Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro standardizzato e riproducibile per valutare la capacità proliferativa e la differenziazione osteogenica e odontogenica di cellule staminali dentali umane coltivate su scaffold a base di nanomateriali, utilizzando saggi standardizzati (attività della fosfatasi alcalina, immunofluorescenza per RANKL [osteogenica] e immunofluorescenza per DMP-1 [odontogenica]) e strategie di normalizzazione per garantire la comparabilità tra studi.
Articolo metodologico
Un Protocollo Standardizzato in vitro per la Valutazione della Differenziazione e della Proliferazione di Cellule Staminali del Polpo Dentale Umano su Impalcature a Base di Nanomateriali
In questo articolo
Sommario
Abstract
La valutazione affidabile della differenziazione osteogenica e odontogenica, nonché della proliferazione delle cellule staminali, è fondamentale per analizzare le prestazioni biologiche delle strategie rigenerative basate su scaffold. Tuttavia, la variabilità nei protocolli sperimentali, nella scelta dei saggi e nell'interpretazione dei dati spesso limita la riproducibilità e il confronto tra studi. Il protocollo descritto in questo articolo presenta un flusso di lavoro standardizzato e riproducibile per la valutazione in vitro della differenziazione osteogenica e odontogenica, nonché della capacità proliferativa, di cellule staminali coltivate su scaffold biomaterici. L'impegno osteogenico viene valutato mediante l'attività enzimatica della fosfatasi alcalina (ALP) e l'immunofluorescenza per il legante del recettore activatore del fattore nucleare κB (RANKL), mentre l'impegno odontogenico viene valutato mediante immunofluorescenza per la proteina della matrice dentale-1 (DMP-1); entrambi i parametri proteici vengono quantificati utilizzando la metodologia standardizzata del punteggio H. Vengono dettagliati parametri sperimentali critici, inclusa la densità di semina cellulare, i tempi di induzione, le condizioni dei saggi, le strategie di normalizzazione (inclusa l'attività ALP normalizzata per proteine, la vitalità al MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro) normalizzata per cellule e il punteggio H dell'immunofluorescenza) e gli approcci all'analisi dei dati, insieme a indicazioni per la risoluzione dei problemi al fine di ridurre al minimo la variabilità tecnica. La metodologia è stata applicata come quadro standardizzato in numerosi studi sperimentali basati su scaffold, dimostrandone solidità e riproducibilità. Fornendo un quadro completo e validato, questo articolo mira a facilitare la valutazione standardizzata delle interazioni tra cellule staminali e scaffold e a migliorare il confronto tra studi rigenerativi preclinici.
Introduzione
L'endodonzia rigenerativa rappresenta un cambiamento di paradigma in odontoiatria, concentrandosi sul ripristino della vitalità della polpa dentale attraverso l'uso di cellule staminali, fattori di crescita e scaffold1,2. Mantenere la vitalità della polpa è essenziale per la funzione sensoriale e la risposta immunitaria ed è particolarmente importante nella gestione dei denti immaturi con polpe necrotiche, al fine di consentire un ulteriore sviluppo radicolare2.
Le cellule staminali del polipo dentale umano (DPSCs) e le cellule staminali della papilla apicale (SCAPs) sono candidate principali per queste procedure grazie al loro elevato potenziale proliferativo, capacità di autorinnovamento, proprietà immunosoppressive e alla loro abilità di differenziarsi in cellule simili agli odontoblasti in condizioni microambientali adeguate, rendendole candidate particolarmente valide per future applicazioni in medicina rigenerativa e interventi terapeutici basati sulle cellule3,5,4.
Mentre sono stati studiati materiali formulati in modo convenzionale, come i cementi a base di silicato di calcio, evidenze emergenti indicano che la modifica mediante nanoparticelle può influenzare in modo sostanziale le interazioni tra biomateriale e cellule6. I biomateriali nanostrutturati potrebbero fornire un microambiente più biomimetico, migliorando potenzialmente l'adesione delle cellule staminali e la differenziazione specifica per linea cellulare7. Tuttavia, il comportamento biologico di materiali nuovi, come NeoMTA2 in forma nanoparticellare, rimane insufficientemente compreso rispetto a materiali consolidati, come l'nanoidrossiapatite8. Questo protocollo affronta la necessità di un quadro metodologico standardizzato per valutare in modo accurato e riproducibile tali interazioni.
Questo schema standardizzato è particolarmente adatto a studi che valutano nuovi biomateriali o impalcature di nanomateriali in condizioni biologiche identiche, dove la comparabilità tra studi è fondamentale. Offre vantaggi rispetto agli approcci basati su un singolo saggio, integrando lo screening della vitalità (MTT), l'impegno osteogenico precoce (attività della ALP) e la differenziazione a livello proteico (punteggio H di immunofluorescenza) all'interno di un unico flusso di lavoro. I ricercatori che utilizzano la colorazione convenzionale con rosso alizarina o saggi a un singolo punto temporale possono trarre beneficio dall'adozione di questo schema multiparametrico per ridurre il bias dell'osservatore e migliorare la risoluzione quantitativa. Tuttavia, questo protocollo non è destinato a colture di organoidi tridimensionali, sistemi di co-coltura o modelli di cellule staminali di origine animale senza un'adeguata adattamento. Gli sperimentatori che necessitano di un profilo dell'espressione genica (ad esempio RT-qPCR per RUNX2, OCN o DSPP) dovrebbero integrare questo flusso di lavoro con saggi molecolari, poiché il presente protocollo si concentra esclusivamente su endpoint proteici ed enzimatici.
Per catturare in modo esaustivo la capacità bifunzionale di differenziazione delle cellule staminali dentali, questo protocollo impiega due marcatori complementari di immunofluorescenza che riflettono diversi endpoint biologici. RANKL (ligando del recettore attivatore del fattore nucleare kappa-B) viene utilizzato come marcatore dell'impegno verso la linea osteogenica: la sua espressione su cellule di tipo osteoblastico riflette il segnale di mineralizzazione mediato dagli ioni calcio e l'attivazione delle cellule formanti l'osso, in accordo con il suo utilizzo in diversi studi che valutano le SCAP4,8,9. Parallelamente, DMP-1 (proteina della matrice dentale-1) viene impiegato come marcatore specifico della differenziazione odontogenica/dentinogenica: il suo aumento di espressione in cellule di tipo odontoblastico riflette l'induzione della formazione della matrice dentinale e la riparazione del tessuto duro specifica del polso dentale, ed è particolarmente rilevante quando la popolazione cellulare bersaglio è rappresentata dalle DPSC10. Quantificando sia RANKL che DMP-1 all'interno dello stesso contesto sperimentale mediante la metodologia del punteggio H, questo protocollo consente ai ricercatori di distinguere l'impegno osteogenico da quello odontogenico, due esiti sovrapposti ma meccanicamente distinti delle interazioni tra cellule staminali e scaffold, senza richiedere disegni sperimentali separati.
Protocollo
Questo protocollo è stato approvato dal Comitato Etico della Facoltà di Odontoiatria dell'Università di Ain Shams con numero di approvazione FDASU-Rec IM112105. Tutte le procedure che hanno coinvolto tessuti umani sono state eseguite nel rispetto della Dichiarazione di Helsinki. Da tutti i partecipanti sono stati ottenuti consensi informati scritti prima dell'estrazione dei denti e del prelievo delle cellule staminali.
1. Preparazione e caratterizzazione di nanomateriali
- Sintetizzare nanomateriali secondo requisiti specifici10,11. Per Nano-NeoMTA2, macinare la polvere utilizzando un molino planetario a sfera (vedere Tabella dei Materiali) per 10 h a 350 giri/min con intervalli di 3 min acceso/spento. Utilizzare un rapporto ponderale sfere/polvere di 10:1 con sfere di macinazione in zirconia (diametro di 5 mm) in un contenitore di macinazione in zirconia. Verificare la dimensione finale delle particelle mediante microscopio elettronico a trasmissione (TEM) (obiettivo: <200 nm) prima di procedere.
ATTENZIONE: La polvere di NeoMTA2 può causare irritazione respiratoria se inalata. Eseguire tutti i passaggi di macinazione a secco in una cappa chimica certificata indossando una maschera respiratoria N95, occhiali di sicurezza e guanti in nitrile. - Preparare l'idrossiapatite nanostrutturata mediante un metodo di precipitazione chimica in soluzione8,11,12: 10Ca(NO₃)₂ + 6(NH₄)₃PO₄ + 8NH₄OH → Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂ + 20NH₄NO₃ + 6H₂O. Preparare 1 L di soluzione di nitrato di calcio 0,5 M e 0,6 L di soluzione di fosfato di ammonio 0,3 M, entrambe in acqua deionizzata. Aggiungere goccia a goccia la soluzione di nitrato di calcio alla soluzione di fosfato di ammonio a circa 2–3 mL/min sotto agitazione continua a 400 giri/min e riscaldare a 70 °C, mantenendo un pH di 10–12 mediante aggiunta goccia a goccia di idrossido di ammonio8.
ATTENZIONE: L'idrossido di ammonio è corrosivo e rilascia vapori tossici di ammoniaca. Manipolarlo esclusivamente in una cappa chimica. Indossare guanti resistenti agli acidi, occhiali protettivi e camice da laboratorio. In caso di contatto con la pelle, sciacquare immediatamente con acqua per ≥15 min. - Sottoporre il precipitato di apatite ottenuto a trattamento idrotermale in un'autoclave a 140 °C e 0,3 MPa per 2–3 h10. Liofilizzare il precipitato purificato a -50 °C sotto vuoto di ≤0,05 mbar per 48 h8.
- Preparare nanoparticelle di vetro bioattivo 45S5 utilizzando il metodo sol-gel come segue.
- Preparare la soluzione precursora mescolando 40 mL di ortosilicato di tetraetile (TEOS) con 10 mL di acido nitrico 2 M (HNO₃) come catalizzatore acido in un becher di polipropilene sotto agitazione continua a 300 giri/min a temperatura ambiente.
- Dopo 30 min, aggiungere nitrato di calcio tetraidrato (Ca(NO₃)₂·4H₂O) e nitrato di sodio (NaNO₃) per ottenere la composizione molare desiderata: 45 mol% SiO₂, 24,5 mol% CaO, 24,5 mol% Na₂O e 6 mol% P₂O₅. Aggiungere fosfato di trietile (TEP) come precursore del fosforo.
- Agitare a temperatura ambiente per 24 h. Invecchiare il gel a 60 °C per 24 h in un contenitore sigillato. Essiccare a 120 °C per 24 h. Calcinate in un forno muffola a 650 °C per 3 h (velocità di rampa: 2 °C/min). Macinare e verificare la composizione di fase mediante TEM e diffrazione a raggi X (XRD)4,9.
ATTENZIONE: Il TEOS e l'etanolo sono infiammabili. L'HNO₃ è corrosivo. Eseguire tutte le operazioni in una cappa chimica lontano da fonti di accensione.
- Caratterizzare tutte le nanoparticelle preparate mediante TEM ad alta risoluzione e XRD per confermare dimensione delle particelle e cristallinità8. Registrare la dimensione media delle particelle, l'indice di polidispersione (PDI) e il potenziale zeta mediante scattering dinamico della luce (DLS) per confermare la stabilità colloidale. Accettare lotti con dimensione media delle particelle <200 nm e potenziale zeta <−15 mV o >+15 mV.
2. Raccolta e coltura delle cellule staminali
- Isolare le DPSC o le SCAP dai terzi molari mandibolari inclusi appena estratti, dopo aver ottenuto il consenso informato scritto10. Processare i denti estratti entro 2 h dall'estrazione e trasportarli in soluzione salina tamponata al fosfato sterile (PBS) a 4 °C.
NOTA: I criteri di idoneità del donatore includono adulti sistemicamente sani di età compresa tra 18 e 35 anni, non fumatori, senza storia di assunzione di antibiotici nei precedenti 3 mesi, senza malattie parodontali e senza evidenza radiografica di patologia periapicale. - Isolare le cellule mediante il metodo di digestione enzimatica9. Triturare il tessuto dentale in frammenti di 1–2 mm e digerirli con una soluzione di collaghenasi di tipo I alla concentrazione di 3 mg/mL in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) senza siero per 1 h a 37 °C, con agitazione continua a 60 rpm su una piattaforma oscillante8. Neutralizzare con mezzo di coltura completo e filtrare attraverso un filtro cellulare da 70 µm.
ATTENZIONE: La collaghenasi di tipo I può contenere endotossine. Utilizzare esclusivamente collaghenasi di grado per colture cellulari e testata per la presenza di endotossine. Indossare guanti ed evitare l'inalazione. - Sezionare la sospensione di cellule singole in fiasche da 75 cm2 a una densità iniziale di 1 × 104 cellule/cm2 in mezzo di coltura completo costituito da DMEM, 10% di siero fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina/streptomicina (Tabella dei Materiali)8.
- Incubare le fiasche a 37 °C in un'atmosfera di 5% CO₂8. Monitorare crescita e contaminazione giornalmente mediante microscopio a contrasto di fase invertito10. Sostituire il mezzo di coltura ogni 48–72 h. Scartare qualsiasi fiasca che mostri segni di contaminazione (turbidità, variazione di colore, morfologia cellulare irregolare).
- Raccogliere le cellule dopo il terzo passaggio, quando si raggiunge una confluenza di circa il 70–80%8. Per il passaggio, aspirare il mezzo, risciacquare con PBS e staccare le cellule utilizzando tripsina-EDTA 0,25% a 37 °C per 3–5 min. Neutralizzare con mezzo di coltura completo, centrifugare a 300 x g per 5 min e riseminare a 1 × 104 cellule/cm2. Utilizzare esclusivamente cellule comprese tra il terzo e il sesto passaggio per mantenere la stabilità fenotipica.
3. Caratterizzazione delle cellule staminali
- Valutare l'immunofenotipo delle cellule isolate mediante citometria a flusso8,10. Caratterizzare le cellule al terzo passaggio. Includere un controllo negativo non colorato e controlli di compensazione singolarmente colorati per ogni fluorocromo utilizzato.
- Regolare il numero di cellule a 106/mL in PBS. Centrifugare a 800 x g per 10 minuti e lavare il pellet due volte con PBS8,10.
- Colorare le cellule con anticorpi anti-umani per i marcatori mesenchimali (CD44, CD43) e per i marcatori ematopoietici (CD45) alle diluizioni raccomandate dal produttore (tipicamente 1:100 in PBS contenente l'1% di albumina sierica bovina (BSA) (Tabella dei Materiali)8,10. Incubare a 4 °C per 45 minuti al buio. Lavare due volte con PBS e risospendere in 300 µL di PBS per l'acquisizione.
- Analizzare le cellule mediante software di analisi della citometria a flusso (Tabella dei Materiali) per valutare l'immunofenotipo (espressione di CD44 e CD73, con CD45 come marcatore di esclusione ematopoietica). Applicare un gating sequenziale: (a) gating in base allo scatter (FSC-A vs. SSC-A); (b) esclusione dei doppietti (FSC-H vs. FSC-A); (c) impostazione di gate specifici per fluorocromo rispetto ai controlli non colorati. Riportare la percentuale di cellule positive per ciascun marcatore insieme alla strategia di gating.
4. Determinazione della concentrazione sicura del materiale (concentrazione efficace al 50%, EC₅₀)
- Determinare l'EC₅₀ utilizzando un software di analisi statistica (GraphPad Prism 9). Adattare i dati dose-risposta a una curva sigmoidea di regressione non lineare (modello logistico a quattro parametri: Y = Bottom + (Top − Bottom) / (1 + 10^((LogEC₅₀ − X) × HillSlope))). Riportare il valore di EC₅₀ in µg/mL con intervallo di confidenza al 95%8.
- Preparare diluizioni seriali dei nanomateriali (50, 25, 12,5, 6,25, 3,12 e 1,56 µg/mL) in 1 mL di PBS. Vortexare la sospensione madre per 30 s, quindi sottoporre a sonificazione (sonicatore a sonda, 40 W, 30 s on/10 s off per 3 cicli a 4 °C) per garantire una sospensione omogenea. Sterilizzare con raggi UV in cappa biosicura sotto luce UV per 30 minuti.
- Coltivare le cellule staminali a una densità di 1 × 104 cellule/pozzetto in piastre a 96 pozzetti per 72 h con le diverse concentrazioni e contare le cellule vitali utilizzando l'esclusione al blu di tripano per calcolare l'EC₅₀ mediante il modello logistico a quattro parametri descritto al punto 4.1.
- Eseguire gli esperimenti in triplicato (n = 3 pozzetti indipendenti per concentrazione) con almeno tre replicati biologici. Riportare i valori di EC₅₀ come media ± DS e calcolare il coefficiente di variazione (CV%) tra i replicati (CV accettabile <15%).
5. Valutazione della differenziazione osteogenica e odontogenica
NOTA: questa sezione valuta due percorsi di differenziazione complementari mediante saggi di immunofluorescenza paralleli effettuati sulla stessa preparazione cellulare. RANKL (passaggio 5.5) funge da marcatore osteogenico; DMP-1 (passaggio 5.6) funge da marcatore odontogenico. Entrambi vengono quantificati con la stessa metodologia del punteggio H (passaggio 5.8). Eseguire entrambi i saggi su coprioggetti separati preparati contemporaneamente.
- Sezionare le cellule staminali in piastre a sei pozzetti a una densità di 4,5 × 105 cellule/pozzetto. Lasciare aderire le cellule per 24 h in mezzo di coltura completo prima di avviare la differenziazione.
- Assegnare i campioni a quattro gruppi: controllo negativo (DMEM da solo), controllo positivo (mezzo di differenziazione osteogenico/odontogenico) e gruppi sperimentali (nanomateriali a concentrazioni sicure derivate dalla EC₅₀).
- Preparare il mezzo di differenziazione osteogenico aggiungendo al DMEM il 10% di FBS, l'1% di penicillina/streptomicina, 10 mM di β-glicerofosfato, 50 µg/mL di acido ascorbico (L-ascorbato-2-fosfato) e 100 nM di desametasone. Sostituire il mezzo ogni 48 h. Incubare per 72 h a 37 °C e 5% CO₂.
- Misurazione dell'attività della fosfatasi alcalina (ALP)
- Sezionare le cellule in piastre da coltura a 24 pozzetti a 1 × 104 cellule/pozzetto e incubare a 37 °C in atmosfera umidificata con 5% CO₂ per 72 h.
- Aspirare il mezzo di coltura, risciacquare i pozzetti con PBS e lisare le cellule aggiungendo 200 µL di tampone di lisi per pozzetto (0,1% Triton X-100 in PBS) e incubando a 4 °C per 10 min con agitazione delicata.
- Raccogliere il lisato e centrifugare a 500 x g per 5 min a 4 °C; utilizzare il surnatante per tutte le misurazioni successive dell'ALP. Trasferire 50 µL di ciascun campione di prova e 100 µL di standard di p-nitrofenolo in una piastra micropozzetti a 96 pozzetti. Aggiungere il tampone substrato AMP (Tabella dei Materiali) per avviare la reazione catalitica.
- Dopo un'ulteriore incubazione di 30 min a 37 °C, arrestare la reazione aggiungendo 50 µL di NaOH 0,5 M per pozzetto. Misurare immediatamente l'assorbanza a 405 nm utilizzando un lettore di micropiastre per assorbanza (Tabella dei Materiali).
- Generare una curva standard di assorbanza in funzione della concentrazione di p-nitrofenolo e calcolare l'attività dell'ALP in U/L.
- Determinare il contenuto proteico totale dello stesso lisato cellulare mediante saggio proteico di Bradford o BCA. Normalizzare l'attività dell'ALP rispetto al contenuto proteico totale e riportare i risultati finali come U/mg di proteina.
- Marcatore osteogenico (RANKL)
- Valutare l'espressione proteica di RANKL mediante immunofluorescenza. Preparare innanzitutto controlli di isotipo e controlli con solo anticorpo secondario: (a) sostituire l'anticorpo primario con un IgG di coniglio appaiato per isotipo alla stessa concentrazione e (b) omettere completamente l'anticorpo primario in pozzetti separati.
- Fissare le cellule con formaldeide al 4% appena preparata in PBS per 15 min a temperatura ambiente. Lavare tre volte con PBS (5 min ciascuno).
- Permeabilizzare con Triton X-100 0,1% in PBS per 10 min, quindi bloccare con siero di capra normale al 5% in PBS per 1 h a temperatura ambiente per ridurre il legame non specifico. Senza lavaggio, aggiungere direttamente l'anticorpo primario Coniglio Anti-RANKL in tampone di blocco a diluizione 1:200 (Tabella dei Materiali) e incubare tutta la notte a 4 °C.
- Lavare tre volte con PBS, quindi incubare con l'anticorpo secondario coniugato a fluorocromo Capra Anti-Coniglio IgG a diluizione 1:500 in tampone di blocco (Tabella dei Materiali) per 1 h a temperatura ambiente al buio8. Dopo l'incubazione con l'anticorpo secondario, lavare tre volte con PBS (5 min ciascuno) e procedere direttamente al passaggio 5.7 per il montaggio.
ATTENZIONE: La formaldeide (soluzione al 4%) è un fissativo tossico e un probabile cancerogeno. Prepararla e utilizzarla esclusivamente in una cappa chimica certificata. Indossare guanti in nitrile, occhiali protettivi e camice da laboratorio. Smaltire i rifiuti secondo le linee guida istituzionali.
NOTA. L'identità delle cellule viene invece confermata mediante microscopia a contrasto di fase e criteri morfologici prima della valutazione dell'immunofluorescenza (vedere passaggio 5.10).
- Marcatore odontogenico (DMP-1)
NOTA: Valutare l'espressione proteica di DMP-1 (proteina della matrice dentinale-1) mediante immunofluorescenza in parallelo al passaggio 5.5 per valutare l'impegno odontogenico.- Utilizzando un set separato di coprioggetti dalla stessa preparazione cellulare, ripetere tutti i passaggi di fissazione, permeabilizzazione e bloccaggio descritti nel passaggio 5.5, inclusi i controlli di isotipo e con solo anticorpo secondario.
- Senza lavaggio dopo il bloccaggio, aggiungere direttamente l'anticorpo primario anti-DMP-1 (vedere Tabella dei Materiali) a diluizione 1:200 in tampone di blocco e incubare tutta la notte a 4 °C. Lavare tre volte con PBS, quindi incubare con l'anticorpo secondario appropriato coniugato a fluorocromo (utilizzare un fluorocromo spettralmente distinto da quello usato per RANKL; vedere Tabella dei Materiali) a diluizione 1:500 in tampone di blocco per 1 h a temperatura ambiente al buio.
- Acquisire immagini in fluorescenza a 10x di ingrandimento per valutare l'espressione di DMP-1 come indicatore di differenziazione di tipo odontoblastico10. Dopo l'incubazione con l'anticorpo secondario, lavare tre volte con PBS (5 min ciascuno) e procedere direttamente al passaggio 5.7 per il montaggio.
- Montare i vetrini con mezzo di montaggio antifade (vedere Tabella dei Materiali) e lasciare polimerizzare tutta la notte a temperatura ambiente. Montare separatamente i vetrini colorati per RANKL e DMP-1 e etichettarli chiaramente (ad esempio, "RANKL Gruppo 1" e "DMP-1 Gruppo 1") prima dell'acquisizione delle immagini.
- Esaminare immediatamente i vetrini mediante microscopia a fluorescenza o conservarli a 4 °C al riparo dalla luce. Quantificare l'espressione proteica valutando l'intensità della colorazione utilizzando un sistema di punteggio standardizzato a quattro livelli: 0 (nessuna colorazione), 1+ (debole), 2+ (moderata) e 3+ (forte).
- Acquisire immagini utilizzando impostazioni identiche del microscopio (tempo di esposizione, potenza del laser e guadagno) per tutti i gruppi sperimentali. Applicare impostazioni identiche in modo indipendente per ciascun marcatore (RANKL e DMP-1) per garantire coerenza intra-marcatori tra i gruppi.
- Valutare un minimo di cinque campi ad alto ingrandimento (obiettivo x20) scelti casualmente per pozzetto. Due osservatori indipendenti e in cieco devono effettuare la valutazione e riportare il coefficiente kappa di Cohen (kappa accettabile ≥ 0,7).
- Calcolare il punteggio H utilizzando la formula: punteggio H = Σ(i × Pi), dove i = intensità della colorazione (1, 2 o 3) e Pi = percentuale di cellule (0–100%) a ciascun livello di intensità.
NOTA: Il punteggio H varia da 0 a 30010. - Normalizzare i dati del punteggio H rispetto al numero totale di cellule per campo, determinato contando manualmente tutte le cellule visibili in ciascun campo mediante microscopia a contrasto di fase prima dell'acquisizione delle immagini in immunofluorescenza, per tenere conto delle differenze di densità cellulare tra i pozzetti.
- Calcolare e riportare separatamente i punteggi H per RANKL (parametro osteogenico) e DMP-1 (parametro odontogenico) per consentire un confronto diretto tra i due percorsi di differenziazione.
6. Valutazione della proliferazione e della vitalità
- Effettuare il conteggio cellulare utilizzando un emocitometro e la colorazione con blu di tripano per distinguere le cellule vitali da quelle non vitali. Calcolare il numero totale di cellule vitali per mL di coltura. Contare almeno 100 cellule per campione per garantire affidabilità statistica.
- Condurre il saggio MTT per misurare l'attività metabolica mitocondriale8,10.
- Aggiungere la soluzione di MTT a una concentrazione finale di 0,5 mg/mL (Tabella dei Materiali) alle cellule e incubare per 4 h a 37 °C. Rimuovere la soluzione, aggiungere un agente solubilizzante (ad esempio, SDS-HCl; vedere Tabella dei Materiali) e misurare la densità ottica a 570 nm utilizzando uno spettrofotometro (lunghezza d'onda di riferimento: 630–650 nm).
- Calcolare la vitalità cellulare come segue: Vitalità (%) = (Assorbanza delle cellule trattate / Assorbanza delle cellule di controllo non trattate) × 100. Valori >100% indicano una stimolazione proliferativa rispetto al controllo negativo. Includere un pozzetto vuoto per la correzione del fondo.
- Normalizzare i risultati rispetto al numero di cellule utilizzando un conteggio parallelo con blu di tripano. Eseguire tutti i saggi in triplicato (n = 3 pozzetti/gruppo, ≥3 replicati biologici).
ATTENZIONE: Il tampone di solubilizzazione SDS-HCl è corrosivo. Manipolarlo indossando dispositivi di protezione individuale adeguati. Smaltire i rifiuti contenenti formazano in conformità con le normative istituzionali.
Risultati
Tutti i risultati presentati in questo articolo sono stati adattati da studi complementari4,8,9,10 condotti dallo stesso gruppo di ricerca sotto un'unica approvazione etica istituzionale (FDASU-Rec IM112105).
Caratterizzazione dei nanomateriali e isolamento delle cellule staminali
Il flusso di lavoro standardizzato fornisce inizialmente una conferma quantificabile delle proprietà del scaffold e dei fenotipi delle cellule staminali. Dopo la sintesi, i nanomateriali preparati vengono convalidati mediante microscopia elettronica a trasmissione ad alta risoluzione (TEM) e diffrazione a raggi X (XRD) per confermare la dimensione delle particelle e la cristallinità (Figura 1A,B). Parallelamente, le DPSC o le SCAP isolate mediante digestione enzimatica mostrano un forte attaccamento e proliferazione nel mezzo di coltura completo. L'analisi mediante citometria a flusso convalida l'immunofenotipo delle cellule raccolte al terzo passaggio, rivelando un'elevata espressione di marcatori mesenchimali (CD44, CD43) e confermando la loro origine non ematopoietica attraverso l'assenza di CD45 (Figura 1C).
Stabilimento della concentrazione sicura del materiale e della proliferazione
Coltivando cellule staminali in diluizioni seriali dei nanomateriali (50–1.56 µg/mL) per 72 h, la regressione logistica a quattro parametri dei conteggi di cellule vitali fornisce un valore EC₅₀ affidabile (modello di dose-risposta sigmoidale non lineare, come descritto al passaggio 4.1). Valori di viabilità MTT superiori al 100% indicano una stimolazione proliferativa rispetto al controllo non trattato, poiché i valori sono normalizzati rispetto al gruppo di controllo negativo (cellule non trattate impostate al 100%). Un valore di circa il 196% per Nano-NeoMTA2, ad esempio, riflette una stimolazione bioattiva dell'attività mitocondriale piuttosto che una sopravvivenza cellulare assoluta >100%9.
In diversi studi che applicano questo protocollo standardizzato, sono stati determinati valori di EC₅₀ pari a 7,9 µg/mL (Nano-NeoMTA2, SCAPs)8 e 9,92 µg/mL (Nano-NeoMTA2, DPSCs)10 utilizzando il modello logistico a quattro parametri (passaggio 4.1), confermando concentrazioni di lavoro sicure per l'uso nei saggi di differenziamento descritti nel presente protocollo. Questi valori sono riportati nella Tabella 1 come metriche rappresentative di validazione.
Quantificazione della differenziazione osteogenica e odontogenica (valutazione con doppio marcatore)
L'approccio di immunofluorescenza doppia fornisce due misure distinte e complementari di esito a partire dalla stessa preparazione cellulare. Per la valutazione osteogenica, i punteggi H di RANKL hanno differenziato tutti e quattro i gruppi con significatività statistica: le cellule coltivate con Nano-NeoMTA2 hanno mostrato un'espressione di RANKL sostanzialmente più elevata rispetto al controllo negativo, coerentemente con un'attivazione di tipo osteoblastico aumentata (Figura 2A, Tabella 1)8,9Per la valutazione odontogenica, i punteggi H di DMP-1 hanno rivelato una marcata differenziazione di tipo odontoblasto nelle DPSCs coltivate con Nano-NeoMTA2, con punteggi H significativamente più elevati rispetto ai gruppi con nanoidrossiapatite e al gruppo controllo negativo, confermando un impegno preferenziale verso la differenziazione dentinogenica. (Figura 3A, Tabella 1)10L'identità cellulare è stata confermata mediante microscopia a contrasto di fase e criteri morfologici caratteristici (forma a fuso o poligonale) prima del conteggio.
L'attività di ALP è stata distinta mediante analisi spettrofotometrica tra tutti i gruppi a 405 nm, fungendo da marcatore enzimatico precoce sia dell'impegno osteogenico che odontogenico (Tabella 1). L'analisi spettrofotometrica con MTT ha confermato che tutti i nanomateriali, a concentrazioni sicure derivate dall'EC₅₀, mantenevano un'elevata vitalità cellulare rispetto al controllo negativo, in accordo con i valori rappresentativi presentati (Tabella 1).
Esiti sperimentali subottimali e non riusciti
Gli esiti subottimali sono riassunti nella Tabella 2. Una bassa vitalità cellulare nel saggio MTT indica generalmente che la concentrazione del nanomateriale supera la soglia di EC₅₀ oppure che la sterilizzazione UV è stata insufficiente. Un'assorbanza ALP non uniforme (CV > 20%) indica solitamente una densità di semina irregolare o un'omogeneizzazione incompleta del buffer di lisi. Un segnale di immunofluorescenza debole o assente per RANKL o DMP-1 deriva più comunemente dall'inattivazione dell'anticorpo, da una permeabilizzazione insufficiente o da un'eccessiva fissazione; l'uso di formaldeide fresca al 4% e di aliquote monouso dell'anticorpo risolve questo problema. La cross-reattività tra i canali di RANKL e DMP-1 deve essere esclusa esaminando le immagini di controllo con solo il secondo anticorpo prima della valutazione.
Figura 1: Caratterizzazione standardizzata dei nanomateriali e validazione del fenotipo delle cellule staminali. (A) Spettri XRD che confermano la fase cristallina e l'integrità strutturale delle nanoparticelle. (B) Immagini rappresentative al microscopio elettronico a trasmissione (TEM) che mostrano le dimensioni nanometriche, la morfologia e la dispersione omogenea dei biomateriali sintetizzati; confronto tra NeoMTA2 e idrossiapatite. Viste a basso ingrandimento sono mostrate per (a) NeoMTA2 e (b) idrossiapatite, mentre dettagli a ingrandimento maggiore sono riportati in (c) NeoMTA2 e (d) idrossiapatite. Le barre della scala sono indicate nell'angolo in basso a sinistra. (C) Protocollo di gating in citometria a flusso per la caratterizzazione delle cellule staminali. Diagrammi puntati multiparametrici rappresentativi mostrano cellule marcate per CD44, CD73 (etichettato CD43 PE nei grafici originali) e CD45. Le sottopopolazioni CD44+ e CD73+ sono state selezionate in funzione dell'espressione di CD45. Il pannello A e C è adattato da Zaki et al.8 (CC BY-NC-SA) e il pannello B è adattato da Habib et al.10 (CC BY-NC). Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Valutazione quantitativa e semi-quantitativa della differenziazione osteogenica mediante immunofluorescenza per RANKL. (A) Micrografie immunofluorescenti rappresentative ad alta risoluzione che mostrano l'espressione dei marcatori proteici osteogenici chiave RANKL all'interno del microambiente del scaffold 2D. (a) Le cellule del controllo negativo formano piccole colonie con espressione debole e membranosa di RANKL, mentre (b) le cellule del controllo positivo mostrano un numero maggiore di colonie simili a osteoblasti con espressione densa e omogenea. Le cellule staminali trattate con (c) NHAP, (d) NHAP/chitosano e (e) nanoparticelle di vetro bioattivo mostrano una differenziazione avanzata, caratterizzata da grandi colonie simili a osteoblasti fuse, con intensa e omogenea localizzazione di RANKL sia nella membrana che nel nucleo; adattato da: Elshahat et al.4. (B) Grafici a barre che rappresentano la quantificazione dell'H-score dell'espressione di RANKL nei diversi studi. Applicazione della metodologia dell'H-score per la normalizzazione dei dati di immunofluorescenza. Integrando matematicamente l'intensità visiva della colorazione (valutata da 0 a 3) con la percentuale di cellule positivamente colorate, l'H-score trasforma l'analisi qualitativa al microscopio in una metrica robusta e semi-quantitativa, riducendo significativamente il bias soggettivo dell'osservatore. (a) Confronto tra Nano-NeoMTA2 (7,9 µg/mL) e nanoparticelle di vetro bioattivo (NBG; 500 µg/mL) rispetto al mezzo osteogenico (controllo positivo, OM-PC) e al controllo negativo DMEM (DMEM-NC). NBG induce il profilo di espressione più elevato (p < 0,001). Adattato da Abdelaziz et al. 9 (CC BY-NC-ND 4.0). (b) Valutazione di nanoidrossiapatite (NHAP; 10 µg/mL), composito NHAP/chitosano (10 µg/mL) e NBG (500 µg/mL) rispetto ai controlli, con il composito NHAP/chitosano che mostra i valori massimi di H-score. Adattato da Elshahat et al.4 (CC BY 4.0). (c) Valutazione di Nano-NeoMTA2 (7,9 µg/mL) rispetto a NHAP (10 µg/mL) e ai controlli, che mostra un'espressione di RANKL significativamente più elevata nel Nano-NeoMT; adattato da: Zaki et al.8. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Immagini rappresentative di immunofluorescenza e analisi degli H-score. (A) Valutazione mediante microscopia a immunofluorescenza dell'espressione della Proteina della Matrice Dentina (DMP-1) nei diversi gruppi sperimentali; la fluorescenza verde indica una colorazione positiva per gli anticorpi policlonali anti-DMP-1. (a) Controllo negativo: cellule staminali del polipo dentale umano (hDPSCs) coltivate in mezzo non differenziante (UM) mostrano piccoli aggregati cellulari con debole espressione uniforme di DMP-1 (+). (b) Controllo positivo: le hDPSCs in mezzo odontogenico (OM) mostrano un'espansione delle colonie caratterizzata da segnali intensi ed omogenei di DMP-1 (++). (c) Nanoidrossiapatite (10 μg/mL) e (d) Nano-NeoMTA2 (9,92 μg/mL): le hDPSCs differenziate formano ampie colonie fuse di cellule simili agli odontoblasti, con forte espressione omogenea di DMP-1 localizzata a livello delle membrane e dei nuclei. Ingrandimento: ×10. I cerchi gialli indicano colonie di tipo odontoblastico; le frecce gialle indicano un'espressione intensa di DMP-1. (B) Grafico a barre che riporta la quantificazione degli H-score relativi all'espressione della Proteina della Matrice Dentina nei diversi gruppi dello studio. È stata osservata una differenza altamente significativa tra i gruppi, con lo score H più elevato nel gruppo Nano-NeoMTA2 (169,33 ± 4,04), seguito da nanoidrossiapatite (140,33 ± 2,52) e dal controllo negativo (15,33 ± 1,53). I pannelli A e B sono tratti da Habib et al.10 (CC BY-NC). Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Saggio / Parametro | Nanomateriale / Tipo cellulare | Valore rappresentativo (Media ± DS) | Normalizzazione | Fonte |
| Vitalità cellulare (saggio MTT) | ||||
| Vitalità MTT | Nano-NeoMTA2 (7,9 µg/mL) / SCAPs | ~196% (OD = 1,56 ± 0,24) | Normalizzato rispetto al controllo non trattato (DMEM-NC = 100%) | Abdelaziz et al.⁹ |
| Vitalità MTT | Chitosan-nHA (10 µg/mL) / SCAPs | ~99,97% | Normalizzato rispetto al controllo non trattato (DMEM-NC = 100%) | Elshahat et al.⁴ |
| Vitalità MTT — Controllo positivo | OM-PC / SCAPs | 113,46% (OD = 0,93 ± 0,03) | Normalizzato rispetto al controllo non trattato (DMEM-NC = 100%) | Abdelaziz et al.⁹ |
| Vitalità MTT — Controllo negativo | DMEM-NC / SCAPs | 100% (OD = 0,82 ± 0,02) — Linea di base di riferimento | DMEM-NC definito come riferimento al 100% per tutti i gruppi | Abdelaziz et al.⁹ |
| Attività della fosfatasi alcalina (ALP) | ||||
| Attività ALP | Nanoparticelle di vetro bioattivo (500 µg/mL) / SCAPs | 69,86 ± 0,98 U/L | Normalizzato rispetto al contenuto proteico totale (U/mg proteina, saggio di Bradford/BCA) | Abdelaziz et al.⁹ |
| Attività ALP — Controllo positivo | OM-PC / SCAPs | 77,68 ± 1,28 U/L | Normalizzato rispetto al contenuto proteico totale (U/mg proteina, saggio di Bradford/BCA) | Abdelaziz et al.⁹ |
| Attività ALP — Controllo negativo | DMEM-NC / SCAPs | 55,81 ± 1,6 U/L | Normalizzato rispetto al contenuto proteico totale (U/mg proteina, saggio di Bradford/BCA) | Abdelaziz et al.⁹ |
| Concentrazione sicura del materiale (EC₅₀) | ||||
| EC₅₀ (SCAPs) | Nano-NeoMTA2 / SCAPs | 7,9 µg/mL | Modello logistico a quattro parametri (risposta dose-effetto sigmoidale non lineare, GraphPad Prism 9) | Zaki et al.⁸ |
| EC₅₀ (DPSCs) | Nano-NeoMTA2 / DPSCs | 9,92 µg/mL | Modello logistico a quattro parametri (risposta dose-effetto sigmoidale non lineare, GraphPad Prism 9) | Habib et al.10 |
| Punteggio H — Espressione proteica RANKL (marcatore osteogenico) | ||||
| Punteggio H (RANKL) marcatore osteogenico | Nano-NeoMTA2 (7,9 µg/mL) / SCAPs | 164 ± 4 (scala 0–300) | Numero totale di cellule visibili per campo (microscopia a contrasto di fase) | Zaki et al.⁸ |
| Punteggio H (RANKL) marcatore osteogenico | nHA (10 µg/mL) / SCAPs | 68 ± 3 (scala 0–300) | Numero totale di cellule visibili per campo (microscopia a contrasto di fase) | Zaki et al.⁸ |
| Punteggio H (RANKL) Controllo positivo | OM-PC / SCAPs | 84 ± 1 (scala 0–300) | Numero totale di cellule visibili per campo (microscopia a contrasto di fase) | Zaki et al.⁸ |
| Punteggio H (RANKL) Controllo negativo | DMEM-NC / SCAPs | 18 ± 1 (scala 0–300) | Numero totale di cellule visibili per campo (microscopia a contrasto di fase) | Zaki et al.⁸ |
| Punteggio H — Espressione proteica DMP-1 (marcatore odontogenico) | ||||
| Punteggio H (DMP-1) marcatore odontogenico | Nano-NeoMTA2 (9,92 µg/mL) / DPSCs | 169,33 ± 4,04 (scala 0–300) | Numero totale di cellule visibili per campo (microscopia a contrasto di fase) | Habib et al.10 |
| Punteggio H (DMP-1) marcatore odontogenico | nHA (10 µg/mL) / DPSCs | 140,33 ± 2,52 (scala 0–300) | Numero totale di cellule visibili per campo (microscopia a contrasto di fase) | Habib et al.10 |
| Punteggio H (DMP-1) Controllo negativo | DMEM-NC / DPSCs | 15,33 ± 1,53 (scala 0–300) | Numero totale di cellule visibili per campo (microscopia a contrasto di fase) | Habib et al.10 |
| Punteggio H (DMP-1) marcatore odontogenico [Controllo positivo -OM-PC] | OM-PC / DPSCs | ~103 punteggio H (scala 0–300) | Numero totale di cellule per campo (microscopia a contrasto di fase) | Habib et al. Eur Endod J, 202610 |
| Punteggio H = Σ(i × Pi): i = intensità della colorazione (1, 2 o 3); Pi = percentuale di cellule a ciascun livello di intensità (0–100%); intervallo 0–300. La vitalità MTT è espressa in rapporto al DMEM-NC fissato come riferimento al 100%. L'attività ALP è espressa in U/L derivante dalla de-fosforilazione enzimatica del p-nitrofenil fosfato; ulteriormente normalizzata rispetto al contenuto proteico totale (U/mg proteina). OM-PC = mezzo di induzione osteogenica/odontogenica (controllo positivo). DMEM-NC = Dulbecco’s Modified Eagle Medium (controllo negativo). | ||||
Tabella 1: Risultati rappresentativi del protocollo di valutazione in vitro standardizzato. Risultati quantitativi rappresentativi da studi precedentemente pubblicati che dimostrano analisi di proliferazione cellulare, attività della fosfatasi alcalina e analisi di immunofluorescenza eseguite utilizzando il protocollo standardizzato.
| Problema osservato | Causa potenziale | Soluzione consigliata |
| Bassa vitalità cellulare nel saggio MTT (OD < controllo non trattato | La concentrazione del nanomateriale supera l'EC₅₀, oppure la sterilizzazione UV è insufficiente, oppure la dispersione delle nanoparticelle è inadeguata. | Ripetere la determinazione della CE₅₀ (Sezione 4). Prolungare la sterilizzazione UV a 30 min. Verificare la sospensione omogenea delle nanoparticelle mediante sonificazione con sonda (40 W, 30 s acceso/spento, 3 cicli a 4 °C) immediatamente prima dell'uso. |
| Viabilità con MTT CV >15% tra le repliche | Errore di pipettaggio, semina cellulare non uniforme o variabilità del tempo/temperatura di incubazione con MTT. | Utilizzare una pipetta multicanale calibrata per tutte le aggiunte. Verificare la densità di semina mediante emocitometro prima della piastratura. Mantenere un'incubazione rigorosa di 4 h a 37 °C in un incubatore ad umidità controllata con anidride carbonica. Includere una pozzetta vuota per la correzione del fondo. |
| Letture inconsistenti dell'assorbanza della ALP (CV >20% tra pozzetti | Densità irregolare di semina cellulare, lisi cellulare incompleta o incoerenza nel pipettaggio durante l'aggiunta del substrato. | Attenersi rigorosamente a 1 × 10⁴ cellule/pozzetto in piastre da 24 pozzetti. Vortexare accuratamente il buffer di lisi prima dell'uso. Mantenere un'incubazione di lisi costante (10 min, 4 °C, agitazione delicata). Verificare l'assorbanza di fondo con un pozzetto privo di cellule (bianco). |
| Immunofluorescenza debole o assente per RANKL segnale (passaggio 5.4a) | Inattivazione dell'anticorpo dovuta a un'immagazzinamento inadeguato, a una fissazione eccessiva che riduce la disponibilità dell'epitopo o a una permeabilizzazione insufficiente. | Preparare aldeide fresca al 4% immediatamente prima dell'uso. Aggiungere la permeabilizzazione con Triton X-100 0,1% (10 min, a temperatura ambiente) prima del blocco. Titolare la diluizione dell'anticorpo primario (iniziare da 1:200). Includere una sezione di tessuto controllo positivo. Aliquotare la soluzione madre di anticorpo per evitare cicli ripetuti di congelamento e scongelamento. |
| Immunofluorescenza debole o assente per DMP-1 segnale (passaggio 5.4b) | Inattivazione dell'anticorpo dovuta a cicli di congelamento-scongelamento, diluizione non ottimale dell'anticorpo primario o specie ospite dell'anticorpo secondario incompatibile. | Aliquotare l'anticorpo anti-DMP-1 per evitare cicli di congelamento e scongelamento. Titolare la diluizione a partire da 1:200. Verificare la compatibilità tra le specie ospiti dell'anticorpo primario (DMP-1) e secondario. Includere una sezione di tessuto dentinale come controllo positivo per DMP-1. |
| Cross-reattività tra RANKL e DMP-1 canali di fluorescenza | Sovrapposizione spettrale negli spettri di emissione se lo stesso fluorocromo viene utilizzato per entrambi gli anticorpi secondari, oppure separazione inadeguata dei canali sul microscopio a fluorescenza. | Utilizzare fluorocromi a base di anticorpi secondari spettralmente distinti per RANKL e DMP-1 (ad esempio, Alexa Fluor 488 per un marcatore, Alexa Fluor 594 per l'altro). Esaminare separatamente le immagini dei controlli con solo l'anticorpo secondario per ciascun canale prima dell'analisi. Acquisire le immagini di RANKL e DMP-1 separatamente utilizzando la modalità di acquisizione sequenziale. |
| Elevato fondo non specifico in colorazione immunofluorescenza | Bloccaggio proteico insufficiente, concentrazione dell'anticorpo secondario troppo elevata o lavaggi inadeguati tra le incubazioni. | Prolungare l'incubazione di blocco a 2 h a temperatura ambiente. Aumentare la diluizione dell'anticorpo secondario a 1:1000. Verificare la specificità con il controllo senza anticorpo primario (solo anticorpo secondario). Assicurarsi che tutti i lavaggi con PBS siano completi (3 × 5 min ciascuno). |
| Variabilità inter-osservatore del punteggio H (Kappa di Cohen) <0,7, passaggio 5,6) | Applicazione non uniforme della scala di intensità di colorazione a quattro livelli (0, 1+, 2+, 3+) tra diversi osservatori, oppure calibrazione insufficiente prima delle sessioni di valutazione. | Eseguire una sessione congiunta di calibrazione utilizzando immagini di addestramento rappresentative prima della valutazione formale. Utilizzare impostazioni di visualizzazione delle immagini identiche (luminosità, contrasto) per tutti gli osservatori. Valutare un minimo di cinque campi ad alto ingrandimento per pozzetto e calcolare il kappa ogni 10 campi per monitorare eventuali scostamenti. |
| La curva EC₅₀ non converge oppure l'adattamento è scadente (passaggio 4.1) | Numero insufficiente di punti dati, intervallo di concentrazione troppo ristretto o sospensione non omogenea prima della semina. | Espandere la gamma di diluizioni seriali per includere almeno 6 concentrazioni comprese tra 50–1.56 µg/mL. Assicurarsi che la sonicazione con sonda venga eseguita immediatamente prima di ogni passaggio di diluizione. Ripetere con almeno 3 replicati biologici indipendenti. Verificare il CV <15% tra le repliche. |
Tabella 2: Parametri critici e guida alla risoluzione dei problemi. Problemi tecnici comuni riscontrati durante il protocollo, le loro possibili cause e le soluzioni consigliate per migliorare la riproducibilità sperimentale e la qualità dei dati. Abbreviazioni: CV = coefficiente di variazione; RT = temperatura ambiente.
Discussione
I passaggi critici di questo protocollo includono la determinazione accurata dell'EC₅₀, la sospensione omogenea dei nanomateriali e la normalizzazione dei risultati dei saggi biologici. Il calcolo dell'EC₅₀ mediante regressione non lineare (modello logistico a quattro parametri) fornisce una stima più rigorosa della risposta in funzione della dose rispetto all'interpolazione lineare e dovrebbe essere preferito quando sono disponibili un numero sufficiente di punti dati13,14. È fondamentale garantire una sospensione omogenea delle nanoparticelle mediante sonificazione con sonda immediatamente prima dell'esposizione cellulare; sospensioni scarsamente disperse producono curve dose-risposta non affidabili e alterano le stime dell'EC₅₀. Per materiali nuovi come NeoMTA2, la macinazione su scala nanometrica rappresenta un passaggio essenziale iniziale, poiché la dimensione delle particelle in forma macroscopica modifica in modo significativo la reattività superficiale e la successiva bioattività13,14. Se si osserva una bassa vitalità cellulare a concentrazioni ritenute sicure, gli sperimentatori dovrebbero verificare il protocollo di sterilizzazione UV e riesaminare le procedure di macinazione e dispersione prima di ripetere il saggio per l'EC₅₀10.
Un elemento fondamentale di questo protocollo è l'utilizzo di due marcatori complementari di immunofluorescenza che riflettono percorsi di differenziazione distinti ma sovrapposti. L'upregolazione di RANKL sulle cellule di tipo osteoblastico riflette un segnale osteogenico indotto dagli ioni calcio ed è proporzionale al numero di cellule osteogeniche8,9, mentre l'espressione di DMP-1 funge da indicatore specifico di differenziazione di tipo odontoblastico e di attività dentinogenica, risultando particolarmente rilevante quando la popolazione cellulare bersaglio è rappresentata dalle DPSCs10. Quantificando entrambi i marcatori mediante la metodologia del punteggio H, questo protocollo consente ai ricercatori di distinguere l'impegno verso la linea osteogenica da quello verso la linea odontogenica all'interno di un unico sistema sperimentale standardizzato, rappresentando un progresso rispetto agli approcci basati su un singolo marcatore, che non sono in grado di discriminare tra impegno nella formazione ossea e nella formazione della dentina. I punteggi H relativi sia a RANKL che a DMP-1 devono essere riportati in tutte le pubblicazioni che utilizzano questo protocollo, al fine di garantire la comparabilità tra studi diversi. I ricercatori devono utilizzare fluorocromi spettralmente distinti per i due anticorpi secondari per evitare sovrapposizioni tra canali e devono esaminare le immagini dei controlli con solo l'anticorpo secondario prima dell'analisi.
Potrebbero essere necessarie diverse modifiche metodologiche quando si adatta questo protocollo a biomateriali o modelli cellulari alternativi. Per scaffold altamente opachi o colorati, l'interferenza con l'assorbanza del MTT a 570 nm potrebbe richiedere un saggio di vitalità alternativo, come CellTiter-Glo (chemiluminescenza) o PrestoBlue (riduzione del resazurina), che sono meno soggetti a interferenze ottiche da parte dei materiali dello scaffold. I ricercatori che utilizzano SCAP anziché DPSC dovrebbero tenere presente che le SCAP tendono a esprimere RANKL in misura maggiore, riflettendo il loro maggiore impegno osteogenico, mentre le DPSC mostrano un'espressione più marcata di DMP-1, indicativa della loro maggiore predisposizione alla linea odontogenica/dentinogenica. Il numero di passaggi è una variabile fondamentale: si dovrebbe evitare l'uso di cellule oltre il sesto passaggio, poiché potrebbero presentare una ridotta capacità di differenziazione e un'espressione alterata dei marcatori di superficie.
I limiti di questo schema metodologico includono una finestra di valutazione a breve termine (72 h), che potrebbe non rilevare eventi di mineralizzazione della fase tardiva, i quali richiedono tipicamente 14–21 giorni. L'assenza di una validazione in vivo rappresenta un significativo divario traslazionale. L'utilizzo del punteggio H introduce una potenziale variabilità tra osservatori; la riproducibilità tra osservatori (kappa di Cohen) riportata nella Sezione 5.10 dovrebbe essere inclusa in tutti i risultati pubblicati.
Questo approccio presenta diversi vantaggi rispetto ai metodi esistenti basati su un singolo punto finale. I saggi osteogenici convenzionali spesso si basano esclusivamente sulla colorazione con rosso alizarina o sull'attività della fosfatasi alcalina (ALP) in un singolo punto temporale. L'integrazione dello screening della vitalità mediante MTT, della quantificazione dell'attività ALP e del punteggio H di immunofluorescenza doppia per RANKL e DMP-1 all'interno di un unico flusso di lavoro fornisce un'uscita multiparametrica che consente un confronto statistico diretto tra diversi tipi di scaffold in condizioni sperimentali identiche. Le strategie di normalizzazione descritte—l'attività ALP espressa per mg di proteina, i risultati del MTT come percentuale del controllo non trattato e il punteggio H normalizzato rispetto al numero totale di cellule per campo—eliminano le variabilità dovute alle differenze tra pozzetti4,8.
Studi futuri potrebbero applicare questa metodologia per valutare gli effetti dei biomateriali sui marcatori infiammatori, sulle risposte angiogeniche o su modelli alternativi di cellule staminali. La sequenza del saggio è inoltre adattabile a formati di scaffold tridimensionali. In definitiva, l'adozione di questo schema standardizzato in laboratori indipendenti faciliterà confronti meta-analitici significativi sulle prestazioni degli scaffold nella ricerca preclinica in ambito odontoiatrico rigenerativo15.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interessi.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastre per colture da 24 pozzetti | Corning | 3527 | Utilizzate per saggi di ALP |
| Piastre da 96 pozzetti | Corning | 3596 | Utilizzate per letture di assorbanza ALP e saggi MTT |
| Kit per saggio ALP | Abcam | ab83369 (o equivalente) | Utilizzato per misurare l'attività della fosfatasi alcalina |
| Tampone substrato ALP (2-amino-2-metil-1-propanolo) | Sigma-Aldrich | N/A | Utilizzato per avviare la reazione catalitica ALP |
| Idrossido di ammonio (NH4OH) | N/A | N/A | Utilizzato per l'aggiustamento del pH durante la sintesi di nanoidrossiapatite. CORROSIVO |
| Anticorpo primario anti-DMP-1 | N/A | N/A | Marcatore odontogenico; diluizione 1:200 in tampone di blocco; incubazione notturna a 4 °C |
| Anticorpo anti-CD44 umano (CD44-FITC) | Beckman Coulter | N/A | Utilizzato per la citometria a flusso; marcatore positivo per cellule staminali mesenchimali |
| Anticorpo anti-CD45 umano (CD45-PC5) | Beckman Coulter | N/A | Utilizzato per la citometria a flusso; marcatore negativo per linea ematopoietica |
| Anticorpo anti-CD73 umano (CD73-PE) | Beckman Coulter | N/A | Utilizzato per la citometria a flusso; marcatore positivo per cellule staminali mesenchimali |
| Autoclave (reattore idrotermale) | Tuttnauer | N/A | Utilizzata per il trattamento idrotermale della nanoidrossiapatite a 140 °C, 0,3 MPa |
| Kit per saggio proteico BCA | Thermo Fisher Scientific | 23225 (o equivalente) | Utilizzato per determinare la concentrazione totale di proteine per la normalizzazione dell'attività ALP |
| Incubatore a CO2 | Thermo Fisher Scientific | N/A | Impostato a 37 °C e 5% CO2 per tutti i passaggi di coltura cellulare |
| Collagenasi di tipo I | Sigma-Aldrich | C0130 | Utilizzata per la digestione enzimatica dei tessuti dentali durante l'isolamento delle cellule staminali |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 11965-092 | Mezzo basale per colture; utilizzato anche come gruppo di controllo negativo |
| Siero fetale bovino (FBS) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 10270-106 | Integratore per mezzo di coltura completo; FBS qualificato per MSC utilizzato per il mezzo di differenziazione |
| Citometro a flusso (Navios) | Beckman Coulter | Navios | Utilizzato per l'immunofenotipizzazione delle cellule staminali |
| Software di analisi per citometria a flusso (Navios) | Beckman Coulter | N/A | Utilizzato per il gating e l'analisi dei dati dei pannelli di citometria a flusso |
| Microscopio a fluorescenza | Labomed / NY Microscope Company | 9126000 | Utilizzato per l'immagine di immunofluorescenza e per il punteggio H-score |
| Liofilizzatore (freezer dryer) | Labconco | N/A | Utilizzato per asciugare i precipitati di nanomateriali a −50 °C |
| Anticorpo secondario caprino anti-coniglio IgG (Alexa Fluor 488) | Invitrogen | A-11034 | Anticorpo secondario fluorescente; diluizione 1:500; 1 h a temperatura ambiente |
| Anticorpo secondario caprino anti-coniglio IgG (Alexa Fluor 594) | Invitrogen (o equivalente) | A-11012 (o equivalente) | Anticorpo secondario spettralmente distinto utilizzato per immunofluorescenza DMP-1 in caso di colorazione multiplex |
| Software GraphPad Prism | GraphPad Software | Versione 9 | Utilizzato per il calcolo dell'EC50 e per l'analisi statistica |
| Emocitometro | Neubauer | N/A | Utilizzato per il conteggio manuale delle cellule e per il conteggio totale delle cellule per la normalizzazione dell'H-score |
| Microscopio a contrasto di fase invertito | Olympus | N/A | Utilizzato per il monitoraggio quotidiano della crescita e della morfologia cellulare |
| Mezzo di montaggio antifade (ProLong Gold) | Invitrogen | P36930 | Utilizzato per il montaggio dei vetrini dopo la colorazione di immunofluorescenza |
| Reagente MTT | Invitrogen | M6494 | Utilizzato per valutare l'attività metabolica cellulare; 0,5 mg/mL, 4 h a 37 °C |
| Nanoidrossiapatite (NHAP) | Nanogate, Cairo, Egitto | N/A | Sintetizzata per precipitazione umida o ottenuta commercialmente; utilizzata a 10 µg/mL |
| Polvere NeoMTA2 | NuSmile Ltd. / Avalon Biomed | N/A | Materiale di partenza per la preparazione di Nano-NeoMTA2 mediante macinazione planetaria |
| Serum caprino normale | N/A | N/A | Utilizzato per il blocco (5% in PBS) prima dell'applicazione dell'anticorpo primario |
| Mezzo di differenziazione osteogenico/odontogenico | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | N/A | Mezzo di controllo positivo; contiene DMEM, FBS, ascorbato, beta-glicerofosfato e desametasone |
| Paraformaldeide (4%) | Sigma-Aldrich | P6148 | Utilizzata per la fissazione cellulare prima dell'immunofluorescenza. TOSSICO — utilizzare in cappa aspirante |
| PBS (soluzione salina tamponata al fosfato, pH 7,4) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 10010-023 | Utilizzato per il lavaggio delle cellule, la diluizione degli anticorpi e la sospensione dei nanomateriali |
| Soluzione di penicillina-streptomicina | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 15140-122 | Integratore antibiotico; utilizzato al 1% nel mezzo di coltura completo |
| Macinino planetario | Retsch (o equivalente) | PM 400 | Utilizzato per la nanodimensione della polvere NeoMTA2; 350 rpm, 10 h |
| Standard di p-nitrofenolo | Sigma-Aldrich | N/A | Utilizzati per generare la curva standard di attività ALP |
| Anticorpo primario coniglio anti-RANKL | Abcam | ab9957 | Marcatore osteogenico; diluizione 1:200; incubazione notturna a 4 °C |
| Anticorpo di controllo isotipico coniglio IgG | N/A | Controllo negativo per immunofluorescenza; concentrazione corrispondente all'anticorpo primario | |
| Soluzione solubilizzante SDS-HCl | Sigma-Aldrich | N/A | Utilizzata per sciogliere i cristalli di formazano MTT. CORROSIVO |
| Piastre per colture tessutali da sei pozzetti | Corning | 3516 | Utilizzate per saggi di differenziazione |
| Idrossido di sodio (NaOH), 0,5 M | Sigma-Aldrich (o equivalente) | N/A | Utilizzato per interrompere la reazione ALP prima della misurazione dell'assorbanza; CORROSIVO |
| Sonificatore (sonda / bagno ultrasonico) | Branson Ultrasonics | N/A | Utilizzato per la dispersione delle nanoparticelle prima dei saggi biologici |
| Flaconi per colture T-75 | Corning | 430641 | Utilizzati per l'espansione delle cellule staminali |
| TEOS (ortosilicato di tetraetile) | N/A | N/A | Precurse di silice per la sintesi sol-gel del vetro bioattivo 45S5. INFIAMMABILE |
| Microscopio elettronico a trasmissione | JEOL Ltd. | JEM-2100 | Utilizzato per la caratterizzazione dimensionale e morfologica dei nanomateriali |
| Triton X-100 (0,1% in PBS) | N/A | N/A | Utilizzato per la permeabilizzazione cellulare prima dell'immunofluorescenza |
| Soluzione di blu di tripano (0,4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | Utilizzata per la valutazione della vitalità cellulare |
| Diffrattometro a raggi X (X'PERT-PRO) | PANalytical | X'PERT-PRO | Utilizzato per l'analisi cristallografica delle nanoparticelle |
Riferimenti
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