Preparazione e manutenzione dei neuroni dei gangli dorsali in Culture Compartmented

Sommario

Qui si descrive la tecnica di preparazione e mantenimento di camere compartimenti per la coltura dei neuroni sensoriali dei gangli delle radici dorsali.

Abstract

I neuroni estendere i processi assoni che sono molto lontane dal corpo cellulare a innervare tessuti bersaglio, dove sono richiesti obiettivi derivati ​​fattori di crescita per la sopravvivenza neuronale e la funzione. Neurotrofine sono specificamente tenuti a mantenere la sopravvivenza e la differenziazione dei neuroni sensoriali che innervano ma il problema di come questi target-derivati ​​neurotrofine comunicare al corpo cellulare dei neuroni che innervano è stata un'area di ricerca attiva da oltre 30 anni. Il modello più comunemente accettata di come i segnali neurotrofina raggiungere il corpo cellulare propone di segnalazione endosomi portare questo segnale retrogrado lungo l'assone. Al fine di studiare il trasporto retrogrado, un sistema di coltura è stato originariamente ideato da Robert Campenot, in cui corpi cellulari sono isolati dal loro assoni. La tecnica di preparazione di queste camere compartimenti per la coltura dei neuroni sensoriali ricapitola la stimolazione selettiva di terminazioni neuronali che si verifica in vivo seguente comunicato del target di derivazione neurotrofine. Retrograda di segnalazione eventi che richiedono lunga distanza retrograda dipendente microtubuli hanno importanti implicazioni per il trattamento di patologie neurodegenerative.

Protocollo

Preparazione dei reagenti

1. Rivestimento collagene: collagene cappotto p35 piastre di coltura dei tessuti e mettere in forno a 37 ° C per 2 giorni prima ingrassaggio i divisori. La concentrazione finale di collagene deve essere di 0,71 mg / ml diluito in 0,001 N HCl. Poi, aggiungere 1 ml di miscela per piastra.
2. Caricatori Grasso: Per riempire il caricatore grasso, una siringa da 60 ml deve prima essere riempita con grasso per vuoto Corning. Usare la siringa per riempire il caricatore grasso, avvolgetela in un foglio e poi in autoclave per 45 minuti.
3. Divisori teflon: i divisori possono essere riutilizzati dopo ogn....

Discussione

In questo video, abbiamo dimostrato come preparare e mantenere camere compartimenti per l'uso nei neuroni DRG coltura. Fatto correttamente, questo sistema consente la separazione del corpo cellulare dal assone al fine di studiare meccanismi attraverso i quali neurotrofine segnale attraverso lunghi assoni. Poiché non vi è l'isolamento fluidico tra i compartimenti, permette per la stimolazione selettiva o il trattamento di un compartimento senza altri compartimenti essere colpiti. Culture camera compartimentate in grado di supportare .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
collageno	Reagente	BD Biosciences	354249
metilcellulosa N2 400CPS	Reagente	Sel-Win Chemicals
divisore in teflon	Altro	Tyler Research	CAMP10	sono disponibili molti altri tipi di divisori
rastrello a perno	Strumento	Tyler Research	Camp-PR
caricatore per grasso	Strumento	Tyler Research	Camp-GLSS
DMEM	Reagente	Fisher Scientific	MT10017CV
NGF	Reagente	PeproTech Inc	450-01
BDNF	Reagente	PeproTech Inc	450-02
grasso ad alto vuoto	Reagente	Fisher Scientific	14-635-5D
AraC	Reagente	Sigma-Aldrich	C-1768
adattatore luer a stelo da 23 gauge	Strumento	Fisher Scientific	427565
pinze emostatiche ad angolo di 90°	Strumento	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-7035