Articolo metodologico

Un nuovo metodo di biopsia su scala per raccogliere linfociti maligni e non maligni del pesce zebra

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DOI:

10.3791/72153

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7 agosto 2026

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1Department of Cell Biology, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Division of Pediatric Hematology-Oncology, Department of Pediatrics, Stephenson Cancer Center, 3Department of Microbiology & Immunology, University of Oklahoma Health Sciences Center

In questo articolo

Sommario

Un nuovo metodo di biopsia su scala consente la raccolta di cellule di leucemia linfoblastica acuta da pesci zebra viventi. I risultati mostrano abbondanza di linfociti nelle scaglie di pesce di tipo selvatico (WT) e un aumento drastico dei linfociti nelle scaglie di pesci con ALL (leucemia linfoblastica acuta). Questa tecnica consente uno studio minimamente invasivo dei linfociti epidermici normali e maligni.

Abstract

Il pesce zebra (Danio rerio) è un modello potente per studiare la linfopoiesi e i tumori linfoidi, poiché il pesce zebra e gli esseri umani condividono sistemi immunitari adattivi simili, inclusi le cellule B e T. Sono descritti diversi modelli di leucemia linfoblastica acuta a cellule D. rerio T (T-ALL), inclusi pesci che esprimono MYC umano specifico per linfoblasti (hMYC). Abbiamo riportato che i pesci rag2:hMYC sviluppano anche leucemia linfoblastica acuta a cellule B (B-ALL), rendendoli utili per studiare entrambi i tipi ALL. Un limite dei modelli ALL con pesci zebra è che non esistono metodi non letali per il campionamento seriale di ALL. Per affrontare questo problema, abbiamo introdotto un nuovo metodo di 'biopsia a squama' per raccogliere TUTTE le cellule da pesci zebra vivi. Tuttavia, le conoscenze su quali linfociti risiedono nelle normali scaglie di pesce zebra sono scarse. Pertanto, per definire le normali identità dei linfociti epidermici, abbiamo eseguito biopsie a scala su linee transgeniche marcate da linfociti prive di rag2:hMYC. Abbiamo utilizzato microscopia convenzionale e confocale per analizzare le squame, rivelando abbondanti linfociti epidermici. Abbiamo inoltre analizzato le scaglie di pesci con T- e B-ALL, che hanno mostrato un aumento marcato dei linfociti in fogli confluenti di cellule ALL su molte squame. Successivamente abbiamo utilizzato la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) per purificare i linfociti non maligni e TUTTI i linfociti dalle squame per studi ex vivo . Le analisi citometriche di flusso ed espressione delle cellule ALL da squame o altri tessuti dello stesso pesce hanno mostrato che l'espressione genica delle cellule ALL in scala somigliava a quella delle cellule ALL altrove. Abbiamo anche quantificato il numero di cellule normali T, B, T-ALL e B-ALL che potevano essere purificate per scala. Nel complesso, la biopsia a squame fornisce una tecnica non letale e minimamente invasiva per studiare i linfociti epidermici dei pesci zebra, consentendo studi ex vivo , inclusi l'analisi di campioni maligni.

Introduzione

La funzione barriera della pelle dei mammiferi e i suoi ruoli nell'immunità sono stabiliti 1,2,3. I linfociti dei mammiferi contribuiscono all'immunità cutanea, con cellule T citotossiche che risiedono nell'epidermide, e cellule B, T e natural killer (NK) presenti nel derma 1,3,4,5. I pesci zebra possiedono questi linfociti, con immunoglobuline di superficie, recettori delle cellule T, recettori del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC), citochine e i loro recettori, e altre molecole immunitarie, condividendo così la maggior parte delle caratteristiche immunologiche deimammiferi 6,7,8,9. Studi recenti sulla pelle e sulle scaglie del pesce zebra hanno dimostrato diverse popolazioni di linfociti cutanei, tra cui le cellule T e Bepiteliali 10,11, e una rete linfoide che facilita il traffico di cellule T e la sorveglianza degliantigeni 12. Le somiglianze tra i linfociti dei pesci teleostiche e i mammiferi rendono D. rerio un potente modello in vivo per studiare la linfopoiesi, la funzione dei linfociti e le malattie linfoide, inclusa la leucemia linfoblastica acuta (ALL)8,10,13,14,15,16,17,18,19,20.

I nostri lavori precedenti hanno mostrato che la linea T e B ALL (T-ALL, B-ALL) derivano entrambi nel pesce zebra transgenico rag2:hMYC, rendendo questa linea utile per studiare entrambi i tipiALL 13,15,21,22. Una delle principali limitazioni dei modelli ALL di D. rerio, in particolare negli studi di espressione longitudinale o negli studi di test antidroga, è la mancanza di metodi per raccogliere campioni ALL seriali da singoli animali. I metodi precedenti, come la raccolta del sangue retro-orbitale, sono tecnicamente difficili a causa della piccola dimensione di D. rerio, che rende difficile il prelievo serialedi sangue 23. Perciò, la maggior parte dei ricercatori sopporta i pesci zebra per ottenere TUTTE le cellule. Questa è stata una pratica comune in laboratorio e nella maggior parte dei lavori sul campo, ma impedisce di effettuare esperimenti longitudinali su animali vivi. Per superare ciò, abbiamo recentemente descritto linfociti epiteliali T e B in scaglie di pesce zebra raccolte utilizzando una strategia di biopsia a squamanon letale 10. Un altro studio recente ha dimostrato un serbatoio di cellule T sulla superficie o vicino alla superficie del pesce zebra, tra le scaglieadiacenti 12. D. rerio ospita centinaia di scaglie, che si rigenerano rapidamente pochi giorni dopo la rimozionedi 24. Insieme, questi risultati e caratteristiche indicano che le scaglie del pesce zebra sono una fonte di linfociti che non richiedono l'eutanasia, permettendo studi longitudinali su pesci viventi.

Qui descriviamo un metodo di biopsia a squama per raccogliere linfociti epidermici di pesci zebra da pesci con marcatori fluoroforosi specifici per linfociti, con o senza ALL. Per studiare le cellule della linea T, abbiamo utilizzato pesci ben consolidati lck:GFP e una linea simile lck:mCherry; entrambi etichettano le celle T e T-ALL 10,13,15,20. Per studiare le cellule della linea B, abbiamo utilizzato pesci transgenici cd79a:GFP e cd79b:GFP con cellule B e B-ALL marcatefluorescentmente 10,13,17. Ciascuna di queste linee consente la visualizzazione tramite microscopia fluorescente e la purificazione cellulare citometricaa flusso 13. Abbiamo esaminato le squame dopo la biopsia, generando immagini ad alta risoluzione dei linfociti nelle squame, identificando l'espressione genica dei linfociti epidermici tramite qRT-PCR, confrontandola con quella dei linfociti di altri tessuti linfoidi dello stesso pesce e quantificando i linfociti per squama tramite citometria di flusso e selezione cellulare attivata dalla fluorescenza. In sintesi, il protocollo descrive un metodo semplice e pratico per ottenere linfociti da pesci zebra vivi, incluso il campionamento longitudinale di singoli animali su più punti temporali in una sequenza sperimentale. Questo metodo è pensato per studiare la biologia dei linfociti del pesce zebra, la progressione della leucemia, le risposte farmacologiche o altri disegni sperimentali longitudinali che richiedono campionamenti ripetuti su singoli pesci zebra. Abbiamo sviluppato il protocollo utilizzando pesci zebra transgenici adulti con popolazioni di linfociti marcate fluorescenti e lo abbiamo validato per applicazioni a valle, inclusi microscopia a fluorescenza, citometria a flusso/selezione cellulare attivata dalla fluorescenza, analisi dell'espressione RNA e altri studi ex vivo che richiedono linfociti vitali.

Protocollo

Tutte le procedure animali sono state approvate dal Comitato per la Cura e l'Uso Istituzionale degli Animali del Centro di Scienze della Salute dell'Università dell'Oklahoma (protocolli 24-028-EAH e 25-068-EHUNIR). Questo protocollo propone un approccio per isolare e analizzare linfociti normali e/o maligni dalle scaglie di pesci zebra vivi, con dettagli sullo scopo, l'esecuzione e i principi alla base di queste procedure.

ATTENZIONE: MS-222 è un anestetico chimico pericoloso e deve essere maneggiato con dispositivi di protezione individuale (DPI) appropriati, come guanti da laboratorio, protezione per gli occhi e camice da laboratorio. Smaltire le soluzioni MS-222 in conformità con le linee guida istituzionali sui rifiuti chimici. Fai attenzione quando maneggi aghi e forze per prevenire ferite da tagliente. Considerare tutti i campioni biologici potenzialmente biohazardi e smaltire i rifiuti in conformità con le procedure istituzionali di biosicurezza.

1. Preparazione dei mezzi di smistamento

  1. Integrare 1× soluzione di substrato RPMI 1640 con siero fetale bovino (FBS) all'1% e 1% di penicillina/streptomicina.
    NOTA: I mezzi RPMI 1640 mantengono la vitalità dei linfociti ex vivo. RPMI 1640 può essere sostituito con un PBS 0,9×. Il siero bovino fetale (FBS) fornisce fattori di crescita per promuovere la vitalità cellulare. Penicillina e streptomicina limitano la contaminazione batterica.
  2. Mezzi aliquoti in tubi microcentrifughe da 1,5 mL in volumi da 500 μL, con ogni tubo destinato a scale da 10 a 20 secondi. Continua a selezionare i tubi del mezzo sul ghiaccio.

2. Anestesia dei pesci zebra, screening microscopico a fluorescenza e imaging

  1. Anestesiare D. rerio con metanasolfatto di tricaina (MS-222) tamponato allo 0,02% preparato secondo le linee guida istituzionali per la cura degli animali utilizzando acqua del sistema ittico.
  2. Una volta sedato, si colloca delicatamente il pesce in una tavola di coltura cellulare con sufficiente acqua di sistema (più 0,02% di MS-222) per mantenere l'umidità durante la successiva manipolazione.
  3. Esaminare e fotografare i pesci anestetizzati utilizzando un microscopio epifluorescente per rilevare la fluorescenza del/i transgene/i. Questo passaggio identifica le bilance fluorescenti per la biopsia.
    NOTA: Le linee prive di transgeni fluorescenti possono essere osservate tramite microscopia luminosa standard.
  4. Usa la fluorescenza per identificare le cellule T (lck:GFP o lck:mPesci ciliegia) o T-ALL (rag2:hMYC + lck:GFP o lck:mPesci ciliegia). Le cellule della linea T sono luminosamente fluorescenti in queste linee; Le cellule B-ALL sono debolmente fluorescenti nei fondi lck:GFP e lck:mCherry 13,15,21.
  5. Selezionare i pesci etichettati con la linea B cd79a:GFP o cd79b:GFP (con o senza rag2:hMYC) per le cellule B epidermiche e/o B-ALL, utilizzando GFP per selezionare le squame da biopsia.
  6. Esercitati a posizionare i pesci zebra e regolare le impostazioni del microscopio prima della biopsia, se si desidera l'imaging
    NOTA: L'imaging e la biopsia richiedono 5–7 minuti di sedazione tramite MS-222 allo 0,02%. Monitorare continuamente i movimenti opercolare. Se il movimento opercolare rallenta notevolmente o si ferma, trasferire immediatamente il pesce in un sistema di acqua privo di anestetici e interrompere la biopsia. Riapplicare ~50–100 μL di acqua di pesce contenente anestetico su pelle, opercolo e branchie ogni 1–2 minuti durante l'imaging e la biopsia per mantenere l'umidità superficiale.

3. Raccolta e preparazione delle scale

  1. Per posizionare il pesce per la biopsia, posiziona il pesce sedato su un fianco in un piatto di coltura cellulare.
  2. Per evitare che il pesce scivoli durante la biopsia, usa una spugna umida con un taglio lineare o a V e mettila nella piastra di coltura cellulare per cullare il pesce.
  3. In alternativa, assicurati che il livello dell'acqua del sistema copra a malapena il fondo della ciotola di coltura cellulare (abbastanza da mantenere la superficie umida) per permettere alla tensione superficiale di stabilizzare il pesce.
  4. Applicare periodicamente ~50–100 μL di MS-222 allo 0,02% preparato in acqua di sistema sull'opercolo e sulle branchie per mantenere l'umidità e sostenere l'anestesia durante l'imaging e la biopsia.
  5. Eseguire una biopsia tramite microscopia a epifluorescenza per selezionare squame altamente fluorescenti arricchite da linfociti o cellule ALL.
  6. Raccogli 10–20 squame adiacenti da una singola regione altamente fluorescente, preferibilmente all'interno della prima o seconda striscia pigmentata orizzontale.
    NOTA: Una sola scala è generalmente sufficiente per l'imaging. Una raccolta di 10–20 squame produce tipicamente >1.000 linfociti da pesci WT ed è raccomandata per analisi a valle come la citometria di flusso e la qRT-PCR.
  7. Mano dominante (ago): Usa un ago per siringa calibro 31, posiziona delicatamente la punta dell'ago sotto il bordo posteriore di una scala e giralo in avanti (cioè cefalad). Usa un ago sterile diverso per ogni pesce. Pulire le pinze tra i pesci; sterilizza se richiesto dalle procedure istituzionali.
    NOTA: Sollevare la scala con un ago è preferibile all'uso solo delle pinze, poiché solleva la scala per minimizzare la raschiatura superficiale. Questo garantisce che lo strato epidermico delicato sotto la coccina rimanga aderente alla superficie della squama, fondamentale per massimizzare la resa cellulare.
  8. Mano non dominante (pinze): Tenendo la bilancia in posizione ribaltata in avanti con l'ago, afferra la superficie esterna rigida della bilancia con la pinza. Con un movimento fluido, estrai la bilancia dalla tasca.
    NOTA: Può verificarsi un lieve sanguinamento nei siti di estrazione delle squame, che è tipicamente autolimitato.
  9. Se si verifica un sanguinamento eccessivo, applica una pressione delicata con la pinza e risciacqua brevemente con lo 0,02% di MS-222 nell'acqua del sistema.
    NOTA: L'emostasi può essere raggiunta in pochi secondi prima di passare alla scala successiva.
  10. Per biopsiare più squame, raccogliere 10–20 squame per pesce, rimuovendo le squame adiacenti da una regione contigua in una striscia pigmentata orizzontale, invece che su più regioni del corpo o su entrambi i lati dell'animale.
  11. Strappare le singole squame in sequenza e tenerle sulle punte della pinza durante la raccolta con la superficie mediale rivolta verso l'alto.
  12. Per evitare interferenze delle scaglie accumulate con la successiva rimozione delle scaglie, si inclina prima in avanti ogni scaglia e poi afferrala dal bordo posteriore. Trasferire le bilance in un tubo contenente mezzi di selezione dopo ogni 5 squame, o ogni volta che ulteriori squame non possono essere trattenute in modo sicuro sulle punte della pinza.
  13. Dopo la raccolta delle squame, processare i campioni il più rapidamente possibile. Trasferire immediatamente le squame dalle pinze in tubi da 1,5 mL contenenti 500 μL di mezzo di selezione fredda su ghiaccio per preservare la vitalità cellulare. Decontaminare le pinze tra i pesci usando etanolo al 70% prima di raccogliere i campioni successivi. Processare le scaglie di ciascun pesce in tubi separati durante la raccolta, la dissociazione e per le analisi a valle.
  14. Dopo la raccolta delle scaglie, trasferire immediatamente il pesce in una vasca di recupero con acqua di sistema dolce senza MS-222.
  15. Monitorare i movimenti opercolari e il comportamento di nuoto fino a quando la respirazione e la postura normali non saranno ristabilite. Osservare il sito della biopsia per eventuali sanguinamenti persistenti o segni di disagio prima di rimettere il pesce nel sistema di ricircolazione.
  16. Riportare il pesce nella sua vasca di origine dopo il normale equilibrio e la ripresa del nuoto.

4. Dissociazione cellulare e filtraggio

  1. Controlla le squame sul fondo del tubo. Le scaglie sono facilmente visibili a occhio nudo prima della dissociazione. Dissociare le squame utilizzando un omogeneizzatore di pestell a microtubi in plastica sterile, applicando una pressione manuale delicata e controllata per 30–60 secondi.
  2. Utilizzare movimenti lenti di rotazione e su e giù per liberare le cellule epidermiche evitando un eccessivo taglio delle squame.
  3. Continua la dissociazione finché i media di smistamento non diventano visibilmente torbidi.
    NOTA: Il successo della procedura è indicato dal fatto che il substrato diventa torbido, indicando un'alta concentrazione di cellule liberate in sospensione.
  4. Far passare campioni omogeneizzati attraverso un filtro a rete di nylon da 35 μm per rimuovere i detriti e generare sospensioni a singola per citometria a flusso/selezione cellulare attivata dalla fluorescenza.
  5. Se sono presenti aggregati cellulari visibili dopo la filtrazione iniziale, si passa nuovamente il campione attraverso un nuovo filtro a rete a 35 μm immediatamente prima dell'analisi citometrica del flusso. Ripeti la filtrazione non più di 2 volte per minimizzare la perdita cellulare.

5. Analisi citometrica a flusso

  1. Analizza i campioni tramite citometria a flusso.
    NOTA: La citometria a flusso può essere eseguita prima della purificazione cellulare attivata dalla fluorescenza o dell'estrazione di RNA per valutare la composizione del campione.
  2. Analizzare sospensioni a singola cellula utilizzando un citometro a flusso equipaggiato con un laser da 488 nm per il rilevamento GFP e un laser a 561 nm per il rilevamento mCherry.
  3. Escludere i detriti utilizzando i parametri di scatter diretto (FSC) e side scatter (SSC). Identificare i linfociti utilizzando la porta linfociticaprecedentemente descritta 10,13,21.
  4. Escludere gli aggregati cellulari tramite il passaggio a singolo (cioè area SSC [SSC-A] rispetto all'altezza SSC [SSC-H]).
  5. Valuta la vitalità cellulare usando propidio ioduro (PI) o un colorante vivo/morto equivalente. Escludere le cellule PI-positive dalle analisi e procedure di selezione successive.
  6. Stabilire porte di fluorescenza utilizzando controlli zebrafish non transgenici e controlli transgenici fluorescenti monocolore. Definire le popolazioni GFP-positive e mCherry-positive rispetto ai controlli negativi.
  7. Esportare file standard di citometria a flusso (FCS) e analizzare i dati utilizzando software di analisi della citometria a flusso.

6. Selezione cellulare attivata dalla fluorescenza

  1. Per ordinare le celle, si utilizza un sistema di selezione cellulare attivato dalla fluorescenza dotato di laser da 488 nm e/o 561 nm per il rilevamento di GFP e mCherry.
  2. Linfociti a gate sequenziali (FSC/SSC), singoletti (SSC-A contro SSC-H) e cellule vitali (PI-negative) prima della selezione basata sulla fluorescenza.
  3. Definire le popolazioni diGFP lo, GFPhi e mCherry-positive utilizzando porte di fluorescenza stabilite da campioni di controllo negativi.
  4. Classifica le popolazioni diGFP lo, GFPhi e mCherry-positive in tubetti di raccolta contenenti mezzi di selezione raffreddati.
    NOTA: In questo lavoro con la linea lck:GFP, le cellule ad alta GFP (GFP hi) e bassa a GFP (GFPlo) sono linee linfocitarie distinte, come descrittoin precedenza 10,13,15,21.
  5. Mantenere i campioni smistati sul ghiaccio e procedere immediatamente alle applicazioni a valle, come l'isolamento dell'RNA.

Risultati

Seguendo i passaggi sopra, abbiamo anestesiato e selezionato il pesce zebra adulto per linfociti fluorescenti o ALL tramite microscopia. I pesci wild-type (WT) lck:GFP hanno mostrato fluorescenza principalmente nella regione timica, mentre i pesci cd79b:GFP hanno mostrato fluorescenza nella regione testa/branchia, coerente con le osservazioniprecedenti 10 (Figura 1A, a sinistra). Al contrario, i pesci rag2:hMYC doppio transgenico; lck:GFP/lck:mPesci ciliegia con T-ALL o rag2:hMYC + cd79b:GFP con B-ALL hanno mostrato una fluorescenza brillante e disseminata in tutto il corpo (Figura 1A, a destra), che consente molte squame ad alta fluorescenza per la biopsia.

Dopo la rimozione, le squame rimanevano intatti, con tessuto epidermico aderente alle loro superfici. L'imaging convenzionale e confocale delle scaglie montate ha rivelato linfociti GFP+ sparsi nell'epidermide delle scaglie WT lck:GFP e cd79b:GFP , mentre i pesci con leucemia ospitavano frequentemente gruppi densi o fogli confluenti di cellule GFP+/mCherry+ su superfici delle scaglie (Figura 1B). Per convalidare le morfologie linfoidi delle cellule recuperate dalle squame, è stata effettuata una colorazione Wright-Giemsa su cellule prelevate da diversi siti anatomici di un pesce WT lck:GFP . I linfociti derivati dalla squama mostravano morfologie simili a quelle dei linfociti provenienti da timo, midollo e sangue, inclusi alti rapporti nucleari-citoplasmatici e nuclei densamente colorati (Figura 1C, in alto). La colorazione Wright-Giemsa di una squama di un pesce con T-ALL ha ulteriormente dimostrato molte cellule di aspetto linfoblastico vicino alla superficie della scaglia (Figura 1C, in fondo). Questi risultati morfologici corroborano i dati della microscopia di fluorescenza e confermano che accumuli densi di cellule fluorescenti su scale T-ALL sono composte da linfoblasti. Questi risultati microscopici forniscono una lettura qualitativa, con conferma morfologica che le squame contengono linfociti epidermici (o linfoblasti leucemici) disponibili per la dissociazione delle squame. I pesci WT doppiamente transgenici lck:mCherry + cd79a:GFP hanno permesso la visualizzazione simultanea delle cellule della linea T mCherry+ e della linea G B (Figura 1D, 1E).

Per analisi di citometria a flusso e selezione cellulare attivata dalla fluorescenza, le squame sono state dissociate e filtrate per generare sospensioni a singola cellula. La porta linfoide è stataidentificata 10,25 e filtrata per linfociti/blast tramite scatter diretto e dispersione laterale. La colorazione con propidio ioduro (PI) ha dimostrato che la maggior parte delle cellule all'interno della porta linfoide è rimasta vitale dopo la dissociazione e l'elaborazione delle squame, con una vitalità media del ~92% (n = 16 pesci). Le porte di fluorescenza sono state stabilite utilizzando controlli non transgenici negativi al fluoroforo e linee transgeniche GFP+ e mCherry+ (Figura 2A). Nelle squame WT lck:GFP (cioè pesci privi di rag2:hMYC), la maggior parte delle cellule fluorescenti eraGFP lo (Figura 2B, pannello superiore), mentre le scaglie di pesci rag2:hMYC + lck:GFP con T-ALL contenevano popolazioni prominenti diGFP hi, compatibili con linfoblasti maligni (Figura 2B, pannello centrale). Le scale etichettate con la linea B cd79b:GFP hanno prodotto sia popolazioniGFP lo cheGFP hi (Figura 2B, pannello inferiore), permettendo l'isolamento di sottoinsiemi distinti della linea B.

Per validare l'identità della linea di discrezione delle cellule fluorescenti dalle squame, le celluleGFP lo dalle squame WT lck:GFP, le celluleGFP Hi dalle squame t-all rag2:hMYC + lck:GFP e le cellule GFP+ dalle squame cd79b:GFP sono state purificate con selezione cellulare attivata dalla fluorescenza, estratto RNA e poi analizzato tramite qRT-PCR. Le cellule delle scale cd79b:GFP hanno espresso i trascrizioni della linea B (pax5, cd79b, ighm e ighz; Figura 2C, pannello superiore), mentre le cellule in scala lck:GFP esprimevano geni di linea T (cd4, cd8 e lck; Figura 2C, pannello centrale), coerente con i nostri profili precedenti di linfociti epidermici da pesce zebra ottenuti tramite biopsia a squama, dove le cellule T della scala WT hanno espresso più cd4 di cd8-10. Le cellule della scala T-ALL hanno espresso trascrizioni della linea T con maggiore espressione rag2 rispetto alle cellule a scala non leucemiche (Figura 2C, pannello inferiore), coerenti con la loro identità linfoloblastica. Le cellule T-ALL hanno inoltre espresso livelli quasi uguali di cd4 e cd8, coerenti con il loro stato di linfoblasta T doppiamente positiva e immatura.

Per determinare se le cellule ALL a scala siano rappresentative delle cellule tumorali presenti altrove nell'animale, abbiamo confrontato i linfociti purificati a flusso citometrico cellulare da scaglie o tessuti corporei dello stesso pesce, analizzandoli tramite qRT-PCR. Le cellule GFP+ provenienti da squame o tessuto corporeo di pesci rag2:hMYC + lck:GFP T-ALL hanno mostrato profili di espressione genica quasi identici, con maggiore espressione dei geni delle cellule T (cd4, lck), geni arricchiti da linfoblasti (rag1, rag2) e dell'oncogene hMYC rispetto ai geni delle cellule B (pax5, ighm, ighz) (Figura 2D). Nel complesso, questi dati e il nostro lavoro precedentesupportano l'uso di biopsie a scala per raccogliere cellule non maligne e TUTTE per studi a valle. Per valutare l'idoneità delle cellule leucemiche derivate dalla scala per analisi molecolari a valle, l'RNA è stato isolato da cellule T-ALL derivate da corpo e scala abbinate dopo la purificazione cellulare citometrica a flusso. Dopo aver selezionato 50.000 cellulehi-GFP , i campioni di T-ALL derivati dalla scala hanno prodotto una resa media di RNA di ~82 ng, rispetto a ~106 ng delle cellule T-ALL derivate dal corpo (n = 4 pesci). Nonostante la resa leggermente inferiore dai campioni derivati dalla scala, l'amplificazione efficace di trascrizioni associate a lineage e leucemia tramite qRT-PCR ha dimostrato che l'RNA derivato dalla scala è adatto per analisi di espressione genica a valle.

Le biopsie di pesci non leucemici hanno tipicamente prodotto 50–65 linfociti fluorescenti per squama (Figura 3), permettendo la raccolta di >1.000 linfociti da 20 squame, sufficiente per l'analisi citometrica a flusso e per analisi di espressione mirata. Nei pesci con ALL, le rese erano drammaticamente superiori, con le scaglie T-ALL contenenti ~20.000cellule hi /squama di GFP (WT lck:GFP i pesci avevano ~65 cellule/squama; Figura 3, in alto). B-ALL da rag2:hMYC + cd79b:squame GFP ospitavano ~4.000 celle GFP+ per squama (WT cd79b:I pesci GFP avevano ~50 celle GFP+ per squama; Figura 3, in fondo). Il gran numero di cellule recuperabili da pesci con ALL fornisce una base pratica per campionare longitudinalmente le cellule ALL di singoli pesci in più momenti temporali. A supporto della fattibilità di campionamenti ripetuti, tutti i 24 pesci zebra in uno studio longitudinale precedente sono sopravvissuti alle biopsie seriali, cosa rara, e le biopsie sono state controllate ed eseguite ripetutamente sullo stesso lato per due settimanee dieci. Inoltre, analisi longitudinali su otto pesci hanno mostrato recupero di squame, linfociti a scaglie e fluorescenza nel sito della biopsia entro 10 giorni dal campionamento. Questi risultati suggeriscono che un intervallo di 10 giorni sia sufficiente per il campionamento ripetuto dello stesso sito della biopsia. Collettivamente, questi risultati supportano la capacità rigenerativa delle squame biopsiate e stabiliscono la biopsia a squame come approccio pratico per studi longitudinali su pesci zebra vivi.

Gli esiti subottimali sono spesso caratterizzati da un basso recupero cellulare e da un eccesso di detriti nei campioni di biopsia. Un basso recupero può verificarsi se le squame vengono raccolte da aree corporee a bassa fluorescenza o se l'epidermide viene accidentalmente smembrata durante l'estrazione della squama. Per evitare ciò, facciamo avanti la bilancia (cefalad) prima della rimozione delle pinze. La rimozione delle squame da regioni contigue altamente fluorescenti sembra anche migliorare la ressa. Per quanto riguarda l'eccesso di detriti, un'omogeneizzazione aggressiva può aumentare il taglio cellulare, riducendo il numero di cellule disponibili per la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza o per la citometria a flusso. Dissociarsi dolcemente finché non rimane più visibilmente attaccata l'epidermide ai frammenti di squame, seguita da una filtrazione attraverso una rete da 35 μm, generalmente si ottiene una sospensione unicellulare adatta. La scarsa vitalità è più spesso associata a un processo prolungato o a un'eccessiva dissociazione meccanica; pertanto, le squame dovrebbero essere trasferite immediatamente in un mezzo di selezione gelato e processate tempestivamente. L'aggregazione cellulare può interferire con l'analisi citometrica e l'ordinamento del flusso citometrico, ma può essere minimizzata tramite filtrazioni ripetute attraverso una rete da 35 μm immediatamente prima dell'analisi. Il sanguinamento persistente nei siti della biopsia è raro e può essere controllato applicando pressione con la pinza e risciacquando con una soluzione contenente anestetico. Segnali di fluorescenza deboli possono derivare da scaglie di campionamento al di fuori delle regioni arricchite con linfociti fluorescenti/cellule ALL; Pertanto, si raccomanda l'imaging fluorescente dell'intero pesce prima della biopsia per identificare le regioni di campionamento ottimali.

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Figura 1: Microscopia a fluorescenza e immagini confocali della linea T (tipo selvatico [WT] lck:GFP, leucemia linfoblastica acuta a cellule T [T-ALL] lck:GFP + rag2:hMYC, e T-ALL lck:mCherry + rag2:hMYC), linea B (WT cd79b: GFP e leucemia linfoblastica acuta a cellule B [B-ALL] cd79b:GFP + rag2:hMYC), e doppia linea (WT lck:mCherry; cd79a:GFP) etichettato come pesci transgenici e scaglie. (A) Immagini in campo luminoso (fila superiore) e fluorescente (fila inferiore) di pesci zebra adulti da linee WT etichettate con linea T (lck:GFP) e linee WT (cd79b:GFP), e esempi di pesci T-ALL (lck:GFP o lck:mCherry + rag2:hMYC) e B-ALL (cd79b:GFP + rag2:hMYC). Il cerchio giallo indica la regione timica. Squame, 2 mm. (B) Scale rappresentative per ogni genotipo. Riga superiore: immagini in campo chiaro; Riga centrale: immagini microscopiche fluorescenti delle cellule GFP+/mCherry+ in epidermide in scala. Riga inferiore: immagini confocali di regioni in scatola nella fila centrale che mostrano singoli linfociti nelle scaglie WT e cluster/fogli cellulari in TUTTE le scale. Barre di scala, 200 μm (file a campo chiaro e a basso ingrandimento) e 20 μm (fila ad alto ingrandimento). (C) Immagini colorate con Wright-Giemsa di cellule ottenute da timo, midollo, squame e sangue di un pesce zebra WT lck:GFP e immagini a squame colorate con Wright-Giemsa ottenute da un pesce zebra T-ALL (lck:GFP + rag2:hMYC). I quattro pannelli principali sotto lck:GFP: immagini ad alto ingrandimento di cellule colorate da organi linfoidi dello stesso pesce zebra. Pannello superiore sotto T-ALL: immagine a basso ingrandimento di una scala colorata che mostra cellule aderenti. Pannello inferiore sotto T-ALL: immagine ad ingrandimento più elevato della regione in scatola nel pannello superiore che mostra cellule di aspetto linfoblasto con alti rapporti nucleari-citoplasmatici e nuclei densamente colorati. Barre di scala: 10 μm (in alto, immagini individuali dei linfociti), 200 μm (centro; basso ingrandimento) e 20 μm (inferiore; alto ingrandimento). (D) immagini Brightfield (BF), GFP, mCherry e unite di WT adulto doppio transgenico lck:mCherry; cd79a: Pesce zebra GFP . (E) immagini di campo brillante, GFP, mCherry e immagini unite di una squama dello stesso pesce, dimostrando simultaneamente cellule mCherry+ della linea T e celle GFP+ della linea B. Barra in scala, 2 mm in (D) e 200 μm in (E). Le immagini di fluorescenza sono state acquisite utilizzando le stesse impostazioni di esposizione su tutti i canali, tranne che nel pannello E, dove sono state regolate per facilitare la visualizzazione simultanea sia dei segnali GFP che di quelli mCherry. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Citometria a flusso e qRT-PCR dei linfociti a squama e confronto tra cellule ALL corporee e squame. (A) Esempio di flusso di lavoro di citometria a flusso che mostra i linfoidi (scatter diretto, FSC; scatter laterale, SSC) ele porte hi-gate di GFP⁻,GFP lo e GFP delle cellule da una scala lck:GFP. (B) Esempio di immagini fluorescenti (a sinistra) e istogrammi GFP di celle di squame (destra) da WT lck:GFP (in alto), T-ALL lck:GFP + rag2:hMYC pesce (centro), e WT cd79b:GFP (pesce di fondo). Il cerchio giallo indica la regione timica. Squame, 2 mm. (C) qRT-PCR di cellule sterilizzate a fluorescenza con selezione delle cellule purificate della squama GFP+ per lineage B specifico per lineage e stadio (pax5, cd79b, ighm, ighz; superiore), linea T (cd4, cd8, lck; centro) e trascrizioni arricchite da linfoblasti (igic1s1, rag2; in basso). (D) qRT-PCR di linfociti derivati dal corpo e dalla scala abbinati isolati dallo stesso T-ALL lck:GFP + rag2:hMYC pesce zebra (n = 2). L'espressione di geni delle cellule B (pax5, ighm, ighz), cellule T (cd4, lck) e arricchiti da linfoblasti (igic1s1, rag1, rag2), oltre a hMYC, viene mostrata per campioni corporei e su scala. Il metodo 2-ΔCt (ΔCt = Ct_experimental − Ct_housekeeping) è stato utilizzato per calcolare l'espressione rispetto ai due geni di mantenimento: eef1a1l1 (ef1a) e rpl13a. Risultati mostrati come media ± SD Ogni gruppo rappresenta dati provenienti da due repliche biologiche. I dati nei pannelli C e D sono illustrazioni descrittive che dimostrano schemi di espressione genica specifici per lineage. I confronti corpo-scala non sono stati testati statisticamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Le scale di D. rerio con ALL rendono linfociti nettamente più alti. Alto: Cellule fluorescenti per scala da tipo selvatico (WT) lck:GFP (GFP lo) e leucemia linfoblastica acuta a cellule T (T-ALL) lck:GFP; rag2:hMYC e cd79b:GFP; rag2:hMYC(GFP hi) pesce. In basso: Cellule fluorescenti per scala da WT cd79b:GFP e leucemia linfoblastica acuta a cellule B (B-ALL) cd79b:GFP; rag2:pesce hMYC . Ogni punto rappresenta una scala. Le scaglie sono state raccolte da due pesci per ogni gruppo (gruppi di linea T: n = 10 scaglie totali, 5 scaglie per pesce; Gruppi di linea B: n = 8 scaglie in totale, 4 scaglie per pesce). I simboli indicano scaglie raccolte da diversi pesci. Le barre riflettono i mezzi di gruppo con SD (deviazione standard). Questi dati rappresentano esempi di rese di linfociti fluorescenti recuperati da scaglie di pesci non leucemici e leucemici. Molte scaglie derivano dagli stessi pesci e possono essere considerate repliche tecniche piuttosto che biologiche. Non sono stati effettuati confronti statistici perché abbiamo selezionato in modo non casuale le scale ALL più brillanti per la biopsia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Questo protocollo descrive un metodo di biopsia a scala non letale per la raccolta dei linfociti epidermici dei pesci zebra, inclusi sia linfociti non maligni sia cellule di leucemia linfoblastica acuta (ALL). I pesci zebra sono modelli ben consolidati per la linfopoiesi e le neoplasie linfoide, ma la maggior parte degli approcci per ottenere linfociti richiede l'eutanasia e le dissezione dei tessuti, impedendo studi longitudinali su singoli animali 8,10,13,15. Le scaglie offrono un compartimento epiteliale sperimentalmente accessibile con abbondanti linfociti, e possono essere campionate ripetutamente poiché gli adulti di pesce zebra hanno centinaia di scaglie che si rigenerano rapidamente dopo larimozione 10,24. Pertanto, le biopsie a scala sono una strategia pratica per monitorare serialmente i linfociti (come il carico leucemico) e generare sospensioni a singola cellula per test a valle senza sopportare animali sperimentali.

Diversi passaggi sono fondamentali per ottenere recuperi cellulari ad alto livello riproducibile. Innanzitutto, un'adeguata anestesia e il mantenimento dell'umidità superficiale durante l'imaging e la biopsia (0,02% MS-222 nell'acqua del sistema) riducono lo stress e limitano l'asciugatura. In secondo luogo, raccogliere 10–20 squame adiacenti da una singola striscia pigmentata migliora la riproducibilità e minimizza la variabilità regionale. Terzo, girare le squame in avanti (cefalade) prima dell'estrazione e trasferirle immediatamente in mezzi di selezione gelidi preserva la vitalità del tessuto epidermico e dei linfociti. Sebbene i linfociti a squame mostrassero un'elevata vitalità e siano stati convalidati per saggi endpoint come microscopia, citometria a flusso/selezione cellulare attivata dalla fluorescenza e qRT-PCR, la durata massima per cui le squame possono rimanere sul ghiaccio e la loro idoneità per la coltura ex vivo a lungo termine non sono state esaminate e giustificano studi futuri. Infine, la dissociazione deve essere sufficientemente forte da spostare le cellule epidermiche, ma non così aggressiva da polverizzare la matrice di squame, aumentando così i detriti e compromettendo la classificazione citometrica del flusso. Nonostante queste precauzioni, la procedura probabilmente recupera solo un sottoinsieme dei linfociti presenti in ciascuna squama, poiché la microscopia delle scaglie (Figura 1B) mostra che ogni squama contiene molte più delle 50–65 cellule fluorescenti che possiamo rilevare tramite citometria di flusso/selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (Figura 3). Non abbiamo testato la tripsinizzazione o altri metodi di digestione per liberare le cellule dalle squame, e tali o altre modifiche al protocollo potrebbero potenzialmente aumentare ulteriormente la resa cellulare. Tuttavia, questo metodo fornisce una tecnica semplice per raccogliere >1.000 linfociti da pesci WT e decine o centinaia di migliaia di cellule maligne da pesci con ALL disseminata.

Il nostro metodo può essere facilmente adattato ad altri piani sperimentali e a background transgenici. Le linee marcate fluorescenti permettono sia letture basate su microscopia sia la selezione e purificazione cellulare attivata dalla fluorescenza di diversi tipi cellulari, come i sottoinsiemiGFP lo vs.GFP hi . Se è necessario un campionamento longitudinale, si possono raccogliere squame da fianchi alternativi attraverso punti temporali per consentire la ricrescita delle scaglie e ridurre l'infiammazione, cosa che abbiamo precedentemente implementato per campionare serialmente le scaglie dei pesci trattati condesametasone 10. Sebbene il presente studio si sia concentrato sui linfociti, l'epitelio a squame contiene ulteriori popolazioni di cellule immunitarie, inclusi macrofagi eneutrofili 11, che potrebbero essere anch'essi idonee a essere investigate con questo approccio.

I limiti della biopsia dovrebbero essere considerati nella progettazione sperimentale. Nei pesci WT, il numero di linfociti per squama è modesto (<100 cellule per squama), il che può essere insufficiente per alcuni saggi a meno che non si utilizzino molte scaglie e/o piùpesci 10. Inoltre, la biopsia disturba l'epidermide e può causare infiammazione o rimodellamento dei tessuti; Pertanto, gli studi di campionamento seriale dovrebbero includere controlli per biopsia trattati simulatamente e, quando possibile, la separazione spaziale dei siti. Nei pesci con ALL, le scaglie offrono una fonte comoda e arricchita di cellule maligne. Tuttavia, i ricercatori dovrebbero considerare che il carico di malattia può variare a seconda delle regioni del corpo e nel tempo. Raccomandiamo l'imaging a fluorescenza dell'intero pesce prima della biopsia per identificare le regioni di campionamento rappresentative e minimizzare il potenziale bias di campionamento. Un limite di questo studio è che non sono stati effettuati confronti tra cellule B normali e maligne derivate dalla scala e dal corpo. Questo protocollo dimostra un recupero efficiente delle cellule della linea B da squame, ma una valutazione più completa delle popolazioni cellulari della linea B in più siti anatomici è giustificata in uno studio futuro dedicato. Il numero di scaglie che possono essere raccolte dipende anche dalla dimensione dell'animale e dallo stadio di sviluppo. Abbiamo sviluppato il protocollo attuale utilizzando pesci adulti di età compresa tra 4 e 12 mesi, che hanno centinaia di scaglie e tollerano facilmente la raccolta di 10–20 scaglie da una singola regione corporea. Quando si utilizzano pesci più piccoli o giovanili, gli investigatori potrebbero dover ridurre il numero di scaglie raccolte. Secondo la nostra esperienza, le biopsie a scala ripetuta sono bentollerate 10, ma studi futuri dovrebbero valutare in modo più sistematico i potenziali eventi associati alla procedura. Gli endpoint rilevanti potrebbero includere livelli di cortisolo, comportamenti di recupero (ad esempio, nuoto anomalo o alimentazione alterata) e infiammazione locale (ad esempio, infezione) nei siti della biopsia.

Nonostante queste considerazioni, il metodo della biopsia su scala amplia le opzioni sperimentali nell'immunologia dei pesci zebra e nella ricerca sulla leucemia. Questo approccio consente la raccolta minimamente invasiva di linfociti vitali per citometria, selezione cellulare attivata dalla fluorescenza, analisi dell'espressione, saggi funzionali e altre applicazioni. Le biopsie possono essere integrate negli studi di risposta farmacologica e in altri progetti di studiolongitudinali 10. Permettendo campionamenti ripetuti dallo stesso animale, questo metodo può ridurre l'uso animale, migliorare la potenza statistica per i confronti all'interno del soggetto e facilitare studi risolti nel tempo sia dell'immunità epidermica normale sia della biologia dei linfociti maligni.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse finanziari.

Ringraziamenti

Ringraziamo Ameera Hasan, M.B.B.S., Ph.D., e Brashé Wood per i loro contributi a questo progetto. Gli studi sono stati supportati dal programma pilota di sovvenzioni del Centro Oncologico Stephenson dell'OUHSC, dall'Oklahoma Center for Adult Stem Cell Research (OCASCR), dai programmi di team Science e Seed Grant della Presbyterian Health Foundation e dalla W.J. Jones Family Foundation. Il FACS del Core di Ricerca in Biologia Molecolare e Citometria del Stephenson Cancer Center dell'OUHSC è stato finanziato dal NCI Cancer Center Support Grant Award P30 CA225520. Questo studio è stato finanziato in parte da fondi dell'American Cancer Society (ACS-POST-BACC-23-1156971-01-DPBACC). Iman Owens è una borsista del programma "STRONG" post-laurea ACS.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Reagenti & Consumabili:
Tricaine metanesulfonato (MS-222)Sigma-AldrichE10521Agente anestetico
Medio RPMI 1640ThermoFisher11875093Media per la vitalità dei linfociti
Siero Bovine FetaleSigma-AldrichF2442Per la vitalità cellulare
Penicillina-StreptomicinaThermoFisher15140122Limitare la contaminazione batterica
Etanolo al 70%ThermoScientificT038181000Per sterilizzare le forbici
CellPro 1x PBSVWR104027-280Diluire a 0,9x con acqua sterile
Propidio IodideInvitrogenP1304MMPDiscriminazione cellule vive/morte per flow/FACS
Cut Goods Misc-Pn; Dimensione: 12 x 12 POL. Carta filtro da 35um
Lab Pak 03-35/16		SefarPer la selezione cellulare
Riferimento: Burroughs-Garcia, J., Hasan, A., Park, G., Borga, C., Frazer, J. K. Isolating malignant and non-malignant b cells from lck:Egfp zebrafish. J Vis Exp. 10.3791/59191 (144), (2019).
Alternativa alla carta filtro: EASYstrainer Cell Sieves, Greiner Bio-OneGreiner89508-342Per la selezione cellulare
Eppendorf® Flex-Tubes® Microtubes, 1,5 mlEppendorf®20901-551microcentrifuga per la selezione cellulare
Siringhe per insulina UltiCare VetRx U-100 da 3/10cc 31G x 5/16" Marca unità mezzaUltiCare9436Per le biopsie su scala
Piatto Petri profondo 100 x 25 mmUSA Scientific8609-0625Per le biopsie su scala
Bel-Art® Pestelli monousoBel-Art® BAF199230001Per la dissociazione su scala
Set di pinzette E-Z Pik 6 pezziAven18480EZPer le biopsie su scala
Vetrini microscodici Corning®, smerigliati su un lato, un'estremitàSigma-AldrichCLS294875X25Per l'imaging
Vetrini di coperturaSigma-AldrichC8181Per l'imaging
SlowFade™ Glass Soft-set Antifade Mountant, con DAPIThermoFisherS36920Per il montaggio delle scale su vetrino
RNeasy Mini Kit Qiagen74104Per l'estrazione di RNA
Attrezzatura:
Microscopio Nikon AZ100 e fotocamera DS-Qi1MCNikonMicroscopio a fluorescenza & fotocamera
Sistema CFX96 Touch-PCRBio-Rad3600037
CytoFLEXBeckman-CoulterAnalisi di citometria a flusso
Leica SP8LeicaMicroscopio confocale
Software:
Software di analisi Kaluza versione 2.1Beckman-CoulterAnalisi di citometria a flusso
Riferimento: https://www.beckman.com/flow-cytometry/software/kaluza/downloads
Software LAS-X versione 3.7.4.23463LeicaMicroscopio confocale
Riferimento: https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/downloads/

Riferimenti

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