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Articolo metodologico

Un nuovo metodo di biopsia su scala per raccogliere linfociti maligni e non maligni del pesce zebra

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DOI:

10.3791/72153

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7 agosto 2026

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1Department of Cell Biology, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Division of Pediatric Hematology-Oncology, Department of Pediatrics, Stephenson Cancer Center, 3Department of Microbiology & Immunology, University of Oklahoma Health Sciences Center

In questo articolo

Sommario

Un nuovo metodo di biopsia su scala consente la raccolta di cellule di leucemia linfoblastica acuta da pesci zebra viventi. I risultati mostrano abbondanza di linfociti nelle scaglie di pesce di tipo selvatico (WT) e un aumento drastico dei linfociti nelle scaglie di pesci con ALL (leucemia linfoblastica acuta). Questa tecnica consente uno studio minimamente invasivo dei linfociti epidermici normali e maligni.

Abstract

Il pesce zebra (Danio rerio) è un modello potente per studiare la linfopoiesi e i tumori linfoidi, poiché il pesce zebra e gli esseri umani condividono sistemi immunitari adattivi simili, inclusi le cellule B e T. Sono descritti diversi modelli di leucemia linfoblastica acuta a cellule D. rerio T (T-ALL), inclusi pesci che esprimono MYC umano specifico per linfoblasti (hMYC). Abbiamo riportato che i pesci rag2:hMYC sviluppano anche leucemia linfoblastica acuta a cellule B (B-ALL), rendendoli utili per studiare entrambi i tipi ALL. Un limite dei modelli ALL con pesci zebra è che non esistono metodi non letali per il campionamento seriale di ALL. Per affrontare questo problema, abbiamo introdotto un nuovo metodo di 'biopsia a squama' per raccogliere TUTTE le cellule da pesci zebra vivi. Tuttavia, le conoscenze su quali linfociti risiedono nelle normali scaglie di pesce zebra sono scarse. Pertanto, per definire le normali identità dei linfociti epidermici, abbiamo eseguito biopsie a scala su linee transgeniche marcate da linfociti prive di rag2:hMYC. Abbiamo utilizzato microscopia convenzionale e confocale per analizzare le squame, rivelando abbondanti linfociti epidermici. Abbiamo inoltre analizzato le scaglie di pesci con T- e B-ALL, che hanno mostrato un aumento marcato dei linfociti in fogli confluenti di cellule ALL su molte squame. Successivamente abbiamo utilizzato la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) per purificare i linfociti non maligni e TUTTI i linfociti dalle squame per studi ex vivo . Le analisi citometriche di flusso ed espressione delle cellule ALL da squame o altri tessuti dello stesso pesce hanno mostrato che l'espressione genica delle cellule ALL in scala somigliava a quella delle cellule ALL altrove. Abbiamo anche quantificato il numero di cellule normali T, B, T-ALL e B-ALL che potevano essere purificate per scala. Nel complesso, la biopsia a squame fornisce una tecnica non letale e minimamente invasiva per studiare i linfociti epidermici dei pesci zebra, consentendo studi ex vivo , inclusi l'analisi di campioni maligni.

Introduzione

La funzione barriera della pelle dei mammiferi e i suoi ruoli nell'immunità sono stabiliti 1,2,3. I linfociti dei mammiferi contribuiscono all'immunità cutanea, con cellule T citotossiche che risiedono nell'epidermide, e cellule B, T e natural killer (NK) presenti nel derma 1,3,4,5. I pesci zebra possiedono questi linfociti, con immunoglobuline di superficie, recettori delle cellule T, recettori del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC), citochine e i loro recettori, e altre molecole immunitarie, condividendo così la maggior parte delle caratteristiche immunologiche deimammiferi 6,7,8,9. Studi recenti sulla pelle e sulle scaglie del pesce zebra hanno dimostrato diverse popolazioni di linfociti cutanei, tra cui le cellule T e Bepiteliali 10,11, e una rete linfoide che facilita il traffico di cellule T e la sorveglianza degliantigeni 12. Le somiglianze tra i linfociti dei pesci teleostiche e i mammiferi rendono D. rerio un potente modello in vivo per studiare la linfopoiesi, la funzione dei linfociti e le malattie linfoide, inclusa la leucemia linfoblastica acuta (ALL)8,10,13,14,15,16,17,18,19,20.

I nostri lavori precedenti hanno mostrato che la linea T e B ALL (T-ALL, B-ALL) derivano entrambi nel pesce zebra transgenico rag2:hMYC, rendendo questa linea utile per studiare entrambi i tipiALL 13,15,21,22. Una delle principali limitazioni dei modelli ALL di D. rerio, in particolare negli studi di espressione longitudinale o negli studi di test antidroga, è la mancanza di metodi per raccogliere campioni ALL seriali da singoli animali. I metodi precedenti, come la raccolta del sangue retro-orbitale, sono tecnicamente difficili a causa della piccola dimensione di D. rerio, che rende difficile il prelievo serialedi sangue 23. Perciò, la maggior parte dei ricercatori sopporta i pesci zebra per ottenere TUTTE le cellule. Questa è stata una pratica comune in laboratorio e nella maggior parte dei lavori sul campo, ma impedisce di effettuare esperimenti longitudinali su animali vivi. Per superare ciò, abbiamo recentemente descritto linfociti epiteliali T e B in scaglie di pesce zebra raccolte utilizzando una strategia di biopsia a squamanon letale 10. Un altro studio recente ha dimostrato un serbatoio di cellule T sulla superficie o vicino alla superficie del pesce zebra, tra le scaglieadiacenti 12. D. rerio ospita centinaia di scaglie, che si rigenerano rapidamente pochi giorni dopo la rimozionedi 24. Insieme, questi risultati e caratteristiche indicano che le scaglie del pesce zebra sono una fonte di linfociti che non richiedono l'eutanasia, permettendo studi longitudinali su pesci viventi.

Qui descriviamo un metodo di biopsia a squama per raccogliere linfociti epidermici di pesci zebra da pesci con marcatori fluoroforosi specifici per linfociti, con o senza ALL. Per studiare le cellule della linea T, abbiamo utilizzato pesci ben consolidati lck:GFP e una linea simile lck:mCherry; entrambi etichettano le celle T e T-ALL 10,13,15,20. Per studiare le cellule della linea B, abbiamo utilizzato pesci transgenici cd79a:GFP e cd79b:GFP con cellule B e B-ALL marcatefluorescentmente 10,13,17. Ciascuna di queste linee consente la visualizzazione tramite microscopia fluorescente e la purificazione cellulare citometricaa flusso 13. Abbiamo esaminato le squame dopo la biopsia, generando immagini ad alta risoluzione dei linfociti nelle squame, identificando l'espressione genica dei linfociti epidermici tramite qRT-PCR, confrontandola con quella dei linfociti di altri tessuti linfoidi dello stesso pesce e quantificando i linfociti per squama tramite citometria di flusso e selezione cellulare attivata dalla fluorescenza. In sintesi, il protocollo descrive un metodo semplice e pratico per ottenere linfociti da pesci zebra vivi, incluso il campionamento longitudinale di singoli animali su più punti temporali in una sequenza sperimentale. Questo metodo è pensato per studiare la biologia dei linfociti del pesce zebra, la progressione della leucemia, le risposte farmacologiche o altri disegni sperimentali longitudinali che richiedono campionamenti ripetuti su singoli pesci zebra. Abbiamo sviluppato il protocollo utilizzando pesci zebra transgenici adulti con popolazioni di linfociti marcate fluorescenti e lo abbiamo validato per applicazioni a valle, inclusi microscopia a fluorescenza, citometria a flusso/selezione cellulare attivata dalla fluorescenza, analisi dell'espressione RNA e altri studi ex vivo che richiedono linfociti vitali.

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Protocollo

Tutte le procedure animali sono state approvate dal Comitato per la Cura e l'Uso Istituzionale degli Animali del Centro di Scienze della Salute dell'Università dell'Oklahoma (protocolli 24-028-EAH e 25-068-EHUNIR). Questo protocollo propone un approccio per isolare e analizzare linfociti normali e/o maligni dalle scaglie di pesci zebra vivi, con dettagli sullo scopo, l'esecuzione e i principi alla base di queste procedure.

ATTENZIONE: MS-222 è un anestetico chimico pericoloso e deve essere maneggiato con dispositivi di protezione individuale (DPI) appropriati, come guanti da laboratorio, protezione per gli occhi e camice da laboratorio. Smaltire le soluzioni MS-222 in conformità con le linee guida istituzionali sui rifiuti chimici. Fai attenzione quando maneggi aghi e forze per prevenire ferite da tagliente. Considerare tutti i campioni biologici potenzialmente biohazardi e smaltire i rifiuti in conformità con le procedure istituzionali di biosicurezza.

1. Preparazione dei mezzi di smistamento

  1. Integrare 1× soluzione di substrato RPMI 1640 con siero fetale bovino (FBS) all'1% e 1% di penicillina/streptomicina.
    NOTA: I mezzi RPMI 1640 mantengono la vitalità dei linfociti ex vivo. RPMI 1640 può essere sostituito con un PBS 0,9×. Il siero bovino fetale (FBS) fornisce fattori di crescita per promuovere la vitalità cellulare. Penicillina e streptomicina limitano la contaminazione batterica.
  2. Mezzi aliquoti in tubi microcentrifughe da 1,5 mL in volumi da 500 μL, con ogni tubo destinato a scale da 10 a 20 secondi. Continua a selezionare i tubi del mezzo sul ghiaccio.

2. Anestesia dei pesci zebra, screening microscopico a fluorescenza e imaging

  1. Anestesiare D. rerio con metanasolfatto di tricaina (MS-222) tamponato allo 0,02% preparato secondo le linee guida istituzionali per la cura degli animali utilizzando acqua del sistema ittico.
  2. Una volta sedato, si colloca delicatamente il pesce in una tavola di coltura cellulare con sufficiente acqua di sistema (più 0,02% di MS-222) per mantenere l'umidità durante la successiva manipolazione.
  3. Esaminare e fotografare i pesci anestetizzati utilizzando un microscopio epifluorescente per rilevare la fluorescenza del/i transgene/i. Questo passaggio identifica le bilance fluorescenti per la biopsia.
    NOTA: Le linee prive di transgeni fluorescenti possono essere osservate tramite microscopia luminosa standard.
  4. Usa la fluorescenza per identificare le cellule T (lck:GFP o lck:mPesci ciliegia) o T-ALL (rag2:hMYC + lck:GFP o lck:mPesci ciliegia). Le cellule della linea T sono luminosamente fluorescenti in queste linee; Le cellule B-ALL sono debolmente fluorescenti nei fondi lck:GFP e lck:mCherry 13,15,21.
  5. Selezionare i pesci etichettati con la linea B cd79a:GFP o cd79b:GFP (con o senza rag2:hMYC) per le cellule B epidermiche e/o B-ALL, utilizzando GFP per selezionare le squame da biopsia.
  6. Esercitati a posizionare i pesci zebra e regolare le impostazioni del microscopio prima della biopsia, se si desidera l'imaging
    NOTA: L'imaging e la biopsia richiedono 5–7 minuti di sedazione tramite MS-222 allo 0,02%. Monitorare continuamente i movimenti opercolare. Se il movimento opercolare rallenta notevolmente o si ferma, trasferire immediatamente il pesce in un sistema di acqua privo di anestetici e interrompere la biopsia. Riapplicare ~50–100 μL di acqua di pesce contenente anestetico su pelle, opercolo e branchie ogni 1–2 minuti durante l'imaging e la biopsia per mantenere l'umidità superficiale.

3. Raccolta e preparazione delle scale

  1. Per posizionare il pesce per la biopsia, posiziona il pesce sedato su un fianco in un piatto di coltura cellulare.
  2. Per evitare che il pesce scivoli durante la biopsia, usa una spugna umida con un taglio lineare o a V e mettila nella piastra di coltura cellulare per cullare il pesce.
  3. In alternativa, assicurati che il livello dell'acqua del sistema copra a malapena il fondo della ciotola di coltura cellulare (abbastanza da mantenere la superficie umida) per permettere alla tensione superficiale di stabilizzare il pesce.
  4. Applicare periodicamente ~50–100 μL di MS-222 allo 0,02% preparato in acqua di sistema sull'opercolo e sulle branchie per mantenere l'umidità e sostenere l'anestesia durante l'imaging e la biopsia.
  5. Eseguire una biopsia tramite microscopia a epifluorescenza per selezionare squame altamente fluorescenti arricchite da linfociti o cellule ALL.
  6. Raccogli 10–20 squame adiacenti da una singola regione altamente fluorescente, preferibilmente all'interno della prima o seconda striscia pigmentata orizzontale.
    NOTA: Una sola scala è generalmente sufficiente per l'imaging. Una raccolta di 10–20 squame produce tipicamente >1.000 linfociti da pesci WT ed è raccomandata per analisi a valle come la citometria di flusso e la qRT-PCR.
  7. Mano dominante (ago): Usa un ago per siringa calibro 31, posiziona delicatamente la punta dell'ago sotto il bordo posteriore di una scala e giralo in avanti (cioè cefalad). Usa un ago sterile diverso per ogni pesce. Pulire le pinze tra i pesci; sterilizza se richiesto dalle procedure istituzionali.
    NOTA: Sollevare la scala con un ago è preferibile all'uso solo delle pinze, poiché solleva la scala per minimizzare la raschiatura superficiale. Questo garantisce che lo strato epidermico delicato sotto la coccina rimanga aderente alla superficie della squama, fondamentale per massimizzare la resa cellulare.
  8. Mano non dominante (pinze): Tenendo la bilancia in posizione ribaltata in avanti con l'ago, afferra la superficie esterna rigida della bilancia con la pinza. Con un movimento fluido, estrai la bilancia dalla tasca.
    NOTA: Può verificarsi un lieve sanguinamento nei siti di estrazione delle squame, che è tipicamente autolimitato.
  9. Se si verifica un sanguinamento eccessivo, applica una pressione delicata con la pinza e risciacqua brevemente con lo 0,02% di MS-222 nell'acqua del sistema.
    NOTA: L'emostasi può essere raggiunta in pochi secondi prima di passare alla scala successiva.
  10. Per biopsiare più squame, raccogliere 10–20 squame per pesce, rimuovendo le squame adiacenti da una regione contigua in una striscia pigmentata orizzontale, invece che su più regioni del corpo o su entrambi i lati dell'animale.
  11. Strappare le singole squame in sequenza e tenerle sulle punte della pinza durante la raccolta con la superficie mediale rivolta verso l'alto.
  12. Per evitare interferenze delle scaglie accumulate con la successiva rimozione delle scaglie, si inclina prima in avanti ogni scaglia e poi afferrala dal bordo posteriore. Trasferire le bilance in un tubo contenente mezzi di selezione dopo ogni 5 squame, o ogni volta che ulteriori squame non possono essere trattenute in modo sicuro sulle punte della pinza.
  13. Dopo la raccolta delle squame, processare i campioni il più rapidamente possibile. Trasferire immediatamente le squame dalle pinze in tubi da 1,5 mL contenenti 500 μL di mezzo di selezione fredda su ghiaccio per preservare la vitalità cellulare. Decontaminare le pinze tra i pesci usando etanolo al 70% prima di raccogliere i campioni successivi. Processare le scaglie di ciascun pesce in tubi separati durante la raccolta, la dissociazione e per le analisi a valle.
  14. Dopo la raccolta delle scaglie, trasferire immediatamente il pesce in una vasca di recupero con acqua di sistema dolce senza MS-222.
  15. Monitorare i movimenti opercolari e il comportamento di nuoto fino a quando la respirazione e la postura normali non saranno ristabilite. Osservare il sito della biopsia per eventuali sanguinamenti persistenti o segni di disagio prima di rimettere il pesce nel sistema di ricircolazione.
  16. Riportare il pesce nella sua vasca di origine dopo il normale equilibrio e la ripresa del nuoto.

4. Dissociazione cellulare e filtraggio

  1. Controlla le squame sul fondo del tubo. Le scaglie sono facilmente visibili a occhio nudo prima della dissociazione. Dissociare le squame utilizzando un omogeneizzatore di pestell a microtubi in plastica sterile, applicando una pressione manuale delicata e controllata per 30–60 secondi.
  2. Utilizzare movimenti lenti di rotazione e su e giù per liberare le cellule epidermiche evitando un eccessivo taglio delle squame.
  3. Continua la dissociazione finché i media di smistamento non diventano visibilmente torbidi.
    NOTA: Il successo della procedura è indicato dal fatto che il substrato diventa torbido, indicando un'alta concentrazione di cellule liberate in sospensione.
  4. Far passare campioni omogeneizzati attraverso un filtro a rete di nylon da 35 μm per rimuovere i detriti e generare sospensioni a singola per citometria a flusso/selezione cellulare attivata dalla fluorescenza.
  5. Se sono presenti aggregati cellulari visibili dopo la filtrazione iniziale, si passa nuovamente il campione attraverso un nuovo filtro a rete a 35 μm immediatamente prima dell'analisi citometrica del flusso. Ripeti la filtrazione non più di 2 volte per minimizzare la perdita cellulare.

5. Analisi citometrica a flusso

  1. Analizza i campioni tramite citometria a flusso.
    NOTA: La citometria a flusso può essere eseguita prima della purificazione cellulare attivata dalla fluorescenza o dell'estrazione di RNA per valutare la composizione del campione.
  2. Analizzare sospensioni a singola cellula utilizzando un citometro a flusso equipaggiato con un laser da 488 nm per il rilevamento GFP e un laser a 561 nm per il rilevamento mCherry.
  3. Escludere i detriti utilizzando i parametri di scatter diretto (FSC) e side scatter (SSC). Identificare i linfociti utilizzando la porta linfociticaprecedentemente descritta 10,13,21.
  4. Escludere gli aggregati cellulari tramite il passaggio a singolo (cioè area SSC [SSC-A] rispetto all'altezza SSC [SSC-H]).
  5. Valuta la vitalità cellulare usando propidio ioduro (PI) o un colorante vivo/morto equivalente. Escludere le cellule PI-positive dalle analisi e procedure di selezione successive.
  6. Stabilire porte di fluorescenza utilizzando controlli zebrafish non transgenici e controlli transgenici fluorescenti monocolore. Definire le popolazioni GFP-positive e mCherry-positive rispetto ai controlli negativi.
  7. Esportare file standard di citometria a flusso (FCS) e analizzare i dati utilizzando software di analisi della citometria a flusso.

6. Selezione cellulare attivata dalla fluorescenza

  1. Per ordinare le celle, si utilizza un sistema di selezione cellulare attivato dalla fluorescenza dotato di laser da 488 nm e/o 561 nm per il rilevamento di GFP e mCherry.
  2. Linfociti a gate sequenziali (FSC/SSC), singoletti (SSC-A contro SSC-H) e cellule vitali (PI-negative) prima della selezione basata sulla fluorescenza.
  3. Definire le popolazioni diGFP lo, GFPhi e mCherry-positive utilizzando porte di fluorescenza stabilite da campioni di controllo negativi.
  4. Classifica le popolazioni diGFP lo, GFPhi e mCherry-positive in tubetti di raccolta contenenti mezzi di selezione raffreddati.
    NOTA: In questo lavoro con la linea lck:GFP, le cellule ad alta GFP (GFP hi) e bassa a GFP (GFPlo) sono linee linfocitarie distinte, come descrittoin precedenza 10,13,15,21.
  5. Mantenere i campioni smistati sul ghiaccio e procedere immediatamente alle applicazioni a valle, come l'isolamento dell'RNA.

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Risultati

Seguendo i passaggi sopra, abbiamo anestesiato e selezionato il pesce zebra adulto per linfociti fluorescenti o ALL tramite microscopia. I pesci wild-type (WT) lck:GFP hanno mostrato fluorescenza principalmente nella regione timica, mentre i pesci cd79b:GFP hanno mostrato fluorescenza nella regione testa/branchia, coerente con le osservazioniprecedenti 10 (Figura 1A, a sinistra). Al contrario, i pesci rag2:hMYC d...

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Discussione

Questo protocollo descrive un metodo di biopsia a scala non letale per la raccolta dei linfociti epidermici dei pesci zebra, inclusi sia linfociti non maligni sia cellule di leucemia linfoblastica acuta (ALL). I pesci zebra sono modelli ben consolidati per la linfopoiesi e le neoplasie linfoide, ma la maggior parte degli approcci per ottenere linfociti richiede l'eutanasia e le dissezione dei tessuti, impedendo studi longitudinali su singoli animali

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse finanziari.

Ringraziamenti

Ringraziamo Ameera Hasan, M.B.B.S., Ph.D., e Brashé Wood per i loro contributi a questo progetto. Gli studi sono stati supportati dal programma pilota di sovvenzioni del Centro Oncologico Stephenson dell'OUHSC, dall'Oklahoma Center for Adult Stem Cell Research (OCASCR), dai programmi di team Science e Seed Grant della Presbyterian Health Foundation e dalla W.J. Jones Family Foundation. Il FACS del Core di Ricerca in Biologia Molecolare e Citometria del Stephenson Cancer Center dell'OUHSC è stato finanziato dal NCI Cancer Center Support Grant Award P30 CA225520. Questo studio è stato finanziato in parte da fondi dell'American Cancer Society (ACS-POST-BACC-23-1156971-01-DPBACC). Iman Owens è una borsista del programma "STRONG" post-laurea ACS.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Reagenti & Consumabili:
Tricaine metanesulfonato (MS-222)Sigma-AldrichE10521Agente anestetico
Medio RPMI 1640ThermoFisher11875093Media per la vitalità dei linfociti
Siero Bovine FetaleSigma-AldrichF2442Per la vitalità cellulare
Penicillina-StreptomicinaThermoFisher15140122Limitare la contaminazione batterica
Etanolo al 70%ThermoScientificT038181000Per sterilizzare le forbici
CellPro 1x PBSVWR104027-280Diluire a 0,9x con acqua sterile
Propidio IodideInvitrogenP1304MMPDiscriminazione cellule vive/morte per flow/FACS
Cut Goods Misc-Pn; Dimensione: 12 x 12 POL. Carta filtro da 35um
Lab Pak 03-35/16		SefarPer la selezione cellulare
Riferimento: Burroughs-Garcia, J., Hasan, A., Park, G., Borga, C., Frazer, J. K. Isolating malignant and non-malignant b cells from lck:Egfp zebrafish. J Vis Exp. 10.3791/59191 (144), (2019).
Alternativa alla carta filtro: EASYstrainer Cell Sieves, Greiner Bio-OneGreiner89508-342Per la selezione cellulare
Eppendorf® Flex-Tubes® Microtubes, 1,5 mlEppendorf®20901-551microcentrifuga per la selezione cellulare
Siringhe per insulina UltiCare VetRx U-100 da 3/10cc 31G x 5/16" Marca unità mezzaUltiCare9436Per le biopsie su scala
Piatto Petri profondo 100 x 25 mmUSA Scientific8609-0625Per le biopsie su scala
Bel-Art® Pestelli monousoBel-Art® BAF199230001Per la dissociazione su scala
Set di pinzette E-Z Pik 6 pezziAven18480EZPer le biopsie su scala
Vetrini microscodici Corning®, smerigliati su un lato, un'estremitàSigma-AldrichCLS294875X25Per l'imaging
Vetrini di coperturaSigma-AldrichC8181Per l'imaging
SlowFade™ Glass Soft-set Antifade Mountant, con DAPIThermoFisherS36920Per il montaggio delle scale su vetrino
RNeasy Mini Kit Qiagen74104Per l'estrazione di RNA
Attrezzatura:
Microscopio Nikon AZ100 e fotocamera DS-Qi1MCNikonMicroscopio a fluorescenza & fotocamera
Sistema CFX96 Touch-PCRBio-Rad3600037
CytoFLEXBeckman-CoulterAnalisi di citometria a flusso
Leica SP8LeicaMicroscopio confocale
Software:
Software di analisi Kaluza versione 2.1Beckman-CoulterAnalisi di citometria a flusso
Riferimento: https://www.beckman.com/flow-cytometry/software/kaluza/downloads
Software LAS-X versione 3.7.4.23463LeicaMicroscopio confocale
Riferimento: https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/downloads/

Riferimenti

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