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Soluzioni
- Soluzione intracellulare di cellule gangliari (in mm): 100 K-gluconato, 8 KCl, 1 MgCl 2, 1 EGTA, 10 HEPES, 4 ATP, GTP 0,5, 90 mM solforodamina B (per la colorazione), portato a pH = 7,4 con KOH
- Soluzione intracellulare di cellule bipolari (in mm): 90 K-gluconato, 8 KCl, 1 MgCl 2, 10 Bapta, 10 HEPES, 4 ATP, GTP 0,5, 90 mM solforodamina B (per la colorazione), portato a pH = 7,4 con KOH
- Ringer extracellulare della soluzione (in mm): 112 NaCl, 5 Glucosio, 5 HEPES, 2 KCl, 2 CaCl 2, 1 MgCl 2, portato a pH = 7.75 con NaOH. Ossigenazione della soluzione non è necessario.
Preparare camere di registrazione
La nostra camera di registrazione è costituito da un vetrino da microscopio con un adesivo ben in cui blocchi di silicone piccolo ritagliato da un altro adesivo e sono in grado di dare stabilità al fette di tessuto.
Preparazione di fette della retina
Per evitare lo sbiancamento dei fotorecettori, la dissezione viene effettuata in IR o luce fioca luce rossa. Se uno è interessato a registrare le risposte dal sentiero asta, solo luce IR deve essere usato (IR dissezione microscopio e nessuna luce ambiente. Aggiuntive occhiali a infrarossi devono essere utilizzati per le procedure non fanno sotto il microscopio). Se uno è principalmente interessato a registrare le risposte cono di luce, fioca luce della stanza rossa o una luce del flash rosso può essere utilizzato. Il microscopio, tuttavia, deve ancora oculari IR.
Se l'ingresso dei fotorecettori è irrilevante per l'esperimento, le procedure possono essere effettuate in luce ambiente normale utilizzando un microscopio normale.
- Preparare due vetrini da microscopio con un adesivo siliconico bene: creare due bande parallele di grasso al silicone (circa 0,5 centimetri di distanza) in ogni diapositiva e luogo un pezzo rettangolare di carta da filtro su un lato del vetrino, attraversando entrambe le bande grasso (spingere il filtro carta con parte di una lama di rasoio in modo che sia ben collegato alla diapositiva)
- Sacrificare una salamandra secondo i protocolli stabiliti: l'animale viene posto in un bagno di ghiaccio per 30 minuti, poi decapitato e doppio pithed.
- Eliminare l'effetto occhi dalla testa salamandra e metterla sotto il microscopio da dissezione su un pezzo di carta velina inumidita con soluzione ghiacciata di Ringer
- Rimuovere il tessuto connettivo dall'occhio
- Usa lama di rasoio per fare un piccolo taglio nella cornea
- Tenere taglio della cornea con una pinza, mentre la rimozione con le forbici lungo il suo attaccamento per l'occhio
- Rimuovere l'obiettivo con una pinza
- Tenere l'iride con una pinza e taglio lungo la serrata per rimuovere l'iride
- Tagliare l'oculare in due pezzi rettangolari
- Prendete uno dei pezzi e mettetelo lato sclera sul filtro di carta (assicuratevi di appiattirsi il pezzo mentre si spinge verso il basso con molta attenzione)
- Sollevare delicatamente la sclera al largo della retina, che ora dovrà essere allegata alla carta filer
- Aggiungere rapidamente una soluzione ghiacciata di Ringer al pozzo
- Ripetere lo stesso per il secondo pezzo
- Utilizzare una lama di rasoio posto in una affettatrice su misura per tagliare 200-300μm fette larghe.
- Usare un paio di pinze per prendere le fette a lato della carta da filtro, li girare così gli strati della retina diventano visibili, e metterli su bande grasso il vuoto
- Scegli una fetta che sembra intatto e mostra fasce orizzontali che indicano gli strati della retina (i livelli sono a volte difficili da vedere al microscopio dissezione come l'ingrandimento non è abbastanza alta, se si può riconoscere qualche stratificazione la fetta di solito è abbastanza buono. La decisione finale sull'opportunità di utilizzare la fetta, comunque, è fatta una volta si è vista al microscopio in posizione verticale). Spostare alla diapositiva camera di registrazione con la costruzione di un ponte Ringer tra i due vetrini
- Assicurarsi che la carta da filtro viene spinto contro i blocchi di gomma nella camera di registrazione in modo che la fetta non sia inclinato (cellule gangliari e fotorecettori dovrebbe essere a fuoco allo stesso tempo)
Posizionamento del tessuto nel rig registrazione
- La slitta di registrazione è posto sotto il microscopio e perfusi con soluzioni di Ringer attraverso un syste perfusione gravità
- La preparazione è visualizzato con un microscopio verticale con un obiettivo 10x e 40x acqua ad immersione.
- Ancora una volta, usiamo solo la luce a infrarossi per prevenire lo sbiancamento dei fotorecettori. Una telecamera a infrarossi è collegato alla porta laterale del microscopio, che è collegato ad uno schermo TV.
Stimolazione visiva
Stimoli visivi sono programmati in Matlab utilizzando la Psychtoolbox e vengono proiettate sulla retina attraverso la porta superiore del microscopio utilizzando un microscopio immagine iniettore (MBF bioscienze). A Bits + + processore video digitale (Cambridge Research Systems) è usato per ottenere una scala a 14 bit di luminanza e di sincronoonize presentazione dello stimolo con l'acquisizione dei dati. Gli stimoli visivi utilizzati in questo video sono barre chiare o scure (width = 460μm) del 100% di contrasto, che sono stati presentati per due secondi su uno sfondo uniforme costante (luminanza = 8 * 10 4 fotoni / micron / s, dimensioni: 1,84 x 1,38 millimetri).
Elettrofisiologia
- Elettrodi di patch sono tirati da vetro borosilicato (OD:.. 1,5 mm, ID 84mm) con un estrattore micropipetta. Per le cellule gangliari, le resistenze sono tra 2 e 4 MOhm. Per le cellule bipolari, più resistenze tra 4 e 8 MOhm sono utilizzati.
- Registrazioni morsetto di tensione sono eseguiti utilizzando una 700A Multiclamp (Molecular Devices), un amplificatore e software laboratorio interno programmato in Labview.
- I farmaci sono perfusi attraverso un sistema a 8 canali perfusione. L'elettrodo microperfusione si trova vicino alla fetta (il tessuto dovrebbe visibilmente muoversi quando si accende la perfusione e fuori, ma bisogna stare attenti che la pressione non è troppo forte in modo che la fetta potrebbero staccarsi dalla carta da filtro). Durante gli esperimenti il microperfusione deve essere costantemente acceso (soluzione di controllo perfusione se non sono necessari farmaci) in modo che la registrazione non viene disturbato dal passaggio della perfusione e si spegne.