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Articolo metodologico

Modelli cellulari per lo studio della malattia di Alexander: analisi funzionale di astrociti primari di ratto

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DOI:

10.3791/72930

⸱

8 settembre 2026

 , 
1Institute of Molecular Medicine, College of Life Sciences and Medicine, National Tsing Hua University, 2School of Medicine, College of Life Sciences and Medicine, National Tsing Hua University

In questo articolo

Sommario

Sviluppiamo un modello di astrociti primari di ratto che fornisce un sistema fisiologicamente rilevante per lo studio della malattia di Alexander (AxD), permettendo l'analisi dell'aggregazione della GFAP, delle modificazioni patologiche e della disfunzione degli astrociti. Questo sistema costituisce un ponte tra studi in vitro e in vivo, offrendo una piattaforma solida per esplorare la patologia dell'AxD e identificare bersagli terapeutici per le malattie neurodegenerative.

Abstract

Gli astrociti svolgono un ruolo fondamentale nel mantenimento dell'omeostasi del sistema nervoso centrale, nel supporto della funzione neuronale e nella risposta a lesioni o malattie. La disfunzione dell'attività astrocitaria è sempre più riconosciuta come un fattore chiave nei disturbi neurodegenerativi, tra cui la malattia di Alexander (AxD), una condizione rara e fatale causata da mutazioni nella proteina acida fibrillare gliale (GFAP). Queste mutazioni provocano l'aggregazione della GFAP, la formazione di fibre di Rosenthal e una progressiva disfunzione astrocitaria. Sebbene i modelli animali in vivo offrano un ambiente cellulare complesso, sia i modelli in vitro che in vivo attuali presentano limitazioni nel replicare accuratamente il contesto cellulare intricato e le funzioni degli astrociti. Per affrontare questa problematica, abbiamo sviluppato un modello cellulare utilizzando astrociti primari di ratto ottenuti da ratti wild-type (WT) e da ratti modello di AxD, al fine di studiare gli effetti funzionali delle mutazioni della GFAP. Questo sistema fisiologicamente rilevante permette un'analisi dettagliata dei meccanismi specifici degli astrociti, inclusi l'aggregazione della GFAP, le risposte allo stress ossidativo e le modificazioni patologiche. Per i ricercatori che non hanno accesso ai ratti modello di AxD, la trasduzione lentivirale offre un metodo alternativo per introdurre mutazioni della GFAP associate all'AxD in astrociti derivati da ratti normali, ampliando così l'applicabilità di questo approccio. Rispetto alle linee cellulari di astrociti immortalizzate o agli studi in vitro che utilizzano proteine ricombinanti, gli astrociti primari conservano meglio l'architettura cellulare e i profili molecolari nativi, fornendo una piattaforma solida per lo studio della dinamica e della solubilità della GFAP e delle risposte astrocitiche a stressori come i danni ossidativi e le modificazioni patologiche. Questo modello cellulare colma il divario tra studi molecolari e sistematici, offrendo un contesto sperimentale controllato per esplorare la disfunzione astrocitaria nell'AxD. Complementando le metodologie esistenti, le colture di astrociti primari migliorano la comprensione della patologia dell'AxD e rappresentano uno strumento prezioso per identificare potenziali bersagli terapeutici nelle malattie neurodegenerative.

Introduzione

Gli astrociti sono cellule gliali specializzate che si estendono in tutto il sistema nervoso centrale (SNC), svolgendo ruoli fondamentali nel mantenimento dell'omeostasi cerebrale, nella regolazione dell'attività neuronale e nella risposta a lesioni o malattie1. Le loro funzioni comprendono la rimozione e il riciclo dei neurotrasmettitori, l'omeostasi degli ioni e dell'acqua extracellulari e il sostegno al funzionamento dei circuiti neurali. Le molecole secreti dagli astrociti sono essenziali per lo sviluppo delle sinapsi e per la plasticità sinaptica nel cervello adulto2. In risposta a lesioni o malattie del SNC, gli astrociti subiscono cambiamenti reattivi che possono mediare segnalazioni pro- o anti-infiammatorie, consentendo funzioni neuroprotettive ma potenzialmente contribuendo a patologie del SNC a seconda del contesto3. La disregolazione della funzione degli astrociti è sempre più riconosciuta come un fattore chiave nella salute e nelle malattie del SNC4,5.

La proteina acida fibrillare gliale (GFAP), una proteina dei filamenti intermedi di tipo III (IF), è un componente citoscheletrico principale degli astrociti, espressa dalla maggior parte, ma non da tutti gli astrociti. La GFAP viene upregolata in risposta a lesioni del sistema nervoso centrale, fungendo da marcatore della gravità del danno tissutale6. Sebbene tradizionalmente associata a ruoli strutturali7, le implicazioni funzionali della GFAP rimangono poco esplorate. Mutazioni nel gene della GFAP causano la malattia di Alexander (AxD)8, una rara patologia neurodegenerativa caratterizzata dall'aggregazione della GFAP, dalla formazione di fibre di Rosenthal e da un progressivo malfunzionamento degli astrociti. Sebbene studi biochimici in vitro9,10,11 e modelli animali in vivo12,13 abbiano fornito informazioni sulla patologia della AxD, questi non riescono a riprodurre il complesso contesto cellulare della funzione astrocitaria14.

Per superare queste limitazioni, abbiamo sviluppato un modello cellulare utilizzando astrociti primari di ratto ottenuti da ratti wild-type (WT) e da ratti modello di AxD13. Questo sistema mantiene l'architettura cellulare e i profili molecolari nativi degli astrociti, permettendo lo studio dell'aggregazione della GFAP, delle risposte allo stress ossidativo e delle modificazioni patologiche associate all'AxD. Per i ricercatori che non hanno accesso ai ratti modello di AxD, la trasduzione lentivirale offre un metodo alternativo per introdurre mutazioni della GFAP associate all'AxD in astrociti derivati da ratti normali10.

Rispetto alle linee cellulari immortalizzate, gli astrociti primari conservano l'eterogeneità e la complessità delle popolazioni di astrociti in vivo, fornendo una piattaforma fisiologicamente rilevante per lo studio di meccanismi specifici degli astrociti15. A differenza degli studi in vitro che utilizzano proteine ricombinanti9, gli astrociti primari esprimono naturalmente la GFAP e altri marcatori specifici degli astrociti, consentendo l'analisi di varianti associate a malattie in un ambiente cellulare nativo10,16,17. Inoltre, gli astrociti primari permettono di indagare le risposte funzionali a stimoli di stress, come i danni ossidativi18 e l'infiammazione19, che risultano difficili da riprodurre in sistemi in vitro semplificati.

Nella ricerca sulle AxD, gli astrociti primari integrano gli approcci biochimici e in vivo colmando il divario tra studi molecolari e sistematici. Mentre i saggi biochimici si concentrano sulle proprietà molecolari delle mutazioni del GFAP, essi mancano di complessità cellulare; al contrario, i modelli in vivo catturano gli effetti sistemici ma sono meno adatti per studi cellulari meccanicistici. Gli astrociti primari forniscono un sistema intermedio dotato di complessità cellulare e controllo sperimentale, in linea con le attuali tendenze nella ricerca sulle malattie neurodegenerative, che enfatizzano l'uso di modelli cellulari per comprendere i meccanismi della malattia e identificare bersagli terapeutici20.

Questo manoscritto descrive lo sviluppo e l'applicazione di astrociti primari di ratto come modello cellulare per la ricerca sulla AxD. Permettendo un confronto diretto tra astrociti WT e astrociti AxD, questo approccio supera importanti limitazioni delle tecniche alternative e aumenta l'accessibilità tramite trasduzione lentivirale. Questi risultati contribuiscono a una comprensione più approfondita della disfunzione astrogliale nella AxD e offrono uno strumento prezioso per promuovere scoperte terapeutiche nelle malattie neurodegenerative.

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Protocollo

Gli animali utilizzati in questo protocollo sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali da laboratorio del College of Life Sciences and Medicine della National Tsing Hua University (NTHU IACUC Approvazione n. 109088 e 111060) e sono conformi alle linee guida dell'Agriculture Guidebook for the Care and Use of Laboratory Animals.

1. Preparazione di terreni, coprislip, piatti e piastre 

  1. Prima di iniziare, assicurarsi che le seguenti soluzioni (Tabella 1) siano state preparate e siano pronte per l'uso.
  2. Sterilizzare forbici e pinze mediante autoclave prima dell'uso per garantire la sterilità.
  3. Preparare la soluzione di poli-L-lisina (PLL) a 0,02 mg/mL in tampone di acido borico.
  4. Aggiungere una quantità sufficiente di soluzione di PLL per coprire completamente la superficie del coprivetrino o del fondo della piastra/dish da coltura. Assicurarsi che il rivestimento sia uniforme.
  5. Lasciare i coprivetrini e le piastre rivestiti con PLL in incubazione tutta la notte a temperatura ambiente in un'appaio a flusso laminare.  
  6. Il giorno successivo, rimuovere con attenzione la soluzione di PLL. Lavare i coprivetrini o la piastra/dish rivestiti tre volte con acqua sterile fresca per rimuovere qualsiasi residuo di PLL.
    NOTA: È fondamentale lavare accuratamente il flacone/piastre rivestiti con PLL, o i coprivetrini, per eliminare il PLL residuo che potrebbe influire negativamente sulla vitalità cellulare. 

2. Preparazione della coltura primaria di astrociti

NOTA: Una panoramica schematica è mostrata nella Figura 1.

  1. Dopo aver indotto l'ipotermia ponendo i cuccioli sul ghiaccio, decapitare il ratto di 1–3 giorni di vita postnatale e separare la testa dal corpo.
  2. Posizionare la testa in una piastra da 60 mm e fissarne i lati con pinzette. Utilizzando forbici fini, dissezionare delicatamente la cute sulla parte superiore della testa.
  3. Praticare un'incisione al vertice della testa usando forbici fini per aprire con cura il cranio. Separare e rimuovere delicatamente le due emisferiche del cranio.
  4. Con l'aiuto di pinzette, staccare il cervello dalla base e trasferirlo in una piastra da 60 mm contenente mezzo di dissezione.
  5. Posizionare ciascun emisfero con la superficie mediale rivolta verso l'alto per esporre le strutture mediane.
  6. Sotto un microscopio stereoscopico, rimuovere delicatamente i tessuti del mesencefalo e del tronco encefalico, lasciando intatti gli emisferi contenenti la corteccia e l'ippocampo.
  7. Utilizzare pinzette fini per staccare delicatamente le meningi, idealmente in un unico pezzo. Controllare attentamente la presenza di meningi residue nascoste nelle scissure e rimuoverle completamente.
  8. Trasferire il tessuto cerebrale dissezionato in una cappa a flusso laminare. Aspirare il mezzo di dissezione utilizzando una pipetta da 1 mL e aggiungere mezzo di dissezione fresco.
  9. Tagliare finemente il tessuto utilizzando una lama di bisturi sterile.
  10. Trasferire il tessuto tritato in 5 mL di mezzo di dissociazione in un tubo da 15 mL. Incubare il tubo in un bagno d'acqua a 37ºC per 15 minuti, agitando delicatamente il tubo ogni 5 minuti per garantire un'adeguata interazione enzima-tessuto.
  11. Al termine dell'incubazione, lasciare sedimentare il tessuto sul fondo del tubo. Aspirare il soprannatante e aggiungere 5 mL di mezzo di dissezione.
  12. Rovesciare il tubo 5 volte per lavare il tessuto. Lasciare in riposo per 3 minuti in modo che il tessuto sedimenti, quindi ripetere il lavaggio per tre volte utilizzando mezzo di dissezione fresco.
  13. Al termine dell'ultimo lavaggio, rimuovere il soprannatante e aggiungere 2,5 mL di mezzo di dissezione e 2,5 mL di mezzo di mantenimento.
  14. Triturare il tessuto passando la soluzione su e giù da 10 a 15 volte con una pipetta da 10 mL.
  15. Lasciare in riposo il tubo per 3 minuti in modo che il tessuto sedimenti. Trasferire il soprannatante (contenente le cellule) in un nuovo tubo conico da 50 mL.
  16. Aggiungere 5 mL di mezzo MEM al tubo originale contenente il tessuto sedimentato. Triturare altre 10–15 volte con una pipetta da 10 mL fino a quando la maggior parte dei frammenti scompare.
  17. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare sterile da 40 µm in un tubo conico pulito da 50 mL contenente 5 mL di mezzo di mantenimento.
  18. Centrifugare la sospensione cellulare filtrata a 200 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.
  19. Rimuovere il soprannatante, quindi allentare delicatamente il pellet cellulare battendo leggermente sul tubo. 
  20. Aggiungere 5 mL di mezzo MEM e pipettare su e giù 10 volte per risospendere il pellet. Mantenere la sospensione cellulare in un bagno d'acqua a 37ºC durante il conteggio cellulare.
  21. Diluire 10 μL della sospensione cellulare con 90 μL di mezzo MEM. Mescolare accuratamente utilizzando una punta da pipetta da 200 μL.
  22. Aggiungere 20 μL di sospensione cellulare diluita a 20 μL di blu di tripano. Contare le cellule utilizzando un emocitometro.
  23. Piastare le cellule in contenitori per colture secondo le seguenti indicazioni: per una piastra a 24 pozzetti, seminare 2 × 10⁵ cellule per pozzetto; per una piastra a 6 pozzetti, seminare 5 × 10⁵ cellule per pozzetto; per una piastra da 6 cm, seminare 1 × 10⁶ cellule per piastra.
  24. Posizionare le piastre o le piastre in un incubatore per colture cellulari. Evitare di lasciare le cellule a temperatura ambiente per periodi prolungati.
  25. Esaminare le cellule al microscopio per verificare che si siano attaccate al substrato 4 ore dopo la piattatura.
  26. A 24 ore dalla piattatura, sostituire il mezzo di coltura con mezzo di mantenimento fresco.
  27. Alimentare la coltura ogni 2–3 giorni sostituendo metà del mezzo con mezzo di mantenimento fresco.
  28. Dopo 7 giorni, le cellule dovrebbero raggiungere una confluenza di circa l'80% e saranno pronte per gli esperimenti.
    NOTA: Per garantire condizioni ottimali per le colture di astrociti, eseguire tutti i passaggi in un ambiente sterile, preferibilmente all'interno di una cappa a flusso laminare, per evitare contaminazioni. Inoltre, assicurarsi che tutti i reagenti siano preriscaldati a 37°C quando necessario. Prestare particolare attenzione durante la rimozione delle meningi, poiché qualsiasi tessuto meningeo residuo può interferire con le colture. Inoltre, evitare di lasciare le cellule a temperatura ambiente per periodi prolungati durante la piattatura e il conteggio per mantenere la vitalità e l'integrità cellulare.

3. Produzione di particelle lentivirali e transduzione 

NOTA: Una panoramica schematica è mostrata nella Figura 2.

  1. Sezionare cellule HEK293T in una piastra di Petri da 10 cm2 contenente mezzo di coltura fresco (Tabella 1).
  2. Coltivare le cellule durante la notte in un incubatore a 37ºC fino al raggiungimento di una confluenza del 50%–60%.
  3. In 1 mL di Opti-MEM, aggiungere 20 µg di plasmide lentivirale codificante GFAP o le sue varianti, 5,6 µg di vettore di impacchettamento e 1,8 µg di vettore dell'involucro. 
  4. Aggiungere 45 µL di reagente di trasfezione alla soluzione contenente il DNA.
  5. Mescolare delicatamente e incubare a temperatura ambiente per 15 min.
  6. Aggiungere direttamente la soluzione di trasfezione alle cellule HEK293T e incubare in un incubatore per colture cellulari a 37°C per 4 h.
  7. Aspirare la soluzione di trasfezione e sostituirla con mezzo di coltura fresco.  
  8. Continuare la coltura delle cellule per 2 giorni.
  9. Raccogliere il sopranatante della coltura cellulare e sostituirlo con mezzo di coltura fresco.
  10. Il giorno successivo, raccogliere nuovamente il sopranatante della coltura cellulare e sostituirlo con mezzo di coltura fresco.
  11. Nel giorno seguente, raccogliere l'ultimo sopranatante della coltura cellulare.
  12. Unire i sopranatanti dei passaggi 3.9–3.11 in un tubo conico da 50 mL.
  13. Filtrare il sopranatante combinato attraverso un filtro da 0,45 µm utilizzando una siringa da 60 mL per rimuovere i detriti.  
  14. Centrifugare il sopranatante filtrato a 1.400 × g per 5 min a temperatura ambiente per rimuovere le cellule morte.
  15. Trasferire il sopranatante chiarificato in provette per ultracentrifuga.
  16. Centrifugare a 100.000 × g per 70 min a 4°C per ottenere un pellet dei particelle lentivirali.
  17. Rimuovere con attenzione il sopranatante senza disturbare il pellet sul fondo della provetta.
  18. Risospendere il pellet in 600 µL di mezzo Opti-MEM pipettando delicatamente su e giù.
  19. Distribuire i particelle lentivirali risospesi in aliquote da 50 μL e conservarle a -80°C fino al momento dell'uso. 
  20. Sezionare astrociti primari in una piastra a 6 pozzetti e lasciarli raggiungere una confluenza del 50%–70% (Sezione 2).
  21. Scongelare le quantità necessarie di particelle lentivirali su ghiaccio.
  22. Aggiungere 50 µL di particelle lentivirali a ciascun pozzetto, integrati con 8 µg/mL di Polybrene.
  23. Ruotare delicatamente la piastra per assicurare una distribuzione uniforme del virus e del Polybrene. Incubare le cellule in un incubatore per colture cellulari a 37ºC per 4–8 h.
  24. Aspirare con attenzione il mezzo contenente il virus evitando di disturbare le cellule.
  25. Sostituire il mezzo con mezzo di coltura fresco e continuare la coltura per 2–3 giorni.
  26. Eseguire analisi successive sulle cellule trasdotte mediante microscopia a fluorescenza per visualizzare la formazione della rete di filamenti intermedi, oppure mediante immunoblotting per valutare l'espressione di GFAP.
    NOTA: Durante la manipolazione di particelle lentivirali, è fondamentale utilizzare dispositivi di protezione individuale (DPI) adeguati per garantire la sicurezza. Inoltre, per mantenere l'integrità dei particelle virali, evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento.

4. Microscopia a immunofluorescenza 

  1. Aspirare delicatamente il mezzo di coltura dalle pozzette contenenti i coverslip con le cellule adese. Evitare di disturbare le cellule.
  2. Fissare le cellule aggiungendo una delle seguenti soluzioni fissative: per astrociti primari, utilizzare paraformaldeide al 3,2% (p/v); per colture di astrociti-neuroni, utilizzare paraformaldeide al 3,2% (p/v) e saccarosio al 4% (p/v).
  3. Incubare i coverslip nella soluzione fissativa per 15 min a temperatura ambiente. A meno che non sia diversamente indicato, eseguire tutti i passaggi successivi a temperatura ambiente. 
  4. Lavare le cellule fissate tre volte con soluzione salina tamponata al fosfato (PBS) per rimuovere il fissativo.
  5. Permeabilizzare le cellule incubandole in Triton X-100 al 0,2% (v/v) preparato nel buffer di blocco (siero di capra normale al 5% (v/v) in PBS) per 15 min. 
  6. Lavare le cellule permeabilizzate tre volte con PBS.
  7. Preparare la soluzione dell'anticorpo primario diluendo l'anticorpo nel buffer di blocco secondo la concentrazione raccomandata dal produttore.
  8. Incubare i coverslip nella soluzione dell'anticorpo primario per almeno 1 h a temperatura ambiente.
  9. Lavare i coverslip tre volte con PBS per rimuovere l'anticorpo primario non legato.
  10. Preparare la soluzione dell'anticorpo secondario diluendo gli anticorpi secondari coniugati a fluorocromi anti-topo e anti-coniglio di origine caprina nel buffer di blocco in un rapporto di diluizione 1:500.  
  11. Incubare i coverslip nella soluzione dell'anticorpo secondario per 1 h a temperatura ambiente.
  12. Lavare i coverslip tre volte con PBS per rimuovere l'anticorpo secondario non legato.
  13. Trasferire con attenzione i coverslip su vetrini utilizzando pinzette.
  14. Montare i coverslip con un mezzo di montaggio per preservare la fluorescenza.
  15. Sigillare delicatamente i bordi del coverslip con smalto trasparente per unghie per evitare movimenti e evaporazione.
  16. Lasciare asciugare completamente lo smalto prima di procedere all'acquisizione delle immagini.
  17. I vetrini preparati sono pronti per l'acquisizione di immagini mediante microscopio a immunofluorescenza o confocale.
    NOTA: Per garantire il successo degli esperimenti, preparare tutti i reagenti, come PBS, buffer di blocco e anticorpi, freschi e mantenere le condizioni di sterilità. Manipolare i coverslip con cura per evitare di danneggiare le cellule o graffiare la superficie di vetro. Proteggere i campioni dalla luce durante l'incubazione con gli anticorpi e dopo il montaggio per prevenire lo sbiancamento dei segnali fluorescenti. Inoltre, ottimizzare le concentrazioni degli anticorpi e i tempi di incubazione in base alla specifica configurazione sperimentale.

5. Immunoblotting

  1. Lavare due volte gli astrociti con PBS per rimuovere il mezzo residuo e i detriti.
  2. Posizionare la piastra o la capsula su ghiaccio per minimizzare la degradazione delle proteine. Lavorando un pozzetto alla volta, aspirare completamente il PBS.
  3. Aggiungere il buffer freddo di saggio di immunoprecipitazione radioattiva (RIPA) contenente inibitori della proteasi e della fosfatasi. Per una piastra a 6 pozzetti, aggiungere 250 µL per pozzetto; per una capsula da 6 cm, aggiungere 500 µL per capsula.
  4. Utilizzare una spatola per cellule per raschiare completamente tutti gli astrociti nel buffer RIPA (50 mM Tris, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% (p/v) NP-40, 5 mM acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 0,5% (p/v) deossicolato di sodio e 0,1% (p/v) SDS, 1 mM fenilmetilsulfonil fluoruro [PMSF]).
  5. Trasferire le cellule raschiate in un omogeneizzatore Dounce da 1 mL posto su ghiaccio. Omogeneizzare le cellule macinandole delicatamente con il pestello.
  6. Incubare i lisati cellulari omogeneizzati sul ghiaccio per 10 minuti per garantire una lisi completa. Conservare 20 µL dei lisati totali per determinare la concentrazione proteica mediante saggio con acido bicinconinico (BCA).
  7. Centrifugare i lisati cellulari a 13.500 × g a 4ºC per 10 minuti per formare un pellet delle proteine insolubili.
  8. Trasferire con attenzione il sopranatante in una provetta pulita. Conservare 20 µL del sopranatante per determinare la concentrazione proteica mediante saggio BCA.
  9. Concentrare il sopranatante eseguendo una precipitazione con metanolo/cloroformio.
  10. Risospendere il precipitato ottenuto in 0,1 mL di buffer campione di Laemmli (25 mM Tris-HCl (pH 6,8), 1% (p/v) SDS, 12,5% (v/v) glicerolo, 0,01% (p/v) blu di bromofenolo, 355 mM β-mercaptoetanolo).
  11. Risospenderе il pellet nel buffer campione di Laemmli e disperderlo mediante sonificazione. 
  12. Eseguire tre cicli di sonificazione con impulsi di 0,5 secondi alla potenza del 10%. Mantenere la punta della sonda rivolta verso il fondo della provetta per evitare la formazione di schiuma.
  13. Eseguire uno saggio proteico con acido bicinconinico (BCA) sia sul sopranatante RIPA che sui lisati cellulari totali. 
  14. Caricare i campioni proteici su un gel di elettroforesi su poliacrilamide in presenza di dodecilsolfato di sodio (SDS-PAGE) al 12% o al 15%. Far correre il gel a una tensione costante di 200 V per 45 minuti.
  15. Trasferire le proteine dal gel a una membrana di nitrocellulosa utilizzando un sistema di trasferimento umido. Seguire le istruzioni del produttore e trasferire a 100 V per 70 minuti.
  16. Posizionare la membrana in albumina sierica bovina (BSA) al 5% (p/v) disciolta in soluzione salina tamponata al Tris contenente Tween-20 allo 0,1% (p/v) (TBST). Bloccare per almeno 1 ora a temperatura ambiente con agitazione delicata.
  17. Diluire gli anticorpi primari in TBST secondo le istruzioni del produttore. Incubare la membrana nella soluzione di anticorpi primari tutta la notte a 4ºC con agitazione delicata.
  18. Lavare la membrana tre volte con TBST, ogni lavaggio della durata di 5 minuti.
  19. Diluire gli anticorpi secondari coniugati con fluoroforo o con perossidasi di rafano (HRP) in TBST in un rapporto di diluizione 1:500 (o come specificato dal produttore).
  20. Incubare la membrana nella soluzione di anticorpi secondari per 1 ora a temperatura ambiente con agitazione delicata.
  21. Lavare la membrana tre volte con TBST, ogni lavaggio della durata di 5 minuti.
  22. Sviluppare la membrana utilizzando fluorescenza o chemiluminescenza migliorata (ECL) secondo le istruzioni del produttore.
  23. Visualizzare le bande proteiche utilizzando un sistema di imaging.
    NOTA: Per prevenire la degradazione delle proteine, eseguire tutti i passaggi sul ghiaccio o a 4ºC, eccetto quelli di incubazione con gli anticorpi e di bloccaggio. Assicurarsi che tutti i buffer, reagenti e strumenti siano pre-raffreddati prima dell'uso per mantenere basse temperature durante tutto il processo. Evitare il sovraccarico del gel per prevenire sbavature e ottimizzare le concentrazioni degli anticorpi e i tempi di incubazione in base all'esperimento specifico.

6. Preparazione di neuroni primari per la coltura in cocoltura

  1. Sacrificare la ratto gravida utilizzando anidride carbonica come anestetico inalatorio. Dissezionare l'utero e posizionarlo in una piastra di Petri sterile.
  2. Rimuovere i cervelli dai feti e posizionarli in una piastra da 6 cm contenente soluzione di dissezione. Assicurarsi che il tessuto rimanga sempre immerso nella soluzione per evitare l'essiccamento.
  3. Dissezionare le cortici e rimuovere le meningi come descritto (passaggio 2.7).
  4. Trasferire il tessuto dissezionato in una cappa a flusso laminare.
  5. Aspirare la soluzione di dissezione utilizzando una pipetta da 1 mL e aggiungere soluzione di dissezione fresca alla piastra.  
  6. Tagliare il tessuto cerebrale in piccoli pezzi utilizzando una lama di bisturi sterile.
  7. Trasferire il tessuto tritato in 5 mL di mezzo di dissociazione neuronale (Tabella 1) preriscaldato a 37 ºC in un tubo da 15 mL.
  8. Incubare il tubo in un bagno d'acqua a 37 ºC per 30 minuti, agitando delicatamente il tubo ogni 5 minuti per garantire un'adeguata interazione enzima-tessuto. 
  9. Rimuovere il tubo dal bagno d'acqua e lasciare sedimentare il tessuto sul fondo del tubo. Aspirare con attenzione il soprannatante utilizzando una punta di pipetta da 1 mL senza disturbare il tessuto.
  10. Aggiungere 5 mL di soluzione di dissezione preriscaldata al tubo e capovolgerlo 5 volte per risciacquare il tessuto. Lasciare in riposo per 3 minuti in modo che il tessuto sedimenti, quindi ripetere il lavaggio per tre volte, utilizzando ogni volta soluzione di dissezione fresca.
  11. Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere il soprannatante e aggiungere 2,5 mL di soluzione di dissezione e 2,5 mL di mezzo di semina.
  12. Triturare il tessuto pipettando la soluzione su e giù da 10 a 15 volte utilizzando una pipetta da 10 mL.
  13. Lasciare in riposo il tubo per 3 minuti in modo che il tessuto sedimenti. Trasferire il soprannatante (contenente le cellule) in un nuovo tubo conico da 50 mL.
  14. Aggiungere 5 mL di mezzo di semina al tubo originale contenente il tessuto sedimentato. 
  15. Triturare nuovamente il tessuto da 10 a 15 volte utilizzando una pipetta da 10 mL fino a quando la maggior parte dei frammenti scompare.
  16. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare sterile da 40 µm in un tubo conico pulito da 50 mL contenente 5 mL di mezzo di semina.
  17. Centrifugare la sospensione cellulare filtrata a 200 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.
  18. Rimuovere il soprannatante, quindi allentare delicatamente il pellet cellulare battendo leggermente sul tubo. Aggiungere 5 mL di mezzo di semina preriscaldato e pipettare su e giù 10 volte per risospendere il pellet.
  19. Contare le cellule come descritto in precedenza (passaggi 2.21 e 2.22). Mantenere la sospensione cellulare in un bagno d'acqua a 37°C durante il conteggio delle cellule.
  20. Sezionare i neuroni direttamente sopra gli astrociti primari nei contenitori di coltura come segue: per una piastra a 24 pozzetti, seminare 1,45 × 105 cellule per pozzetto; per una piastra a 6 pozzetti, seminare 5 × 105 cellule per pozzetto; per una piastra da 6 cm, seminare 1 × 106 cellule per pozzetto.
  21. Posizionare le piastre o le capsule in un incubatore per colture cellulari impostato a 37ºC con 5% di CO₂. Evitare di lasciare le cellule a temperatura ambiente per periodi prolungati per mantenere la vitalità.
  22. Sostituire il mezzo di semina con mezzo di mantenimento neuronale 4 ore dopo la semina.
  23. Sostituire metà del mezzo con mezzo di mantenimento neuronale fresco ogni 3–4 giorni.
    NOTA: I neuroni in cocoltura saranno pronti per gli esperimenti a 7–10 giorni in vitro (DIV).

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Risultati

Una panoramica morfologica delle colture primarie di astrociti in diversi momenti successivi all'isolamento è presentata nella Figura 3. Dopo la semina della sospensione cellulare corticale, alcuni astrociti aderiscono alla superficie della piastra di coltura entro le prime 24 ore (Figura 3A). Nei primi 3-5 giorni, le colture contengono detriti cellulari e neuroni in via di morte (Figura 3B), poiché il mezzo di coltura è ottimizzato...

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Discussione

Le colture primarie di astrociti hanno notevolmente approfondito la nostra comprensione del ruolo degli astrociti nella salute e nelle malattie. Basandosi sui lavori fondamentali di McCarthy e de Vellis21, queste colture sono fondamentali per lo studio della Dx A, poiché permettono un'analisi dettagliata dei processi specifici degli astrociti, in particolare gli effetti delle mutazioni della Dx A sull'assemblaggio della GFAP e sulla formazione di aggregati.

L'isolamento...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

Ringraziamenti

Ringraziamo la dottoressa Tracy Hagemann (Waisman Center, Università del Wisconsin-Madison) per aver fornito i ratti knock-in R237H. Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del National Science and Technology Council (111-2320-B-007-008 e 112-2320-B-007-006 a N.-H. L. e M.-D.P.). Gli autori esprimono gratitudine per il supporto fornito dal nucleo di imaging confocale dell'Università Nazionale Tsing Hua di Taiwan, sostenuto dal National Science and Technology Council (NSTC-114-2740-M-007-001). Ringraziamo inoltre il Centro Strumentazione dell'Università Nazionale Tsing Hua per l'accesso al microscopio elettronico.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
HEPES 1 M, pH 7,4 Gibco15630-080
Penicillina-streptomicina 100×  Gibco15140-122
Soluzione salina equilibrata di Hank (HBSS) 10×Gibco14180-046
Tripsina al 2,5%Gibco15090046
Soluzione di acrilamide/bis 30% 37,5:1Biorad1610158
Anticorpo anti-GFAPCell Signaling Technology12389
Anticorpo anti-GFAP umanoBiolegend837202Clone SMI21
Anticorpo anti-panGFAPAgilentGA524
Anticorpo anti-ubiquitinaMilliporeST 1200Clone FK2
Anticorpo anti-vimentinaSigma-AldrichV6389Clone V9
Anticorpo anti-tubulina β IIIBiolegend801201
Supplemento B27Gibco17504044
Cloruro di calcio (CaCl2)Arcos34961
Reagenti per colture cellulari
Sistema di imaging ChemiDocBioRadNA
Colorante blu di CoomassieUSB32826
CisteinaSigma-AldrichC1276
Ditiotreitolo (DTT)URDTT
DNasi I Sigma-AldrichD5025
Omogeneizzatore DounceWheaton
Mezzo di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM)Corning10-013-CM
Kit per la preparazione di DNA plasmidico privo di endotossine Qiagen12943
Reagente chemiluminescente potenziato (ECL)PerkinElmerNEL 105001
Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)USB15699
Siero bovino fetale  GibcoA5209401
GlucosioSigma-AldrichG8270
GlutaMaxGibco35050-061
Mezzo essenziale minimo (MEM)Corning10-010-CVR
NaClHoneywell31434S
Mezzo NeurobasalGibco21103049
Ultracentrifuga Optima XE-90BeckmanNA
PapainaWorthingtonLS003126
Fluoruro di fenilmetilsulfonile (PMSF)ACROS ORGANICS215740050
PolietileniminaSigma-AldrichP3143
Poli-L-lisinaSigma-AldrichP6516
Cloruro di potassio (KCl)Honeywell12636
Anticorpo anti-actina marcato con rodaminaBioRad12004164
Dodecilsolfato di sodio (SDS)USB75819
Piruvato di sodioGibco11360070
StarBright Blue 520 capra anti-topo IgG Biorad12005867
StarBright Blue 700 capra anti-coniglio IgG BioRad12004161
SaccarosioSigma-AldrichS5391
Rotore SW-28BeckmanNA
Reagente di trasfezione TansIT-LT1MirusMR-MIR-2300
TEMEDUSB76320
Tris(idrossimetil)aminometano (Tris)USB75825
Triton X-100Sigma-AldrichT9284
β-mercaptoetanoloSigma-AldrichM3148

Riferimenti

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