALCAN ha dimostrato che i livelli di metilazione del promotore TMED3 erano significativamente aumentati nei tessuti tumorali BRCA, COAD, ESCA, HNSC, KIRC, KIRP, LIHC, LUAD, PAAD e PRAD rispetto ai tessuti normali corrispondenti (Figura 5). Al contrario, sono stati osservati livelli ridotti di metilazione del promotore TMED3 nei tessuti BLCA, TGCT e UCEC rispetto ai controlli normali. Questi risultati suggeriscono che una metilazione aberrante del promotore TMED3 possa contribuire alla regolazione specifica tumorale dell'espressione di TMED3.

Figura 5. Livelli di metilazione promotrice di TMED3 tra i tumori. Confronto dei livelli di metilazione del promotore TMED3 tra i tessuti tumorali e i tessuti normali corrispondenti nel carcinoma uroteliale della vescica (BLCA), carcinoma invasivo al seno (BRCA), adenocarcinoma del colon (COAD), carcinoma esofageo (ESCA), carcinoma a cellule squamose della testa e collo (HNSC), carcinoma a cellule chiare renali renali (KIRC), carcinoma a cellule papillare renali (KIRP), carcinoma epatocellulare epatico (LIHC), adenocarcinoma polmonare (LUAD), adenocarcinoma pancreatico (PAAD), dataset di adenocarcinoma prostatico (PRAD), tumori delle cellule germinali testiculari (TGCT) e carcinoma endometriale del corpo uterino (UCEC) ottenuti da UALCAN. I dati sono presentati come valori β nei box plot. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Analisi delle correlazioni tra TMED3, TMB e MSI
L'analisi di correlazione di Spearman ha dimostrato che l'espressione di TMED3 era positivamente correlata con TMB in ACC, ESCA, KIRC, LGG, PAAD, STAD, THYM e UCEC, mentre correlazioni negative sono state osservate in CESC, LUAD e TGCT (Figura 6A). Inoltre, l'espressione di TMED3 è stata positivamente associata a MSI in DLBC, KIRC, SKCM, STAD e UCEC (Figura 6B). In particolare, l'espressione di TMED3 ha mostrato correlazioni positive sia con TMB che con MSI in KIRC, STAD e UCEC, il che potrebbe indicare potenziali associazioni con l'immunogenicità tumorale in questi tumori.

Figura 6. Correlazione dell'espressione di TMED3 con il carico mutazionale tumorale e l'instabilità dei microsatelliti nell'analisi pan-tumorale. (A) Grafico radar che mostra la correlazione tra l'espressione di TMED3 e il carico mutazionale tumorale (TMB) tra i tumori. (B) Grafico radar che mostra la correlazione tra l'espressione di TMED3 e l'instabilità dei microsatelliti (MSI) tra i tumori. I coefficienti di correlazione sono stati calcolati utilizzando l'analisi di correlazione di Spearman. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Analisi delle caratteristiche immunitarie
L'analisi ESTIMATE ha dimostrato che l'espressione di TMED3 era negativamente correlata con il punteggio stromale, il punteggio immunitario e il punteggio ESTIMATE in BCLA, ESCA, LAML, LUAD, LUSC, PAAD, PRAD, SKCM, STAD, THCA e UCEC (Figura 7A). Al contrario, sono state osservate correlazioni positive tra l'espressione di TMED3 e questi punteggi immunologici in LGG, LIHC e PCPG. Non sono state identificate correlazioni significative in ACC, CHOL, DLBC, GBM, KICH, KIRC, KIRP, OV e UCS. Questi risultati suggeriscono che TMED3 possa influenzare il microambiente tumorale e l'infiltrazione delle cellule immunitarie in modo dipendente dal tipo di tumore. L'analisi della correlazione dei checkpoint immunitari ha ulteriormente dimostrato che l'espressione di TMED3 era negativamente associata ai geni correlati ai checkpoint immunitari CD274 (PD-L1), PDCD1 (PD-1) e CTLA4 in BLCA, BRCA, CESC, ESCA, HNSC, LUAD, LUSC, PRAD, SKCM e THCA (Figura 7B). Correlazioni positive tra l'espressione di TMED3 e i geni dei checkpoint immunitari sono state identificate in LIHC e UVM, mentre non sono state osservate associazioni significative in GBM, KICH, LAML, MESO, OV, PCPG, READ e TGCT. Questi risultati indicano che TMED3 potrebbe essere associato alla regolazione immunitaria tumorale e alla segnalazione dei punti di controllo immunitario in alcuni tipi di cancro.

Figura 7. Associazioni tra espressione di TMED3 e caratteristiche immunitarie tumorali. (A) Mappa di calore che mostra le correlazioni tra espressione TMED3 e punteggio stromalo, punteggio immunitario e punteggio ESTIMATE tra i tumori calcolati utilizzando l'algoritmo ESTIM. (B) Mappa di calore che mostra correlazioni tra l'espressione di TMED3 e i geni correlati ai checkpoint immunitari, inclusi CD274 (PD-L1), PDCD1 (PD-1) e CTLA4. I coefficienti di correlazione sono stati determinati tramite l'analisi di correlazione di Spearman. La scala dei colori indica la forza di correlazione. *P < 0,05. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Analisi della sensibilità farmacologica
L'analisi della sensibilità farmacologica utilizzando la piattaforma GSCALite basata sui dataset GDSC ha dimostrato che l'espressione di TMED3 era negativamente correlata con i valori di concentrazione inibitoria a mezza massima (IC₅₀) di 17-AAG, lapatinib, PD-0325901, RDEA119 e trametinib (Figura 8). Questi risultati suggeriscono che i tumori con espressione elevata di TMED3 possano mostrare una maggiore sensibilità a questi agenti anticancerosi, suggerendo possibili associazioni tra espressione di TMED3 e sensibilità terapeutica.

Figura 8. Correlazione tra espressione di TMED3 e sensibilità ai farmaci anticancerosi. Grafico a bolla che mostra correlazioni tra l'espressione dell'mRNA TMED3 e la sensibilità ai farmaci anticancerosi, ottenuto dai dataset Genomics of Drug Sensitivity in Cancer (GDSC) tramite la piattaforma GSCALite. La dimensione della bolla rappresenta la significanza statistica basata sul tasso di false scoperte (FDR), e il colore indica i valori dei coefficienti di correlazione. Le correlazioni negative indicano un aumento della sensibilità al farmaco associata a un'elevata espressione di TMED3. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Espressione e prognosi di TMED3 nel cancro al colon
L'analisi dell'espressione TMED3 ha dimostrato un aumento significativo dei livelli di mRNA TMED3 nei tessuti tumorali del colon rispetto ai tessuti colonici normali nei dataset TCGA (Figura 9A). L'analisi a coppie utilizzando tessuti normali adiacenti abbinati come controlli ha ulteriormente confermato l'elevata espressione di TMED3 nei tessuti per il cancro del colon (Figura 9B). In linea con i risultati trascrivomici, l'analisi dell'espressione proteica utilizzando dataset UALCAN/CPTAC e colorazione immunoistochimica ha dimostrato un aumento dell'espressione della proteina TMED3 nei tessuti del tumore del colon rispetto ai tessuti normali del colon (Figura 9C–9E). L'analisi della curva ROC ha mostrato un'area sotto il valore della curva (AUC) di 0,869, indicando una performance diagnostica favorevole di TMED3 per distinguere i tessuti tumorali del colon da quelli normali (Figura 9F). L'analisi clinicopatologica ha inoltre dimostrato che l'espressione di TMED3 era significativamente associata allo stadio T, mentre non sono state osservate associazioni significative con età, genere, stadio N o stadio TNM (Tabella 1). Questi risultati supportano il potenziale significato diagnostico di TMED3 nel cancro al colon.

Figura 9. Espressione, valore diagnostico e validazione immunoistochimica di TMED3 nel tumore al colon. (A) Espressione differenziale di mRNA TMED3 tra i tessuti tumorali del colon e i tessuti normali del colon dai dataset TCGA. (B) Analisi a coppie dell'espressione dell'mRNA TMED3 nei tessuti tumorali del colon e in tessuti normali adiacenti. (C) Espressione della proteina TMED3 nel cancro del colon e nei tessuti normali ottenuta da dataset CPTAC/UALCAN. (D) Colorazione immunoistochimica rappresentativa di TMED3 nel tessuto colon normale. (E) Colorazione immunoistochimica rappresentativa di TMED3 nel tessuto tumorale del colon che mostra un'espressione aumentata di TMED3. (F) Curva della caratteristica operativa del ricevitore (ROC) che valuta il valore diagnostico di TMED3 nel cancro al colon. Barre della scala = 100 μm. L'area sotto la curva (AUC) era di 0,869 con un intervallo di confidenza (IC) del 95% di 0,813–0,924. La significatività statistica è stata analizzata utilizzando i test di Wilcoxon a somma dei rangi o a segni Wilcoxon, secondo le opportunità. P < 0,001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tipo		TMED3		Valore P	χ2
		Bassa espressione	Alta espressione
Età
≤ 55	25	15	10	0.13	2.34
> 55	35	14	21
Genere
Femmina	21	10	11	0.94	0.007
Maschio	39	19	20
Stadio T
T1+T2	23	15	8	0.04	4.26
T3+T4	37	14	23
N Stage
N0	30	12	18	0.2	1.67
N1+N2	30	17	13
TNM Stage
I+II	33	13	20	0.13	2.35
III+IV	27	16	11

Tabella 1: Associazione tra espressione di TMED3 e caratteristiche clinicopatologiche nel cancro al colon. Le caratteristiche clinicopatologiche dei pazienti con tumore al colon sono state confrontate tra gruppi a bassa e alta espressione TMED3. Le associazioni tra l'espressione di TMED3 e le variabili clinicopatologiche, inclusi età, sesso, stadio T, stadio N e stadio TNM, sono state analizzate utilizzando test chi-quadrato (χ²). I dati sono presentati come il numero di pazienti in ciascun sottogruppo. La significatività statistica è stata definita come P < 0,05.

L'analisi di sopravvivenza KM ha dimostrato che i pazienti con alta espressione di TMED3 hanno mostrato un OS significativamente più basso (P = 0,031) e DSS (P = 0,020) rispetto ai pazienti con bassa espressione di TMED3 (Figure 10A e 10B). L'analisi ROC dipendente dal tempo ha dimostrato che la performance predittiva dell'espressione TMED3 per OS ha prodotto valori AUC di 0,620, 0,564 e 0,575 rispettivamente a 1, 3 e 5 anni (Figura 10C). Inoltre, le analisi di regressione di Cox univariate e multivariate hanno identificato stadio T, stadio M, stadio patologico ed espressione di TMED3 come fattori prognostici associati alla sopravvivenza complessiva nel cancro del colon (Tabella 2). Questi risultati suggeriscono che un'espressione elevata di TMED3 è associata a una prognosi scadente nel cancro al colon, anche se l'analisi ROC dipendente dal tempo ha mostrato solo una performance predittiva modesta.

Figura 10. Significato prognostico dell'espressione di TMED3 nel cancro al colon. (A) Curve di sopravvivenza complessiva (OS) di Kaplan–Meier (KM) confrontando pazienti con espressione TMED3 alta e bassa nel cancro al colon. (B) Curve di sopravvivenza specifica per la malattia (DSS) di Kaplan–Meier che confrontano i pazienti con espressione TMED3 alta e bassa. (C) Curve di funzionamento del ricevitore (ROC) dipendenti dal tempo che valutano la performance predittiva dell'espressione TMED3 per sistemi operativi a 1, 3 e 5 anni. Le differenze di sopravvivenza sono state analizzate utilizzando il test log-rank. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Caratteristiche	Analisi univariata		Analisi multivariata
	Rapporto di rischio (IC 95%)	Valore P	Rapporto di rischio (IC 95%)	Valore P
Genere	1.101(0.746–1.625)	0.627
Stadio T	3.072(1.423–6.631)	0.004	3.817(1.174–12.407)	0.026
Stadio N	2.592(1.743–3.855)	<0.001	0.587(0.223–1.584)	0.28
Fase M	4.193(2.683–6.554)	<0.001	2.272(1.314–3.930)	0.003
Stadio patologico	2.947(1.942–4.471)	<0.001	3.115(1.032–9.401)	0.044
TMED3	1.537(1.037–2.277)	0.032	1.599(1.039–2.462)	0.033

Tabella 2: Analisi di regressione dei rischi proporzionali di Cox univariate e multivariate dei fattori prognostici associati alla sopravvivenza complessiva nel cancro del colon. Sono state effettuate analisi di regressione dei rischi proporzionali di Cox univariate e multivariate per valutare il significato prognostico delle caratteristiche clinicopatologiche e dell'espressione di TMED3 nei pazienti con cancro al colon. I rapporti di rischio (HR) sono presentati con intervalli di confidenza del 95% (IC 95%). Le variabili includevano sesso, stadio T, stadio N, stadio M, stadio patologico e espressione TMED3. La significatività statistica è stata definita come P < 0,05.

L'analisi della sensibilità farmacologica ha dimostrato che i pazienti nel gruppo ad alta espressione TMED3 hanno mostrato valori stimati di IC₅₀ più bassi per 5-fluorouracile, lapatinib e trametinib rispetto al gruppo a bassa espressione TMED3 (Figura 11). Questi risultati suggeriscono che i pazienti con cancro al colon con espressione elevata di TMED3 possano mostrare una maggiore sensibilità a questi agenti chemioterapeutici e mirati, suggerendo potenziali associazioni tra espressione di TMED3 e risposta terapeutica.

Figura 11. Correlazione tra espressione di TMED3 e sensibilità ai farmaci chemioterapici nel cancro al colon. Box plot che mostrano valori stimati di concentrazione inibitoria a metà massima (IC₅₀) per 5-fluorouracile, lapatinib e trametinib tra i gruppi a bassa espressione di TMED3 (G1) e ad alta espressione di TMED3 (G2). Valori IC₅₀ più bassi indicano una maggiore sensibilità al farmaco. La significatività statistica è stata analizzata utilizzando i test di somma dei rangi di Wilcoxon. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Analisi dell'arricchimento genico
GSEA, utilizzando i dataset KEGG del database MSigDB, ha dimostrato che i geni correlati a TMED3 nel cancro al colon erano significativamente arricchiti nelle vie associate a ribosoma, elaborazione e presentazione dell'antigene, fosforilazione ossidativa e percorso del fosfato del pentosio (Figura 12). Questi risultati suggeriscono che TMED3 possa partecipare alla progressione tumorale attraverso le vie sopra indicate nel cancro al colon.

Figura 12. Analisi dell'arricchimento del set genico (GSEA) dei geni correlati a TMED3 nel cancro al colon. Grafici GSEA che mostrano l'arricchimento di geni correlati a TMED3 nelle vie associate al processamento e alla presentazione degli antigeni, al ribosoma, alla fosforilazione ossidativa e alla via del pentosio fosfato nel cancro al colon. In ogni pannello sono indicati i valori di enrichment score normalizzato (NES), valore nominale P e tasso di false discovery (FDR). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Questo studio ha dimostrato che TMED3 è stato espresso in modo aberrante in più tumori ed è stato associato a progressione tumorale, prognosi, caratteristiche immunitarie, TMB, MSI e sensibilità ai farmaci. Nel cancro al colon, la sovraespressione di TMED3 è stata associata a esiti di sopravvivenza sfavorevoli e a un aumento del valore diagnostico. L'analisi dell'arricchimento funzionale ha inoltre suggerito che TMED3 potrebbe partecipare alle vie metaboliche e di segnalazione legate al cancro. Collettivamente, questi risultati supportano ulteriori indagini su TMED3 come potenziale biomarcatore diagnostico e prognostico nel pan-tumore, in particolare nel cancro del colon.

Disponibilità dei dati:
I dataset analizzati in questo studio sono stati ottenuti da database pubblici, tra cui The Cancer Genome Atlas (TCGA; https://portal.gdc.cancer.gov/projects/; consultato il 1° luglio 2025), UALCAN (http://ualcan.path.uab.edu/; consultato il 1° luglio 2025), cBioPortal (https://www.cbioportal.org/; consultato il 5 luglio 2025) e la piattaforma Genomics of Drug Sensitivity in Cancer (GDSC) tramite GSCA (https://guolab.wchscu.cn/GSCA/#/drug; consultato il 5 luglio 2025). Tutti i dati elaborati generati durante questo studio sono inclusi nell'articolo.

Discussione

Le proteine TMED sono proteine altamente conservate contenenti il dominio EMP24 e che esistono come monomeri o dimeri all'interno delle cellule^{eucariotiche 20}. I membri della famiglia TMED sono proteine transmembrana di tipo I che partecipano al traffico proteico mediato dalla vescicola e al trasporto^{intracellulare 20}. La famiglia proteica p24 comprende 10 membri TMED, incluso TMED3. Ogni numero di evidenze ha dimostrato che TMED3 si manifesta in modo anomalo in diverse neoplasie maligne, come carcinoma endometriale, osteosarcoma, carcinoma a cellule chiare, carcinoma epatocellulare, cancro alla prostata e cancro al seno ^4,6,21,22,23. L'elevata espressione di TMED3 è stata anche collegata a una prognosi sfavorevole in molteplici tipi^tumorali 3,5,17,18,19. Nel carcinoma a cellule squamose polmonari, il TMED3 ha dimostrato facilitare la progressione tumorale tramite la regolazione dell'ezrin, mentre il silenziamento di TMED3 ha soppresso la proliferazione cellulare, la formazione di colonie, la migrazione e la disregolazione proteica correlata^{all'apoptosi 5}. Collettivamente, questi studi indicano che TMED3 è strettamente coinvolta nello sviluppo e nella progressione del cancro; tuttavia, le sue funzioni biologiche e i meccanismi molecolari nel pan-cancro devono ancora essere completamente chiariti.

Nel presente studio, sono stati integrati diversi database pubblici per valutare in modo completo i modelli di espressione, la rilevanza prognostica, le caratteristiche immunitarie e le potenziali funzioni biologiche di TMED3 nei tumori. L'espressione di TMED3 è stata notevolmente aumentata in 26 tipi di tumori, e questi riscontri sono stati ulteriormente confermati tramite analisi di tumori accoppiati e tessuti normali adiacenti in diversi tipi di tumore. Costantemente, i dati CPTAC hanno rivelato un'elevata espressione proteica TMED3 in BRCA, COAD, GBM, KIRC, LIHC, LUAD, LUSC, OVV e UCEC. È interessante notare che, sebbene l'espressione dell'mRNA TMED3 fosse elevata nei tessuti PAAD, nel database UALCAN è stata osservata una riduzione dell'espressione proteica, suggerendo che la regolazione post-trascrizionale, la degradazione proteica o le modifiche post-traduzionali possano contribuire a questa discrepanza. Studi precedenti hanno dimostrato che la sovraespressione di TMED3 nelle cellule del cancro al seno favorisce l'accumulo di β-catenina e Axin-2 sia nel citoplasma che nel nucleo delle cellule MCF-7 e aumenta l'espressione di bersagli a valle di Wnt/β-catenina, inclusi c-myc, MMP7 e TCF4, facilitando così la proliferazione, la migrazione e l'invasione delle cellule^{tumultili 24}. Analogamente, è stato segnalato che TMED3 è stato regolato all'alto nel cancro polmonare non a piccole cellule, e il silenziamento di TMED3 sopprime la proliferazione delle cellule tumorali e la capacità^{invasiva 25}. Nel presente studio, le analisi clinicopatologiche hanno mostrato che l'espressione di TMED3 era elevata in ACC, KIRC, KIRP e LUAD in stadio avanzato, mentre in UCEC in stadio avanzato è stata osservata un'espressione più bassa, indicando possibili ruoli biologici specifici tumorali di TMED3 durante la progressione del cancro. Le analisi di sopravvivenza hanno inoltre dimostrato associazioni significative tra un'elevata espressione di TMED3 e OS e DSS sfavorevoli in ACC, COAD e UVM, supportando il potenziale valore prognostico di TMED3 in molteplici neoplasie. Inoltre, l'analisi della metilazione del promotore ha rivelato un aumento dei livelli di metilazione di TMED3 in BRCA, COAD, ESCA, HNSC, KIRC, KIRP, LIHC, LUAD, PAAD e PRAD, mentre sono stati individuati livelli di metilazione diminuiti in BLCA, TGCT e UCEC. Questi risultati indicano che la metilazione aberrante del promotore può contribuire alla disregolazione dell'espressione di TMED3 in modo dipendente dal tumore e può partecipare allo sviluppo del cancro.

L'MSI rappresenta un sottotipo molecolare distinto di cancro che è frequentemente associato a una migliore reattività all'immunoterapia perché questi tumori mostrano comunemente un carico mutazionale elevato e un'espressione aumentata di^{PD-L1 26,27}. I tumori con alto TMB possono generare numerosi neoantigeni derivati da mutazioni somatiche, aumentando così l'attività immunitaria antitumorale mediata dalle cellule T e potenzialmente aumentando la sensibilità al blocco dei punti di controllo^{immunitari 28,29}. Nel presente studio, l'espressione di TMED3 ha mostrato correlazioni positive sia con TMB che con MSI in KIRC, STAD e UCEC, indicando che TMED3 potrebbe essere collegata all'immunogenicità tumorale e alla risposta immunoterapeutica in questi tipi di cancro. Ogni numero di evidenze hanno dimostrato che il microambiente tumorale, in particolare i componenti immunitari e stromali, svolge un ruolo fondamentale nella progressione del cancro, nella risposta terapeutica, nella recidiva e nella prognosi del paziente. L'algoritmo ESTIMATE calcola i punteggi stromali, immunitari e ESTIMATE in base ai modelli di espressione genica correlati al sistema immunitario, e indagini precedenti hanno riportato relazioni significative tra questi punteggi e gli esiti clinici nel cancro alla prostata, nel glioblastoma e nel tumore del colon 30,31,32. Le nostre analisi hanno dimostrato che l'espressione di TMED3 era associata in modo variabile al punteggio stromale, al punteggio immunitario e al punteggio ESTIMATE tra diversi tipi di tumore, suggerendo che TMED3 possa contribuire alla progressione tumorale tramite la modulazione del microambiente tumorale. Inoltre, l'espressione di TMED3 era correlata a molteplici geni correlati ai checkpoint immunitari, tra cui CD274 (PD-L1), PDCD1 (PD-1) e CTLA4, sebbene la direzione e l'entità di queste associazioni differissero tra i tipi tumorali. Correlazioni positive significative tra TMED3 e i marker del checkpoint immunitario sono state identificate in ACC, KIRP, LGG, LIHC, THYM e UVM, suggerendo che i tumori con espressione elevata di TMED3 in questi tumori possano mostrare una maggiore sensibilità all'immunoterapia. Le analisi di sensibilità farmacologica hanno inoltre rivelato associazioni tra espressione di TMED3 e reattività a 17-AAG, lapatinib, PD-0325901, RDEA119 e trametinib, indicando una possibile relazione tra espressione di TMED3 ed efficacia terapeutica.

Il cancro al colon è stato selezionato per la validazione immunoistochimica e i risultati hanno confermato che l'espressione di TMED3 era nettamente elevata nei tessuti del cancro del colon rispetto ai tessuti normali del colon, coerente con i risultati^{precedenti 7}. Le analisi clinicopatologiche hanno inoltre rivelato un'associazione significativa tra l'espressione di TMED3 e lo stadio T nel cancro al colon. Inoltre, TMED3 ha dimostrato un potenziale valore diagnostico, mentre l'aumento dell'espressione di TMED3 è stato associato a una prognosi peggiore per il paziente. Tuttavia, le analisi ROC dipendenti dal tempo hanno mostrato che i valori AUC per la previsione degli OS a 1, 3 e 5 anni erano solo leggermente superiori a 0,5, indicando una precisione predittiva limitata nonostante la significanza statistica. Questi risultati suggeriscono che TMED3 attualmente ha un valore maggiore come biomarcatore prognostico esplorativo piuttosto che come predittore robusto per l'applicazione clinica di routine. Le analisi di regressione di Cox univariate e multivariate hanno ulteriormente identificato lo stadio T, lo stadio M, lo stadio patologico e l'espressione di TMED3 come fattori prognostici indipendenti associati all'OS nel cancro al colon. Le analisi di sensibilità farmacologica hanno indicato che i pazienti con espressione elevata di TMED3 potrebbero essere più reattivi agli agenti terapeutici comunemente usati, tra cui 5-fluorouracile, lapatinib e trametinib. Inoltre, le analisi di arricchimento funzionale hanno rivelato che i geni correlati a TMED3 nel cancro al colon erano principalmente arricchiti nelle vie associate al ribosoma, al processamento e alla presentazione dell'antigene, alla fosforilazione ossidativa e alla via del pentosio fosfato.

Questo studio ha valutato sistematicamente i profili di espressione, il valore prognostico e le caratteristiche immunitarie di TMED3 in diversi tipi di cancro. Tuttavia, dovrebbero essere considerate diverse limitazioni. La maggior parte dei risultati è stata derivata da analisi bioinformatiche e multiomiche basate su dataset pubblici, e la validazione sperimentale si è limitata all'analisi immunoistochimica nei tessuti tumorali del colon. Inoltre, non sono stati condotti esperimenti funzionali per indagare i meccanismi molecolari precisi alla base del ruolo di TMED3 nella progressione tumorale. Pertanto, sono necessari ulteriori studi in vitro e in vivo per chiarire ulteriormente le funzioni biologiche e il potenziale significato terapeutico di TMED3 in diverse neoplasie maligne.

Materiali

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Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,5% Soluzione di ammoniaca	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd	CAS:1336-21-6	N/A
1% Alcool acido	Ningbo Chiwell Biotechnology Co., Ltd	CWGQ-HE-1001	N/A
10% Formalina tamponata neutra	Wuhan Huntz Biotechnology Co., Ltd	H-H8060	N/A
100% Etanolo	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd	CAS:64-17-5	N/A
70% Etanolo	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd	CAS:64-17-5	N/A
80% Etanolo	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd	CAS:64-17-5	N/A
95% Etanolo	Shandong Lirun Medical Technology Co., Ltd	CAS:64-17-5	N/A
Blu di Alciano	Baso Diagnostics Inc., Zhuhai	BA4121	N/A
cBioPortal	Memorial Sloan Kettering Cancer Center	N/A	SCR_014555
Buffer di recupero dell'antigene a base di citrato	Leica Biosystems Newcastle Ltd	AR9640-CN	N/A
pacchetto clusterProfiler	Bioconductor	N/A	SCR_016884
pacchetto DESeq2	Bioconductor	N/A	SCR_015687
Tetraidrocloruro di diaminobenzidina idrato	Leica Biosystems Newcastle Ltd	DS9800-CN	N/A
pacchetto ESTIMATE	R package	Versione 1.0.13	N/A
piattaforma GSCALite	GSCALite	N/A	N/A
database GTEx	GTEx Consortium	N/A	SCR_013042
Ematossilina	Ningbo Chiwell Biotechnology Co., Ltd	CWGQ-HE-1001	N/A
Perossido di idrogeno	OriGene Technologies, Inc	PV-6000D	N/A
Analisi di sopravvivenza Kaplan–Meier	pacchetto R survival	Versione 3.2-7	SCR_021137
Insiemi di geni KEGG	MSigDB	Versione 7.5.1	SCR_016863
Microscopio ottico	Zeiss Technology (Suzhou) Co., Ltd	N/A	N/A
Medium di impregnazione in paraffina	Dipartimento PATHO-Reagent della YL Company	CAS:8002-74-2	N/A
Sistema di rilevamento basato su polimeri	Leica Biosystems Newcastle Ltd	PV-6000	N/A
Software di analisi statistica R	R Foundation for Statistical Computing	Versione 4.2.1	SCR_001905
Anticorpo IgG anti-topo secondario di coniglio	Leica Biosystems Newcastle Ltd	DS9800-CN	N/A
Database TCGA	National Cancer Institute	N/A	SCR_003193
Anticorpo primario TMED3	CUSABIO Technology, Houston, USA	CSB-PA897107LA01HU	N/A
Salsa tamponata con Tris (TBS)	Leica Biosystems Newcastle Ltd	AR9590-CN	N/A
Database UALCAN	UALCAN	N/A	SCR_015827
Analisi statistica di Wilcoxon	pacchetto R stats	N/A	SCR_003005
Xilene	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd	CAS:1330-20-7	N/A

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