Studiare Biogenesi della membrana con una luciferasi saggio basato su Reporter Gene

Sommario

Qui si descrivono le modalità per lo studio delle variazioni di fagocitosi indotta espressione del gene luciferasi con un approccio basato giornalista gene utilizzando il Dual-GloTM sistema luciferasi di analisi da Promega.

Abstract

Per studiare il coordinamento delle diverse vie di sintesi dei lipidi durante la biogenesi della membrana è utile lavorare con un sistema sperimentale in cui la biogenesi della membrana avviene rapidamente e in modo inducibile. Abbiamo scoperto che la fagocitosi di sfere di lattice è pratico per questi scopi, come le cellule in rapida sintesi di lipidi di membrana per riempire piscine membrana perso come materiale per il confezionamento durante fagocitazione delle particelle. Qui si descrivono le modalità per lo studio delle variazioni di fagocitosi indotta espressione del gene luciferasi con un approccio basato giornalista gene utilizzando il Dual-Glo sistema luciferasi di analisi da Promega.

Protocollo

Colture Cellulari

1. Colture delle risorse umane di rene embrionale 293 (HEK293), le cellule sono coltivate in 10 cm di piatti della cultura in 'medium A', composto da Media Dulbecco Modified Eagle (DMEM) integrato con un cocktail di antibiotici (100 unità per ml di penicillina e 100 mg per ml di solfato di streptomicina) e il 10% di siero fetale bovino (FBS).
2. Per impostare le celle di un esperimento, il mezzo è succhiare, e le cellule vengono lavate due volte con 5 ml di tampone fosfato (PBS) soluzione.
3. La PBS è poi rimosso e sostituito con 0,6 ml di una soluzione contenente 0,25% tripsina.
4. Il piatto viene incubata a 37 ˚....