Questo video descrive la manipolazione di colture di neuroni utilizzando pinzette laser in vitro.
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Articolo metodologico
Utilizzando pinzette laser per manipolare i neuroni isolato in vitro
In questo articolo
Sommario
Abstract
In questo articolo e video, si descrive i protocolli utilizzati nel nostro laboratorio per studiare le preferenze di targeting dei processi di rigenerazione delle cellule adulte in vitro i neuroni della retina. Procedure per la preparazione di colture di cellule della retina iniziare con la digestione dissezione, e triturazione della retina, e terminano con la placcatura di isolate cellule della retina sui piatti realizzati appositamente per l'utilizzo con pinzette laser. Questi piatti sono divisi in una metà adesivo cellula e mezzo repellente cellula. Il lato adesivo cella è rivestita con uno strato di Sal-1 anticorpi, che forniscono un substrato su cui le nostre cellule crescono. Altri substrati adesivi potrebbero essere utilizzati per altri tipi di cellule. Il lato repellente cellula è rivestita con un sottile strato di poli-HEMA. Le cellule placcato sulla poli-HEMA lato del piatto sono intrappolati con le pinzette laser, trasportate e poi messo in una cella adiacente sul lato Sal-1 per creare una coppia. Formazione di gruppi di cellule di qualsiasi dimensione dovrebbe essere possibile con questa tecnica. "Laser-pinzette controllato micromanipolazione" significa che il ricercatore può scegliere le celle da spostare, e la distanza desiderata tra le cellule possono essere standardizzati. Poiché il raggio laser passa attraverso superfici trasparenti del piatto cultura, la selezione delle cellule e il posizionamento sono fatte in ambiente chiuso ambiente sterile. Le cellule possono essere monitorati tramite video time-lapse e utilizzato con qualsiasi tecnica cellula biologica richiesti. Questa tecnica può aiutare indagini di interazioni cellula-cellula.
Protocollo
Pinzette ottiche per la manipolazione di cellule isolate in coltura
Forze cattura di pinzette ottiche sono generati dalla quantità di moto della luce (Ashkin, 1991;. Ashkin et al, 1986). Anche se queste forze facilmente intrappolare le cellule in sospensione, non sono in grado di spostare le cellule che aderiscono a una superficie. Pertanto, per ridurre l'adesione al piatto cultura nel punto in cui sono intrappolati cellule, il vetrino è rivestito con poli-2-idrossietilmetacrilato (poli-HEMA) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), un composto tossico con cella repellente proprietà precedentemente impiegato per gli studi di adesione s....
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Discussione
La luce ha slancio, e quando un raggio di luce viene rifratta che passa attraverso una cella, è necessaria una forza per cambiare la direzione del momento. A causa della legge di conservazione del momento, una forza nella direzione opposta deve, a sua volta, reagisce di nuovo su una cella. Ashkin (1991) ha mostrato che la forza generata da un fascio laser focalizzato da una lente obiettivo microscopio si muoverà una cella verso il centro della messa a fuoco. Anche se un raggio laser genera solo un paio di piconewtons di forza, questa forza .......
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Ringraziamenti
La ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni NIH EY012031 e EY0182175 e la FM Kirby Foundation.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Coprioggetti circolare da 25 mm, n. 1 | VWR international | 48380 080 | |
| Poli-2-idrossietilmetacrilato (poly-HEMA) | Sigma-Aldrich | P-3932 | Sciogliere in etanolo al 95% |
| Anticorpo caprino anti-topo IgG | Chemicon International | AP181 | 1 mg in 1 ml, diluire 10 volte per l'uso |
| Supernatante Sal-1 contenente anticorpo murino anti-salamandra | gentilmente fornito dal Dott. Peter MacLeish | Dott. Peter MacLeish, Morehouse School of Medicine, Atlanta, GA | |
| Pipette monouso in pyrex da 5 ml con foro da 3 mm | Corning | 7078A-5 | |
| Piatti per colture cellulari da 35 mm x 10 mm | Corning | 430165 | |
| Kit di elastomero siliconico Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| Pinzette ottiche-microstrumento o pinzette laser | Cell Robotics Inc. | ||
| Laser a diodo a onda continua da 1 W e lunghezza d'onda di 980 nm | Cell Robotics Inc. | ||
| Microscopio invertito a luce trasmessa Axiovert 100 | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Obiettivo plan-neofluar ad immersione in olio da 40x | Carl Zeiss, Inc. | Apertura numerica (N.A. 1.3) | |
| Telecamera CCD in bianco e nero | Sony Corporation | ||
| Computer e joystick con software | Cell Robotics Inc. | per il controllo di un palchetto motorizzato |
Riferimenti
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a Single-Beam Gradient Force Optical Trap for Dielectric Particles. Opt. Lett. 11, 288-290 (1986).
- Clarke, R. J., Hoegnason, K., Brimacombe, M., Townes-Anderson, E. Cone and rod....
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Ristampe e permessi
