Questo studio valuta l'espressione di miR-21-5p, la sua associazione con la molecola di adesione cellulare 1 e le sue relazioni con migrazione, proliferazione, espressione di marcatori infiammatori e sopravvivenza nei tessuti e nelle linee cellulari del carcinoma polmonare non a piccole cellule.
Articolo di ricerca
L'asse miR-21-5p-Molecola di Adesione Cellulare 1 nella progressione e nella prognosi del carcinoma polmonare non a piccole cellule
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11 settembre 2026
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In questo articolo
Sommario
Abstract
Evidenze indicano che miR-21-5p è un importante regolatore molecolare nel carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC). La molecola di adesione cellulare 1 (CADM1) è un potenziale soppressore tumorale, ma la relazione regolatoria tra miR-21-5p e CADM1 nel decorso dell'NSCLC rimane poco chiara. La PCR quantitativa con trascrizione inversa (qRT-PCR) è stata utilizzata per rilevare l'espressione di miR-21-5p e CADM1 nei tessuti e nelle cellule NSCLC; il legame specifico tra miR-21-5p e CADM1 è stato verificato mediante saggio del gene reporter a doppia luciferasi; l'abilità di migrazione cellulare è stata valutata con il saggio Transwell; i dati clinicopatologici e l'analisi della sopravvivenza sono stati combinati per esplorare il significato clinico di miR-21-5p; l'arricchimento funzionale dei geni bersaglio di miR-21-5p è stato analizzato mediante bioinformatica. L'espressione di miR-21-5p nei tessuti NSCLC era significativamente più elevata rispetto ai tessuti normali adiacenti, e i pazienti con alta espressione di miR-21-5p presentavano una sopravvivenza complessiva più breve. Un'elevata espressione di miR-21-5p costituisce un fattore di rischio indipendente per la sopravvivenza dei pazienti con NSCLC; l'overespressione di miR-21-5p ha promosso la migrazione cellulare nelle cellule NSCLC e ha aumentato l'espressione dei fattori infiammatori; il saggio del gene reporter a doppia luciferasi ha confermato che miR-21-5p si lega direttamente a CADM1; l'overespressione di CADM1 ha inibito la migrazione cellulare nelle cellule NSCLC e ridotto l'espressione dei fattori infiammatori; l'analisi bioinformatica ha mostrato che i geni bersaglio di miR-21-5p sono arricchiti in diversi percorsi di segnalazione coinvolti nell'insorgenza e nello sviluppo tumorale. miR-21-5p promuove la progressione dell'NSCLC legandosi e inibendo CADM1 e potrebbe fungere da biomarcatore prognostico e bersaglio terapeutico.
Introduzione
In tutto il mondo, il cancro del polmone è tra le principali cause di mortalità correlata al cancro, con un'incidenza in costante aumento1,2. Nelle popolazioni dell'Asia orientale, l'incidenza e la mortalità per cancro del polmone raggiungono rispettivamente 222,1 e 155,5 ogni 100.000 uomini, contro 158,1 e 87,3 ogni 100.000 donne. Il carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) rappresenta circa l'80% di tutti i tumori polmonari e comprende tre principali sottotipi istologici3. Rispetto al carcinoma polmonare a piccole cellule (SCLC), altamente aggressivo, l'NSCLC progredisce e metastatizza più lentamente; tuttavia, sintomi clinici iniziali generici portano a una diagnosi in stadio intermedio o avanzato in oltre il 75% dei pazienti, contribuendo a una scarsa sopravvivenza complessiva a 5 anni4. La tumorigenesi polmonare è guidata dall'attivazione di oncogeni e dall'inasprimento di geni soppressori tumorali5, evidenziando la necessità urgente di analizzare i meccanismi molecolari sottostanti l'NSCLC per sviluppare nuove terapie6.
I microRNA (miRNA, lunghi 18–25 nucleotidi) mediano la repressione genica post-trascrizionale legandosi alla regione non tradotta 3′ (3′-UTR) degli mRNA bersaglio, innescando la soppressione traduzionale o la degradazione dell'mRNA7. La biogenesi dei miRNA inizia con la trascrizione da parte dell'RNA polimerasi II, che genera trascritti primari di miRNA, successivamente scissi da enzimi RNasi III per formare pre-miRNA a struttura stem-loop (precursori di miRNA)8. Mentre la maggior parte dei miRNA reprimono l'espressione genica attraverso complementarità parziale o completa con le 3′-UTR degli mRNA, alcuni miRNA possono potenziare la traduzione dell'mRNA in specifici contesti del ciclo cellulare9. Ad oggi, sono stati identificati centinaia di miRNA umani, che regolano processi biologici fondamentali come la proliferazione cellulare, la differenziazione e l'apoptosi10. In precedenza, il rilevamento di miRNA espressi in modo anomalo risultava tecnicamente difficoltoso; l'avvento del sequenziamento ad alto rendimento ha permesso un profilo rapido e privo di bias dei miRNA disregolati nei tessuti malati11. In questo studio, ci concentriamo su miR-21-5p, uno dei primi miRNA trascritti dall'RNA polimerasi II ad essere caratterizzati, le cui funzioni regolatorie oncogeniche sono oggetto di intense indagini12.
miR-21-5p è codificato all'interno di un introne del gene TMEM49 ed è costantemente sovraespresso in molteplici neoplasie umane, tra cui i tumori dell'esofago, del colon-retto e del polmone13. I dati preclinici esistenti confermano la sua attività oncogenica: l'aumento di miR-21-5p accelera la proliferazione tumorale, la transizione epitelio-mesenchimale (EMT) e le metastasi a distanza silenziando bersagli antioncogenici come PTEN e PDCD414. Tuttavia, gli studi precedenti si sono concentrati principalmente sui segnali apoptotici e proliferativi indotti da miR-21, e pochi rapporti analizzano sistematicamente l'asse regolatorio miR-21-5p/CADM1 nel NSCLC15. La molecola di adesione cellulare 1 (CADM1) è un noto soppressore tumorale in diversi tumori epiteliali16; essa mantiene l'adesione intercellulare, impedendo il distacco delle cellule tumorali e la disseminazione metastatica, e la sua ridotta espressione è correlata a uno stadio tumorale avanzato e a una minore sopravvivenza nei pazienti con NSCLC. Dal punto di vista meccanicistico, CADM1 inibisce anche il segnale infiammatorio pro-tumorale del fattore nucleare kappa B (NF-κB), che favorisce la metastatizzazione inducendo la secrezione di citochine pro-infiammatorie e rimodellando il microambiente tumorale17. Nonostante la documentazione separata dell'oncogenicità di miR-21-5p e degli effetti soppressori tumorali di CADM1, permangono tre lacune fondamentali nella conoscenza dell'asse miR-21-5p/CADM1 nel NSCLC: in primo luogo, l'associazione diretta e la repressione di CADM1 da parte di miR-21-5p non sono state validate sperimentalmente nelle cellule del cancro del polmone; in secondo luogo, non è ancora chiaro se questo asse determini fenotipi maligni attraverso vie infiammatorie downstream; in terzo luogo, la capacità prognostica predittiva dei profili di espressione combinata di miR-21-5p/CADM1 non è stata valutata in campioni clinici di NSCLC.
Sulla base di questi interrogativi irrisolti, proponiamo un'ipotesi meccanicistica centrale: l'aumento di espressione di miR-21-5p nel NSCLC lega direttamente la regione 3′-UTR di CADM1 per sopprimere l'espressione di CADM1, determinando così la derepressione della segnalazione infiammatoria metastatica inibita da CADM1, accelerando in tal modo la migrazione del NSCLC e determinando una prognosi clinica peggiore. Questo studio persegue tre obiettivi di ricerca prefissati: (1) Verificare il targeting molecolare diretto di CADM1 da parte di miR-21-5p e valutare la migrazione nelle linee cellulari di NSCLC A549 e H1299; (2) Chiarire se la cascata miR-21-5p/CADM1 moduli il potenziale metastatico attraverso la trasduzione del segnale infiammatorio; (3) Valutare il valore prognostico clinico del profilo di espressione miR-21-5p/CADM1 al fine di identificare nuovi biomarcatori diagnostici e candidati terapeutici per il NSCLC metastatico.
Protocollo
Lo studio retrospettivo è stato esaminato e approvato dal Comitato Etico dell'Ospedale di Medicina Tradizionale Cinese di Quzhou (numero di approvazione 202402208). Il consenso informato scritto è stato ottenuto da ogni paziente arruolato o da un tutore legale prima della raccolta dei campioni.
Collezione dei campioni
I tessuti tumorali primari di carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) sono stati ottenuti chirurgicamente dai pazienti arruolati, mentre i corrispondenti tessuti polmonari normali adiacenti sono stati raccolti retrospettivamente presso il National Engineering Research Center for Clinical Biopsy (Quzhou City, Zhejiang Province, China). In questo studio di coorte sono stati inclusi un totale di 157 campioni di pazienti con NSCLC arruolati consecutivamente tra gennaio 2019 e dicembre 2024. L'ampiezza campionaria di 157 campioni appaiati è stata giustificata statisticamente sulla base di precedenti ricerche pubblicate riguardanti il prognostico degli miRNA nell'NSCLC: assumendo una dimensione dell'effetto moderata pari a 0,5, α = 0,05 e una potenza statistica dell'80%, il numero minimo di casi necessari è stato calcolato in 122. Considerando possibili perdite di campioni, necrosi tissutale grave e pazienti persi al follow-up, sono stati arruolati consecutivamente 157 pazienti idonei tra gennaio 2019 e dicembre 2024, al fine di garantire una potenza statistica sufficiente. Tutti i tessuti tumorali e i corrispondenti tessuti polmonari normali adiacenti sono stati prelevati dallo stesso paziente durante la resezione chirurgica, formando così coppie di campioni destinate ad analisi comparative successive.
I criteri di inclusione erano: (1) pazienti confermati istopatologicamente come NSCLC primario mediante biopsia postoperatoria; (2) dati completi relativi al basale clinico, allo stadio istopatologico e alla sopravvivenza a lungo termine durante il follow-up; (3) assenza di radioterapia, chemioterapia o terapia mirata precedente al prelievo del tessuto; (4) disponibilità di campioni abbinati completi di tessuto tumorale e tessuto para-canceroso.
I criteri di esclusione erano: (1) Tumori maligni secondari combinati di altri organi; (2) Pazienti persi al follow-up entro 3 mesi dall'intervento chirurgico; (3) Campioni con necrosi grave o volume tissutale insufficiente per l'analisi molecolare successiva.
Tutti i campioni di tessuto fresco sono stati posti in azoto liquido entro 15 minuti dal reperimento chirurgico, trasferiti in un congelatore ad ultra bassa temperatura e conservati a −80 °C per l'estrazione di RNA e proteine. È stato effettuato un follow-up clinico regolare e la sopravvivenza complessiva è stata misurata in mesi a partire dalla diagnosi istopatologica fino al decesso o all'ultima data di follow-up disponibile.
Stratificazione del livello di espressione di miR-21-5p
I valori relativi di espressione di miR-21-5p di tutti i 157 pazienti sono stati ordinati in ordine crescente e la coorte è stata stratificata in base alla soglia mediana di espressione. A causa della presenza di numerosi valori identici intorno alla mediana, i pazienti con espressione inferiore alla mediana sono stati assegnati al gruppo a bassa espressione (n = 61); i pazienti con espressione uguale o superiore alla mediana, inclusi tutti i valori identici corrispondenti alla mediana, sono stati classificati nel gruppo ad alta espressione (n = 96). Questa regola di assegnazione per i valori identici è stata definita a priori rispetto alla suddivisione in gruppi, al fine di risolvere le letture duplicate della mediana, e il risultato della suddivisione è stato verificato incrociando i dati grezzi della quantificazione qRT-PCR.
Coltura cellulare
Le linee cellulari umane di NSCLC A549 e H1299 sono state ottenute da un fornitore commerciale (vedere Tabella dei materiali). Le cellule A549 sono state mantenute in mezzo RPMI-1640, mentre le cellule H1299 sono state coltivate in DMEM. Entrambi i mezzi di coltura cellulare sono stati arricchiti con siero fetale bovino (FBS) inattivato termicamente al 10%, penicillina (100 U/mL) e streptomicina (100 µg/mL). Le cellule sono state coltivate in condizioni standard a 37 °C in un incubatore umidificato con 5% di CO₂.
È stato eseguito un profilo tramite ripetizioni in tandem corte (STR) per autenticare l'identità delle linee cellulari A549 e H1299 prima di tutti gli esperimenti funzionali. Il test per la contaminazione da micoplasma è stato effettuato mensilmente utilizzando un kit commerciale di rilevamento del micoplasma basato sulla PCR, e sono state utilizzate solo cellule negative al micoplasma per i saggi successivi.
Le cellule in fase di crescita logaritmica con morfologia intatta sono state raccolte per la trasfezione transitoria. È stato utilizzato un reagente di trasfezione a base lipidica (vedere Tabella dei Materiali) seguendo le istruzioni del produttore. I saggi cellulari successivi sono stati eseguiti 50 h dopo la trasfezione.
Trasfezione cellulare
Per la trasfezione, le cellule in fase di crescita logaritmica e con morfologia integra sono state seminate nelle piastre di coltura 24 h in anticipo per raggiungere una confluenza del 60%–70%. La trasfezione è stata eseguita utilizzando un reagente di trasfezione a base lipidica (vedere la Tabella dei materiali) seguendo le istruzioni del produttore. Sono stati utilizzati quattro gruppi sperimentali: controllo negativo del mimico (mimic-NC), mimico di miR-21-5p, controllo negativo dell'inibitore (inhibitor-NC) e inibitore di miR-21-5p. Le sequenze nucleotidiche sono riportate nel File supplementare 1.
L'RNA totale è stato estratto 50 h dopo la trasfezione e la PCR quantitativa di retrotrascrizione (qRT-PCR) è stata eseguita per misurare l'espressione relativa di miR-21-5p e verificare l'efficienza di trasfezione. I saggi di migrazione cellulare sono stati eseguiti 50 h dopo la trasfezione. Per la trasfezione transitoria, le cellule sono state trattate con il mimico di miR-21-5p o con un controllo negativo del mimico (mimic-NC) a una concentrazione finale di 50 nM, mentre l'inibitore di miR-21-5p e il controllo negativo dell'inibitore (inhibitor-NC) sono stati introdotti a 100 nM. Per evitare effetti confondenti attribuibili a differenze nell'apporto di acidi nucleici, la quantità totale di acido nucleico trasfettato è stata mantenuta identica in tutti e quattro i gruppi di trattamento.
La proliferazione cellulare è stata valutata mediante il saggio con il Cell Counting Kit-8 (CCK-8). Le cellule transfettate in modo stabile sono state seminate in piastre a 96 pozzetti a una densità di 3 × 103 cellule/pozzetto, con sei replicati tecnici per ogni gruppo. A 24, 48 e 72 h dal seeding, sono stati aggiunti 10 µL di reagente CCK-8 in ogni pozzetto, seguiti da un'incubazione a 37 °C per 2 h. La proliferazione cellulare è stata quantificata misurando l'assorbanza a 450 nm mediante un lettore di microplacche.
Tutti i transfezioni transitorie, i test CCK-8 e gli esperimenti di migrazione sono stati eseguiti con non meno di tre replicati biologici indipendenti, e ciascun replicato biologico comprendeva da 3 a 6 replicati tecnici come descritto in precedenza.
PCR quantitativa di retrotrascrizione
L'RNA totale da cellule NSCLC e da tessuti tumorali clinici accoppiati e tessuti normali adiacenti è stato isolato utilizzando un reagente di estrazione dell'RNA a base di fenolo/guanidina (vedere Tabella dei Materiali). La purezza e la concentrazione dell'RNA sono state determinate mediante spettrofotometria ultravioletta; solo i campioni con rapporti tra la densità ottica (OD) 260/280 e OD 260/230 compresi tra 1,8 e 2,1 sono stati sottoposti a retrotrascrizione. Le sequenze dei primer sono riportate nel File Supplementare 1. Il sistema di retrotrascrizione conteneva 500 ng di RNA totale, 2 µL di tampone per retrotrascrizione, 1 µL di miscela di dNTP, 0,5 µL di retrotrascrittasi, 1 µL di primer specifico a stem-loop per miRNA o primer oligo(dT) per mRNA e acqua libera da RNasi fino a un volume totale di 20 µL. Il sistema di amplificazione qRT-PCR (volume totale 20 µL) era costituito da 10 µL di master mix per qPCR con SYBR Green, 0,4 µL di primer forward (10 µM), 0,4 µL di primer reverse (10 µM), 2 µL di template di cDNA diluito e 7,2 µL di acqua libera da RNasi.
L'mRNA per CADM1 e GAPDH è stato retrotrascritto utilizzando un kit di retrotrascrizione, mentre miR-21-5p è stato retrotrascritto con primer a stem-loop e cel-miR-39 esogeno come controllo di spike-in. Lo spike-in di cel-miR-39 esogeno è stato aggiunto a ciascun campione di RNA immediatamente dopo l'isolamento dell'RNA totale e prima della retrotrascrizione. Essendo un microRNA sintetico di C. elegans privo di sequenze omologhe nei trascritti umani, cel-miR-39 può correggere le deviazioni causate da differenze nell'efficienza di estrazione dell'RNA, dalla perdita dovuta alla degradazione dell'RNA e dalle variazioni nell'efficienza della retrotrascrizione tra diversi campioni tissutali clinici, fungendo da controllo esogeno universale per la normalizzazione della quantificazione dei miRNA. La qRT-PCR è stata eseguita utilizzando una master mix a base di colorante fluorescente legante il DNA su un sistema di PCR in tempo reale (vedere la Tabella dei Materiali): 95 °C per 3 min, seguiti da 40 cicli a 95 °C per 10 s, 60 °C per 30 s e 72 °C per 20 s, con analisi della curva di denaturazione per confermare l'amplificazione specifica. Ogni campione presentava tre repliche biologiche, ciascuna con tre repliche tecniche, e l'espressione relativa è stata calcolata utilizzando il metodo 2⁻ΔΔCt. Le sequenze complete dei primer per l'amplificazione dell'mRNA di CRP, TNF-α e IL-6 sono fornite nel File Supplementare 1, insieme alle sequenze dei primer per CADM1, GAPDH e miR-21-5p.
Stabilizzazione dell'espressione di miR-21-5p mediata da lentivirus
Vettori lentivirali commerciali LV-miR-21-5p e controllo vuoto LV-NC sono stati assemblati in cellule 293T. La sequenza precursora di miR-21-5p è stata inserita in un vettore lentivirale contenente i geni di resistenza alla puromicina e di un reporter GFP. I supernatanti lentivirali sono stati raccolti a 48 h e 72 h dal transfezionamento, concentrati e purificati per l'infezione cellulare.
Le cellule A549 e H1299 sono state seminate 24 h prima dell'infezione per raggiungere una confluenza del 50–60%. Le cellule sono state infettate a un MOI = 10 (A549) e MOI = 15 (H1299) con 5 µg/mL di polibrenina per migliorare l'efficienza di trasfezione. Il mezzo è stato sostituito 24 h dopo l'infezione, e le cellule sono state coltivate per ulteriori 48 h prima della selezione con puromicina.
La selezione delle cellule stabili è stata effettuata con 5 µg/mL di puromicina per 10 giorni consecutivi; cellule vuote non infette sono state utilizzate per verificare l'eliminazione completa delle cellule non trasdotte entro 7 giorni. Singole colonie positive per GFP sono state isolate ed espanse per generare linee cellulari monoclonali stabili LV-21 e LV-NC.
Per i saggi di recupero di CADM1, sono stati preparati lentivirus commerciali per l'overespressione di LV-CADM1 e per il silenziamento di sh-CADM1. Sono stati stabiliti quattro gruppi sperimentali: LV-NC, LV-miR-21-5p, LV-CADM1 e il gruppo di recupero LV-miR-21-5p + LV-CADM1. I lentivirus di CADM1 sono stati utilizzati con lo stesso MOI e nelle stesse condizioni di selezione con puromicina dei vettori miR-21-5p. Tutti i saggi di recupero per la proliferazione e la migrazione sono stati ripetuti con tre replicati biologici indipendenti.
Convalida dell'overespressione stabile di miR-21-5p
L'RNA totale è stato estratto da cloni cellulari stabili LV-21 e LV-NC raccolti. È stata eseguita una qRT-PCR per rilevare il livello di espressione relativo di hsa-miR-21-5p utilizzando cel-miR-39 come riferimento esogeno. Sono stati selezionati per tutti i successivi saggi funzionali i cloni cellulari che mostravano un'upregolazione superiore a 8 volte rispetto al gruppo LV-NC, confermando così la corretta costruzione di linee cellulari stabili overesprimenti miR-21-5p.
Saggio del reporter dual-luciferasi
Sono stati costruiti un plasmide reporter della regione 3'-UTR wild-type di CADM1 (WT-CADM1) contenente la sequenza di legame prevista per miR-21-5p e un plasmide reporter della regione 3'-UTR mutante di CADM1 (MUT-CADM1) con una regione seed di legame mutata. Le cellule A549 sono state seminate in piastre a 24 pozzetti 24 ore prima della trasfezione, in modo da raggiungere una confluenza del 60%–70%. Ogni pozzetto è stato co-trasfettato con 500 ng di plasmide reporter WT/MUT, 50 nM di miR-21-5p mimic o mimic-NC e un plasmide di riferimento interno Renilla luciferasi in un rapporto di massa fisso. Dopo 48 ore di incubazione post-trasfezione, le cellule sono state lisate completamente e i segnali luminosi della luciferasi firefly e Renilla sono stati rilevati in sequenza mediante un kit di rilevamento dual-luciferasi. L'attività luciferasica relativa è stata calcolata come rapporto tra il valore di luminescenza di firefly e quello di Renilla. Ogni gruppo sperimentale comprendeva tre replicati biologici indipendenti, ciascuno con tre replicati tecnici, ed è stato utilizzato un test t per campioni indipendenti a due gruppi per il confronto statistico dell'attività luciferasica relativa tra i gruppi mimic-NC e miR-21-5p mimic.
Saggio di migrazione Transwell
Per il saggio di migrazione Transwell, le cellule transfettate in modo stabile sono state sospese in mezzo privo di siero e seminate negli inserti superiori a una densità di 4 × 104 cellule per pozzetto. Le camere inferiori sono state riempite con mezzo di coltura completo integrato con il 10% di FBS per stabilire un gradiente chemotattico. Dopo un'incubazione di 48 h a 37 °C in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO₂, le cellule rimaste sulla superficie superiore della membrana sono state accuratamente rimosse. Le cellule migrate sul lato inferiore della membrana sono state fissate in metanolo e colorate con violetto cristallo. La migrazione è stata quantificata contando le cellule in cinque campi microscopici scelti casualmente per ogni inserto. Ogni esperimento è stato eseguito utilizzando tre replicati biologici indipendenti, con tre replicati tecnici inclusi per ciascun replicato biologico.
Analisi statistiche
Tutti gli esperimenti in vitro sono stati eseguiti con un minimo di tre replicati biologici indipendenti, ciascuno accompagnato da replicati tecnici corrispondenti. La distribuzione dei dati è stata inizialmente valutata mediante il test di normalità di Shapiro-Wilk per guidare l'analisi statistica. Per confronti accoppiati tra tessuti tumorali e tessuti normali adiacenti, è stato applicato il test t accoppiato o il test di Wilcoxon per ranghi con segno, a seconda della distribuzione dei dati. I confronti tra due gruppi indipendenti sono stati analizzati utilizzando il test t indipendente o il test U di Mann-Whitney. Le differenze tra più gruppi, inclusi gli esperimenti di recupero, sono state valutate mediante analisi della varianza unidirezionale (ANOVA) seguita dalla correzione post hoc di Bonferroni, mentre l'ANOVA a misure ripetute è stata utilizzata per analizzare dataset longitudinali come i saggi di proliferazione CCK-8 e di guarigione della ferita. Le associazioni tra variabili cliniche categoriali sono state esaminate mediante il test χ2, e la relazione tra l'espressione di miR-21-5p e CADM1 è stata valutata mediante analisi di correlazione di Pearson. La sopravvivenza dei pazienti è stata analizzata mediante curve di Kaplan-Meier, con i confronti effettuati tramite il test del log-rank. I fattori prognostici indipendenti sono stati identificati attraverso analisi di regressione univariata e multivariata di Cox per i rischi proporzionali. La significatività statistica è stata definita come P < 0,05. La regressione multivariata di Cox è stata aggiustata per età, sesso, tipo istologico, livello di miR-21-5p e stato dei linfonodi (riferimento: età ≤ 60 anni, sesso femminile, carcinoma squamocellulare, miR-21-5p basso, linfonodi negativi); i residui di Schoenfeld hanno verificato l'assunzione di rischi proporzionali, e le variabili con P univariata < 0,10 sono state incluse mediante selezione enter.
Risultati
Correlazione tra l'espressione di miR-21-5p e le caratteristiche clinicopatologiche dei pazienti con NSCLC
Un totale di 157 campioni tumorali di NSCLC è stato suddiviso in gruppi con bassa espressione di miR-21-5p (n = 61) e alta espressione (n = 96) in base ai livelli mediani di miR-21-5p; analisi chi-quadrato non hanno rivelato correlazioni significative tra l'espressione di miR-21-5p e l'età del paziente (χ2 = 1,36, P = 0,2435), il sesso (χ2 = 1,06, P = 0,3032), il tipo istologico (χ2 = 1,09, P = 0,2965) o la dimensione del tumore (χ2 = 5,623, P = 0,0601). Al contrario, un'elevata espressione di miR-21-5p è risultata significativamente associata a un grado tumorale avanzato (χ2 = 16,25, P = 0,00006), metastasi linfonodale positiva (χ2 = 12,17, P = 0,00049) e uno stadio T più elevato (χ2 = 4,30, P = 0,117), suggerendo che miR-21-5p esercita effetti oncogeni che favoriscono la progressione del NSCLC (Tabella 1).
Analisi multivariata di regressione Cox a rischi proporzionali per i fattori prognostici indipendenti del NSCLC
L’analisi multivariata di regressione Cox, che include età, sesso, tipo istologico, espressione di miR-21-5p e metastasi linfonodale, ha rivelato che un’elevata espressione di miR-21-5p (rapporto di rischio [HR] = 3,066; intervallo di confidenza al 95% [CI]: 1,412–6,659; P = 0,005) e la presenza di metastasi linfonodale (HR = 22,295; 95% CI: 3,039–163,588; P = 0,002) costituiscono fattori di rischio prognostici sfavorevoli e indipendenti per una scarsa sopravvivenza globale nei pazienti con NSCLC, mentre l’età del paziente, il sesso e il sottotipo istologico non hanno mostrato impatti prognostici indipendenti significativi (tutti P > 0,05) (Tabella 2).
Caratteristiche di espressione clinica di miR-21-5p e sua correlazione con CADM1 e fattori infiammatori
Il rilevamento mediante qRT-PCR su tessuti tumorali di NSCLC e tessuti normali adiacenti ha mostrato livelli relativi di miR-21-5p significativamente più elevati nei tessuti tumorali rispetto ai controlli normali (Figura 1A, P < 0,001). Le curve di sopravvivenza di Kaplan-Meier hanno mostrato che i pazienti con alta espressione di miR-21-5p presentavano una sopravvivenza complessiva significativamente peggiore rispetto a quelli con bassa espressione di miR-21-5p (Figura 1B, P = 0,0027). Le abbondanze di mRNA dei mediatori infiammatori proteina C-reattiva (CRP), fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α) e interleuchina-6 (IL-6) erano tutte marcatamente aumentate nei campioni di NSCLC (Figura 1C, P < 0,01, P < 0,001). L’analisi di correlazione di Pearson ha rivelato una correlazione negativa fortemente significativa tra l’espressione di miR-21-5p e quella di mRNA di CADM1 nei campioni clinici (r = -0,7773, IC 95%: -0,8325 a -0,7076, P < 0,0001, Figura 1D).
Convalida funzionale cellulare di miR-21-5p in cellule NSCLC
La qRT-PCR ha confermato l'efficienza di trasfezione riuscita del mimico di miR-21-5p in cellule A549 e H1299 (Figura 2A). I saggi Transwell hanno mostrato che l'overespressione di miR-21-5p aumentava significativamente la capacità di migrazione relativa e il numero di cellule migrate in entrambe le linee cellulari (Figura 2B,C). Il rilevamento mediante qRT-PCR di citochine infiammatorie ha rivelato un aumento marcato dei livelli di mRNA di CRP, TNF-α e IL-6 dopo la trasfezione con il mimico di miR-21-5p, mentre il trattamento con l'inibitore di miR-21-5p ha invertito questo aumento (Figura 2D). Gli esperimenti di recupero hanno confermato che il mimico di miR-21-5p sopprimeva drasticamente la trascrizione di CADM1 e che la co-trasfezione con LV-CADM1 ripristinava completamente l'espressione di mRNA di CADM1 in cellule A549 e H1299 (Figura 2E,F). Nel complesso, questi dati cellulari hanno dimostrato che miR-21-5p promuove la migrazione delle cellule NSCLC e la risposta infiammatoria mediante la repressione di CADM1.
Effetti di miR-21-5p sulla proliferazione delle cellule di NSCLC
Le curve di proliferazione ottenute con il saggio CCK-8 a 24 h, 48 h e 72 h hanno mostrato che la trasfezione con il mimico di miR-21-5p ha notevolmente aumentato i valori di densità ottica a 450 nm sia nelle cellule A549 che nelle H1299, mentre l'inibitore di miR-21-5p ha significativamente ridotto la vitalità cellulare, con differenze statisticamente significative osservate a 72 h (Figura 3A,B; P < 0,001). Questi dati dimostrano che miR-21-5p esercita un effetto pro-proliferativo sulle cellule di NSCLC.
Convalida di CADM1 come bersaglio diretto di miR-21-5p mediante previsione bioinformatica e saggio del reporter a doppia luciferasi
Tre database online di previsione dei bersagli di miRNA (miRWalk, StarBase, TargetScan) sono stati incrociati per selezionare i geni downstream candidati di miR-21-5p, ottenendo 95 geni bersaglio sovrapposti (Figura 4A). L'analisi di arricchimento Gene Ontology (GO) ha indicato che questi geni candidati erano principalmente arricchiti in processi biologici, componenti cellulari e funzioni molecolari legati al metabolismo cellulare, alla risposta allo stress e alla regolazione della trascrizione (Figura 4B). L'arricchimento del percorso Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) ha ulteriormente rivelato un marcato arricchimento in cascate di segnalazione associate ai tumori, inclusi i percorsi della mitogen-activated protein kinase (MAPK) e della Ras (Figura 4C). Il saggio del reporter a doppia luciferasi ha dimostrato che il mimico di miR-21-5p sopprimeva significativamente l'attività luciferasica relativa del reporter del 3'-UTR di tipo selvaggio di CADM1, mentre nessun effetto inibitorio è stato osservato nel gruppo con 3'-UTR mutato di CADM1 (Figura 4D, P < 0,01, ns: non significativo), confermando il legame diretto tra miR-21-5p e CADM1.
Promozione di fenotipi maligni del NSCLC mediante soppressione di CADM1 in esperimenti di recupero
La qRT-PCR ha verificato l'efficienza di trasfezione del mimico e dell'inibitore di miR-21-5p nelle cellule A549 e H1299 (Figura 5A). L'overespressione di CADM1 (LV-CADM1) ha ridotto i livelli di mRNA dei fattori pro-infiammatori CRP, TNF-α e IL-6, mentre la riduzione di CADM1 ottenuta con RNA interferente specifico (si-CADM1) ha notevolmente aumentato la loro espressione (Figura 5B). Saggi di migrazione in Transwell hanno mostrato che la trasfezione con LV-CADM1 ha significativamente inibito la capacità migratoria di entrambe le linee cellulari di NSCLC (Figura 5C,D). Il rilevamento della proliferazione mediante CCK-8 ha ulteriormente dimostrato che l'effetto pro-proliferativo mediato da LV-21 veniva completamente annullato dalla co-trasfezione con LV-CADM1, mentre l'accelerazione della crescita cellulare indotta da si-CADM1 poteva essere recuperata mediante l'inibitore di miR-21-5p (Figura 5E,F). Nel complesso, questi dati di recupero hanno confermato che CADM1 agisce come mediatore funzionale a valle responsabile della proliferazione, migrazione e attivazione infiammatoria indotte da miR-21-5p nel NSCLC.
DISPONIBILITÀ DEI DATI:
I dati originali che supportano i risultati di questo studio sono forniti nel File Supplementare 2 e sono disponibili insieme all'articolo pubblicato.
Figura 1: Profili di espressione di miR-21-5p, fattori infiammatori e loro correlazione con CADM1 in campioni clinici di NSCLC. (A) Espressione relativa di miR-21-5p in tessuti polmonari normali e tessuti tumorali di NSCLC. (BCurve di sopravvivenza globale di Kaplan-Meier nei pazienti con NSCLC stratificati per livello di espressione di miR-21-5p. (CEspressione relativa dell'mRNA dei fattori infiammatori PCR, TNF-α, e IL-6 in tessuti normali e di NSCLC. (DGrafico a dispersione della correlazione di Pearson che mostra la correlazione lineare negativa tra miR-21-5p e CADM1 Espressione dell'mRNA. **P < 0,01, ***P < 0.001. Per il Pannello C: sono stati effettuati confronti statistici tra tessuti tumorali appaiati e tessuti normali adiacenti per CRP, TNF-α e IL-6, rispettivamente; **P < 0,01, ***P < 0,001 indicano differenze significative rispetto ai tessuti polmonari normali abbinati. Tutti i pannelli includono ≥3 replicati biologici indipendenti; i dati di qRT-PCR rappresentano la media ± deviazione standard; accoppiati tÈ stato adottato il test - per il confronto tra i gruppi; l'analisi di correlazione del grafico a dispersione ha utilizzato il test di Pearson. Abbreviazioni: CADM1 = molecola di adesione cellulare 1; CI = intervallo di confidenza; PCR = proteina C reattiva; IL-6 = interleuchina-6; NSCLC = carcinoma polmonare non a piccole cellule; TNF-α = fattore di necrosi tumorale alfa. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Fenotipi cellulari ed espressione di CADM1 regolati da miR-21-5p in cellule NSCLC A549 e H1299. (A) Rilevamento mediante qRT-PCR dell'espressione di miR-21-5p dopo la trasfezione con il mimico. (B) Quantificazione statistica della migrazione cellulare relativa ottenuta da saggi Transwell. (C) Quantificazione del numero di cellule migrate per campo microscopico. (D) Espressione relativa di mRNA di CRP, TNF-α e IL-6 in condizioni di sovraespressione o inibizione di miR-21-5p. (E) Espressione relativa di mRNA di CADM1 nei gruppi di recupero A549 (NC, mimico miR-21-5p, LV-CADM1, mimico+LV-CADM1). (F) Espressione relativa di mRNA di CADM1 nei gruppi di recupero H1299. **P < 0,01, ***P < 0,001. Tutti i saggi cellulari sono stati ripetuti per tre replicati biologici indipendenti con tre replicati tecnici ciascuno; le barre di errore rappresentano la media ± DS; i confronti tra gruppi hanno utilizzato l'ANOVA a un fattore con correzione di Bonferroni; le etichette dei gruppi corrispondono esattamente ai gruppi di trasfezione descritti nei Metodi. Abbreviazioni: CADM1 = molecola di adesione cellulare 1; CRP = proteina C reattiva; IL-6 = interleuchina-6; LV = vettore lentivirale; NC = controllo negativo; NSCLC = carcinoma polmonare non a piccole cellule; qRT-PCR = PCR quantitativa con trascrizione inversa; TNF-α = fattore di necrosi tumorale alfa. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Curve di proliferazione CCK-8 che riflettono la vitalità cellulare dopo sovraespressione o silenziamento di miR-21-5p. (A) Curve di assorbanza OD₄₅₀ dipendenti dal tempo di cellule A549 trasfettate con mimic-NC, miR-21-5p mimic, inhibitor-NC o miR-21-5p inhibitor. (B) Curve di assorbanza OD₄₅₀ dipendenti dal tempo di cellule H1299 nei quattro gruppi di trasfezione. ***P < 0,001. I saggi CCK-8 includevano sei repliche tecniche per gruppo su 3 ripetizioni biologiche; i dati sono espressi come media ± DS; l'ANOVA a misure ripetute è stata utilizzata per i confronti tra i diversi tempi. Abbreviazioni: CCK-8 = Cell Counting Kit-8; NC = controllo negativo; OD = densità ottica. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Analisi bioinformatica e saggio dual-luciferasi per il gene bersaglio di miR-21-5p CADM1. (A) Diagramma di Venn che illustra i geni bersaglio comuni di miR-21-5p identificati dai database predittivi miRWalk, StarBase e TargetScan. (B) Grafico a bolle dell'analisi di arricchimento funzionale GO per i geni bersaglio intersecanti. (C) Grafico a barre dei pathway di segnalazione KEGG maggiormente arricchiti. (D) Attività del reporter dual-luciferasi del 3'-UTR di CADM1 wild-type e mutante dopo sovraespressione di miR-21-5p. **P < 0,01; ns, non significativo. Il pannello D utilizza esclusivamente WT-CADM1 3'-UTR e MUT-CADM1 3'-UTR co-trasfettati con miR-21-5p mimic/mimic-NC per il rilevamento dual-luciferasi; le etichette Controllo/sovraespressione/interferenza presenti nei bozzetti originali sono state aggiustate in raggruppamenti standard WT/MUT nelle figure finali. L'analisi predittiva dei bersagli ha utilizzato tre database online; i valori di P di arricchimento sono stati corretti tramite la correzione FDR di Benjamini-Hochberg; gli esperimenti dual-luciferasi hanno incluso tre repliche biologiche (ciascuna con tre repliche tecniche); le barre di errore rappresentano la media ± DS; test t a due gruppi per il confronto statistico. Abbreviazioni: CADM1 = molecola di adesione cellulare 1; GO = Gene Ontology; KEGG = Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; MUT = mutante; NC = controllo negativo; ns = non significativo; UTR = regione non tradotta; WT = wild type. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Esperimenti di recupero funzionale che verificano l'asse regolatorio miR-21-5p/CADM1 in cellule A549 e H1299. (A) Espressione relativa di miR-21-5p dopo la trasfezione con mimic o inibitore. (B) Espressione relativa dell'mRNA di CRP, TNF-α e IL-6 nei gruppi LV-CADM1 e si-CADM1. (C) Quantificazione statistica dell'abilità relativa alla migrazione in condizioni di sovraespressione di CADM1. (D) Quantificazione del numero di cellule migrate per campo microscopico nei gruppi LV-CADM1. (E) Valori di OD₄₅₀ nel saggio CCK-8 per i gruppi di recupero A549 (LV-NC, LV-21, LV-CADM1, LV-21+LV-CADM1, si-NC, si-CADM1, si-CADM1+inibitore di miR-21). (F) Valori di OD₄₅₀ nel saggio CCK-8 per i gruppi di recupero H1299 con identici trattamenti di trasfezione. **P < 0,01, ***P < 0,001. Tutti gli esperimenti di recupero includevano tre ripetizioni biologiche indipendenti; le barre di errore indicano media ± DS, ANOVA ad un fattore con test post-hoc di Bonferroni per confronti multiplo. Abbreviazioni: CADM1 = molecola di adesione cellulare 1; CRP = proteina C reattiva; IL-6 = interleuchina-6; LV = vettore lentivirale; NC = controllo negativo; OD = densità ottica; qRT-PCR = PCR quantitativa con trascrizione inversa; si = RNA interferente corto; TNF-α = fattore di necrosi tumorale alfa. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Espressione di miR-21-5p | Totale | x2 | Valore P | |||
| Bassa | Alta | |||||
| Età (anni) | ≤60 | 24 | 29 | 53 | 1,357 | 0,244 |
| ˃60 | 37 | 67 | 104 | |||
| Totale | 61 | 96 | 157 | |||
| Sesso | Maschio | 42 | 73 | 115 | 1,06 | 0,3032 |
| Femmina | 19 | 23 | 42 | |||
| Totale | 61 | 96 | 157 | |||
| Tipo istologico | Carcinoma a cellule squamose | 31 | 41 | 72 | 1,09 | 0,2965 |
| Adenocarcinoma | 30 | 55 | 85 | |||
| Totale | 61 | 96 | 157 | |||
| Grado del tumore | Ⅰ-Ⅱ | 55 | 58 | 113 | 16,25 | 0,00006 |
| Ⅲ | 6 | 38 | 44 | |||
| Totale | 61 | 96 | 157 | |||
| Metastasi linfonodale | Negativa | 41 | 37 | 78 | 12,17 | 0,00049 |
| Positiva | 20 | 59 | 79 | |||
| Totale | 61 | 96 | 157 | |||
| Dimensione del tumore (cm) | ≤3 | 20 | 23 | 43 | 5,623 | 0,0601 |
| 3-7 | 40 | 62 | 102 | |||
| ˃7 | 1 | 11 | 12 | |||
| Totale | 61 | 96 | 157 | |||
| Stadio T | T1 | 15 | 17 | 32 | 4,295 | 0,117 |
| T2 | 36 | 52 | 88 | |||
| T3 | 10 | 27 | 37 | |||
| Totale | 61 | 96 | 157 | |||
Tabella 1: Associazione tra l'espressione di miR-21-5p e le caratteristiche clinicopatologiche nei pazienti con carcinoma polmonare non a piccole cellule. I valori rappresentano il numero di pazienti. Le associazioni sono state valutate mediante il test χ2. Abbreviazione: NSCLC = carcinoma polmonare non a piccole cellule. Ogni test χ2 è stato eseguito per le variabili clinicopatologiche categoriche; tutte le analisi hanno incluso l'intero campione di 157 pazienti.
| n | P valore | Rischio relativo | Intervallo di confidenza al 95% | |||
| Inferiore | Superiore | |||||
| Età (anni) | ≤60 | 53 | 0.503 | 1.282 | 0.62 | 2.652 |
| ˃60 | 104 | |||||
| Sesso | Maschio | 115 | 0.339 | 1.418 | 0.693 | 2.901 |
| Femmina | 42 | |||||
| Tipo istologico | Carcinoma a cellule squamose | 72 | 0.515 | 1.261 | 0.627 | 2.537 |
| Adenocarcinoma | 85 | |||||
| Espressione di miR-21-5p | Alta | 96 | 0.005 | 3.066 | 1.412 | 6.659 |
| Bassa | 61 | |||||
| Metastasi linfonodale | Negativa | 78 | 0.002 | 22.295 | 3.039 | 163.588 |
| Positiva | 79 | |||||
Tabella 2: Analisi multivariata di Cox a rischi proporzionali della sopravvivenza complessiva in pazienti con carcinoma polmonare non a piccole cellule. I valori sono rapporti di rischio con intervalli di confidenza al 95%. Abbreviazioni: CI = intervallo di confidenza; NSCLC = carcinoma polmonare non a piccole cellule. È stata effettuata una regressione multivariata di Cox sull'intero set di dati clinici del gruppo di studio; il rapporto di rischio (HR) e l'intervallo di confidenza al 95% sono stati calcolati per la valutazione prognostica indipendente.
File Supplementare 1: Sequenze di oligonucleotidi e primer utilizzati per la trasfezione e la PCR quantitativa di retrotrascrizione. Il file elenca il mimico e l'inibitore di miR-21-5p, i rispettivi controlli negativi e i primer per CADM1, GAPDH, hsa-miR-21-5p e cel-miR-39. Tutte le sequenze sono riportate nella direzione 5′–3′. Abbreviazioni: CADM1 = molecola di adesione cellulare 1; cel = Caenorhabditis elegans; GAPDH = deidrogenasi del gliceraldeide-3-fosfato; hsa = Homo sapiens; miR = microRNA; PCR = reazione a catena della polimerasi. Cliccare qui per scaricare il file.
File Supplementare 2. Dati originali a supporto delle figure. Questo file contiene i set di dati di base e le analisi statistiche utilizzate per generare le figure presentate nel manoscritto, inclusi le caratteristiche cliniche, le analisi di espressione, i dati di sopravvivenza e i relativi risultati statistici. Questi dati originali sostengono i risultati riportati nel testo principale. Cliccare qui per scaricare questo file.
Discussione
Questo studio ha confermato sistematicamente un'espressione elevata di miR-21-5p nei tessuti clinici di NSCLC, correlata a un aumento della trascrizione dei fattori infiammatori, nonché a una maggiore capacità di migrazione e proliferazione cellulare; esperimenti di dual-luciferase, qRT-PCR e di recupero hanno identificato CADM1 come suo diretto bersaglio funzionale, mentre analisi bioinformatiche hanno ulteriormente indicato che i bersagli a valle di miR-21-5p sono arricchiti nelle cascate oncogeniche MAPK e Ras, fornendo evidenze preliminari del coinvolgimento dell'asse miR-21-5p/CADM1 in vie di segnalazione associate alla progressione maligna del tumore.
L'analisi del coorte clinico ha rivelato che un'elevata espressione di miR-21-5p era strettamente associata a un grado tumorale avanzato, metastasi ai linfonodi e sopravvivenza complessiva più breve. La regressione di Cox multivariata ha confermato miR-21-5p come un fattore prognostico avverso indipendente, suggerendo che miR-21-5p potrebbe fungere da biomarcatore potenziale per valutare il rischio di progressione e l'esito della sopravvivenza nei pazienti con NSCLC.
Saggi funzionali in vitro hanno mostrato che l'overespressione di miR-21-5p favorisce la proliferazione, la migrazione e la risposta infiammatoria delle cellule NSCLC, mentre l'aumento di CADM1 inverte tutti questi fenotipi oncogenici; la correlazione negativa di espressione tra miR-21-5p e CADM1 nei campioni dei pazienti, insieme ai dati cellulari di recupero, ha completamente chiarito il meccanismo regolatorio secondo cui miR-21-5p induce comportamenti maligni nel NSCLC inibendo direttamente CADM1.
In linea con studi precedenti che riportano il ruolo oncogenico di miR-21-5p nel carcinoma polmonare, questo lavoro integra ulteriori dati clinici di correlazione e una completa validazione di recupero per confermare la sua funzione di promozione tumorale; a differenza delle ricerche esistenti, che si concentrano soltanto su un singolo fenotipo di metastasi, lo studio attuale collega contemporaneamente miR-21-5p alla proliferazione cellulare e al microambiente infiammatorio tumorale attraverso il target CADM1, ampliando la rete regolatoria di miR-21-5p nel carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC).
Sulla base delle precedenti evidenze preliminari, il rilevamento dell'espressione tissutale di miR-21-5p ha un potenziale valore ausiliario per la stratificazione del rischio e la valutazione prognostica del NSCLC, e l'asse miR-21-5p/CADM1 potrebbe fornire nuovi bersagli molecolari candidati per lo sviluppo di strategie di intervento anti-progressione per il NSCLC, sebbene l'efficacia terapeutica clinica rimanga da verificare.
Questo studio presenta diversi limiti. Sono stati utilizzati saggi cellulari in vitro e un singolo coorte clinico retrospettivo, senza validazione tramite xenotrapianto in vivo o coorte esterna indipendente. Non sono stati eseguiti ulteriori saggi di proliferazione (ad esempio, saggi con EdU e di formazione di colonie), né saggi di invasione, apoptosi e del ciclo cellulare. Non sono stati inoltre disponibili test su sangue periferico per valutarne il potenziale diagnostico non invasivo, la validazione a livello proteico di CADM1, l'elenco completo dei geni target sovrapposti e un'analisi sistematica della rete di interazioni proteina-proteina (PPI). Studi futuri dovrebbero affrontare tali limitazioni ed esaminare ulteriormente i regolatori a monte di miR-21-5p e la segnalazione a valle di CADM1.
Nel complesso, questo studio fornisce evidenze preliminari che il miR-21-5p agisce come un microRNA oncogenico, accelerando la proliferazione, la migrazione e l'infiammazione del NSCLC attraverso il targeting diretto di CADM1, e la sua elevata espressione predice una sopravvivenza sfavorevole nei pazienti.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno interessi finanziari o non finanziari rilevanti da dichiarare.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Formalina neutra tampone al 10% | Fisher Scientific (Fisherbrand™) | SF100-4 (tipico) | Fissativo per tessuti; tessuti tagliati a &spessore <5 mm, fissato a temperatura ambiente per 14-26 ore |
| Piastra per coltura cellulare a 24 pozzetti | Corning | 3526 | Piastra per la semina di cellule transfezionate e per l'esecuzione del saggio di guarigione della ferita (scratch) |
| Linea cellulare A549 | ATCC (o Shanghai Resource Center) | CCL-185 | Linea cellulare umana di carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) (adenocarcinoma) |
| kit per saggio CCK-8 | Dojindo | CK04 | Rilevamento della proliferazione |
| Mezzo di coltura cellulare (non specificato) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | Vari (ad es. RPMI-1640: 11875093, F-12K: 21127022) | Mezzo basale per linee cellulari di NSCLC; la composizione esatta dipende dalla linea cellulare utilizzata |
| cel-miR-39 (Controllo esogeno di tipo spike-in) | GenePharma (Shanghai, Cina) | Personalizzato (ad es. B010302) | Riferimento esterno per la normalizzazione dell'espressione di miRNA, aggiunto durante l'isolamento dell'RNA |
| CO2 Incubatrice (umidificata) | Thermo Fisher Scientific (Heracell) | Heracell 150i (50116047) | Fornisce 37°C, 5% CO₂2e umidità satura per la coltura cellulare |
| CRP/TNF-αCoppie di primer per IL-6 | Sangon Biotech | sintesi su misura | Sequenze complete nel File Supplementare 1 |
| Soluzione colorante al violetto di cristallo | Solarbio | G1062 | Colorazione delle cellule migrate |
| mezzo DMEM | Gibco | 11965092 | Per la coltura di H1299/293T |
| Kit per saggio del reporter dual-luciferase | Promega | E1910 | Rilevamento della 3'UTR di CADM1 WT/MUT |
| cel-miR-39 esogeno | Qiagen | spike-in personalizzato | Aggiunto dopo l'isolamento dell'RNA per la normalizzazione |
| Siero bovino fetale (FBS) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 10437028 | Supplemento aggiunto al mezzo di coltura alla concentrazione finale del 10% per favorire la crescita cellulare |
| Punta di pipetta fine (ad es., 10 µL punta | Axygen (Corning) | T-300 | Utilizzato per raschiare manualmente un monostrato di cellule al fine di creare un "ferita" gap |
| GAPDH (controllo endogeno) | Diversi fornitori (ad es., Sangon Biotech, RiboBio; primer personalizzati) | Personalizzato | Gene di riferimento per la normalizzazione dell'mRNA utilizzato nella qRT-PCR |
| GO/KEGG (annotazione clusterProfiler) | Bioconductor | Costruzione 2026 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | v9.5.1 | Rappresentazione grafica & statistica in vitro |
| Linea cellulare H1299 | ATCC (o Shanghai Resource Center) | CRL-5803 | Linea cellulare umana di carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) derivata da metastasi linfonodale |
| FBS inattivato per riscaldamento | Gibco | 10099141 | concentrazione di lavoro al 10% |
| linea cellulare HEK-293T | ATCC | CRL-3216 | RRID:CVCL_0063; test STR effettuato mensilmente, accertamento di micoplasma negativo |
| Miscela per il confezionamento del lentivirus | Genecopoeia (o Takara Bio) | HPK-LvT-100 (Genecopoeia) | Fornisce plasmidi di imballaggio (gag/pol, rev, vsv-g) per la produzione di lentivirus |
| Vettore Lentivirus-21 (LV-21) | GeneChem (Shanghai, Cina) o Genecopoeia | Personalizzato | Vettore lentivirale contenente miR-21-5p per la costruzione di linee cellulari con espressione stabile |
| Vettore Lentivirale-NC (LV-NC) | GeneChem (Shanghai, Cina) o Genecopoeia | Personalizzato | Vettore lentivirale di controllo negativo senza inserto miR-21-5p |
| Reagente per la trasfezione lipidica | Thermo Fisher | L3000015 | Per la trasfezione transitoria |
| Reagente per trasfezione Lipofectamine 3000 | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | L3000015 o L3000008 | Reagente di trasfezione a base lipidica; 50 ore dopo la trasfezione per esperimenti successivi |
| Metanolo | Sinopharm | 67-56-1 | Fissazione delle cellule |
| Metanolo (fissativo/diluente per colorazione) | Sigma-Aldrich | 34860 | Utilizzato come fissativo o diluente per la colorazione con violetto di cristallo |
| inibitore di miR-21-5p/inibitore-NC | GenePharma | sintesi su misura | Sequenze nel File Supplementare 1 |
| mimica di miR-21-5p/mimica-NC | GenePharma | sintesi su misura | Sequenze nel File Supplementare 1 |
| miRDB | Washington University | v6.0 | |
| miRWalk | Università di Heidelberg | v3.0 | |
| Centro Nazionale di Ingegneria Biopsica | Centro Nazionale di Ingegneria delle Biopsie (Cina) | N/A | Fornitore istituzionale di campioni di tessuto tumorale polmonare con dati clinici registrati e diagnosi istopatologica |
| Tessuto di NSCLC (per coltura primaria) | Shanghai Rui Bao He Biotechnology Co. | Ordine personalizzato | Fonte del tessuto; coltivato in mezzo con 10% di siero fetale bovino (FBS) a 37°C; cellule con buona morfologia in fase di crescita logaritmica selezionate per la trasfezione |
| Strumento per PCR | Applied Biosystems (Thermo Fisher Scientific) | 7500 Fast (4406984) | Ottenere i prodotti di amplificazione per qRT-PCR |
| Penicillina-Streptomicina | Solarbio | P1400 | 100 U/mL di penicillina, 100 μg/mL streptomycin |
| Pipette (Singola & Multicanale | Eppendorf | Serie Research Plus | Per un'accurata manipolazione dei liquidi in tutti gli esperimenti |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | Finale 5 μg/mL per l'infezione da lentivirus |
| Puromicina | InvivoGen | ant-pr-1 | 5 μg/mL per lo screening di cellule stabili |
| Puromicina diidrocloruro | Thermo Fisher Scientific (InvivoGen) | ant-pr-1 (InvivoGen); P7255 (Sigma-Aldrich) | antibiotico selettivo, utilizzato a 5 μg/mL per ottenere linee cellulari stably transfettate |
| R | Fondazione R | v4.2.1 | Pacchetto: clusterProfiler, ggplot2 |
| kit di trascrizione inversa | Takara | RR047 | RT con stem-loop per miRNA, oligo(dT) per mRNA |
| Tubi EP privi di RNasi | Axygen (Corning) | MCT-150-C | Tubi da 1,5 mL privi di RNasi per la conservazione e lavorazione dell'RNA |
| mezzo RPMI-1640 | Gibco | 11875093 | Per la coltura di A549 |
| si-CADM1 | GenePharma | sintesi su misura | Sequenze nel File Supplementare 1 |
| si-NC | GenePharma | sintesi su misura | Sequenze nel File Supplementare 1 |
| SPSS | IBM | v26.0 | Analisi clinica/analisi di regressione di Cox |
| SYBR Green qPCR Master Mix | Roche | 4913914001 | amplificazione qRT-PCR |
| TargetScan | MIT | v8.2 | |
| Reagente per l'estrazione di RNA totale | Takara | 9109 | Lisi basata su fenolo/guanidina |
| Camera a trans-well | Corning (Costar) | 3422 (24 pozzetti, 8.0 µm) | Per la trasfezione cellulare in mezzo a temperatura ambiente; aggiunta di primer chimici e incubazione per 48 h |
| Camere di migrazione Transwell | Corning | 3422 | 8 μm dimensione dei pori |
| Reagente TRIzol | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | 15596026 | Estrazione di RNA totale da campioni di tessuto; valutazione della qualità dell'RNA mediante i rapporti OD260/280 e OD260/230 |
| Tripaina-EDTA (0,25%) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 25200072 | Per il distacco delle cellule dai vasi di coltura prima della semina in piastre a 24 pozzetti |
Riferimenti
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- Nicholson AG, et al. The 2021 WHO classification of lung tumors: impact of advances since 2015. J Thorac Oncol. 2022;17(3):362-87.
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