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I. Panoramica schematica:
Questo video mostra le diverse fasi in immunoistochimica montare tutto in embrione di pollo. In primo luogo, l'embrione è fissato in PFA [IHC1]. Poi, l'attività della perossidasi endogena si spegne [IHC2]. L'embrione viene quindi incubato in anticorpo primario [IHC3]. Dopo numerosi lavaggi, l'embrione viene incubato in anticorpo secondario [IHC4]; reazione del colore è rivelato utilizzando DAB [IHC5] e colorazione anticorpale sembra arancione [IHC6].
Parte 1: fissaggio degli embrioni
- Per eseguire immunoistochimica intero montare su embrioni di pollo, per prima cosa aprire un uovo toccando il guscio con una pinza e rimuovere i pezzi del guscio.
- Rimuovere l'albumina spessore con una pinza, e inclinare il sacco vitellino con una pinza grossolana in modo che l'embrione verso l'alto.
- Utilizzando forbici, tagliare un quadrato di tutto il sacco vitellino dell'embrione. Rimuovere l'embrione dal tuorlo con un cucchiaio, e mettere in un piatto contenente PBS.
- Sotto un microscopio dissezione, rimuovere con attenzione le membrane e il tuorlo e il trasferimento degli embrioni per un piatto fresco contenente PBS.
- Perno l'embrione giù con una pinza e perni di insetti, e aspirare il PBS. Sostituirlo con PFA 4% in PBS, e consentire l'embrione di fissare 1 ora a temperatura ambiente.
Parte 2: Preparazione di embrioni per la fase di anticorpi
- Per ridurre al minimo potenziale contaminazione microbica, utilizzare DDH 2 O in tutti i passaggi successivi.
- Dopo che l'embrione è fisso, aspirare la soluzione di fissativo e smaltire come rifiuto chimico. Riempire il piatto con PBS.
- prossimo, con un coltello microdissezione, tagliare un quadrato attorno embrione per rimuovere membrane extraembrionali. Rimuovere le spine di insetti con una pinza.
- Dopo i perni sono stati rimossi, utilizzare una pipetta Pasteur smussato fine di trasferire l'embrione in una fiala contenente scintillazione con PBT (PBS pH 7,4, 0,5% Triton X).
- Lavare l'embrione con PBT, 3 volte per 10 minuti ciascuno.
- Rimuovere PBT dal flaconcino scintillazione, e sostituirlo con PBTx contenenti 0,3% di H 2 O 2 al fine di inattivare perossidasi potenziale endogeno.
- Incubare per 2 ore a temperatura ambiente su nutator.
- Lavare embrione con PBT, 3 volte per 10 minuti ciascuno, poi 3 volte per 30 minuti ciascuno.
Parte 3: incubazione anticorpi
- Per colorare l'embrione con l'anticorpo, inizia lavando l'embrione per un'ora in tampone di bloccaggio o 1% BSA / 1% NGS / PBT (usiamo NGS perché l'anticorpo secondario è sollevata in capra). Incubare su nutator per un'ora a temperatura ambiente.
- Diluire l'anticorpo primario 1:1 in tampone di bloccaggio, e incubare embrione in questa soluzione per 2 giorni a 4 ° C il nutator. Primario fattore di diluizione degli anticorpi dipende dalla scelta di anticorpo primario. Qui, usiamo un anticorpo dal Developmental Studies Ibridoma Banca, che viene fornito come supernatent. Noi diluirlo 1:1 in tampone di bloccaggio.
- successiva, eseguire 3 10 minuti lava in PBT, seguita da 3 1-ora lavaggi in PBT.
- Dopo il lavaggio, diluire l'anticorpo secondario 1:2500 in tampone di bloccaggio (in questo caso coniugato perossidasi-capra anti-topo IgG (H + L), embrione e incubare in questa soluzione O / N a 4 ° C su nutator.
- Eseguire 3 10 minuti di lavaggi in PBT, seguita da 3 1-ora lavaggi in PBT.
Parte 3: reazione del colore
- Per sviluppare la reazione colore dell'embrione macchiato, prima eseguire 2 20 minuti di lavaggi in tampone Tris (100mM Tris HCl, pH 7,4).
- Nel frattempo sciogliere substrato DAB (3,3 '-diaminobenzidina tetraidrocloruro) nel tampone Tris a 500μg/ml sotto cappa aspirante; tenere soluzione nel buio, sul ghiaccio.
- Rimuovere ultimi tampone di lavaggio Tris dall'embrione fiala contenente e sostituirlo con la soluzione DAB 5ml dal punto 3.2. Tenere in scuro su nutator per 20 mn. Smaltire Eppendorf punta nel secchio contenente una soluzione di candeggina al 10% per decontaminare DAB.
- Nel frattempo preparare uno stock 0,3% H 2 O 2 in dh 2 O sul ghiaccio.
- Aggiungere il brodo di 50μl H 2 O 2 al flacone contenente gli embrioni in DAB. Tenere al buio. Dopo 1-2 minuti, monitorare la reazione al microscopio.
Parte 4: embrioni per la fotografia e istologia
- Quando la reazione del colore è completa, smaltire DAB in secchio di candeggina. Sostituire con 5 ml di acqua del rubinetto.
- Eseguire 2 10 minuti di lavaggi in PBS.
- Al processo per la fotografia e sezionamento cera, disidratano in una serie di etanolo (25%, 50%, 75% e 100%) per 10 minuti ciascuno.
- Sostituire l'etanolo da 0,5 - 1 ml di olio di cedro legno (questo renderà il traslucido embrione). Processo per la fotografia in olio di legno di cedro.
- A seguito di fotografia, di ritorno embrione a fiala e sostituire l'olio di legno di cedro con il 100% di etanolo. Ripetere il punto etanolo.
- Sostituire ethanol con il 5% FCF veloce verde in 100% etanolo, e incubare per 3 minuti (questo passo renderà visibili gli embrioni per istologia). Sostituire rapida soluzione verde FCF con il 100% di etanolo e di processo per l'esame istologico.
Rappresentante dei risultati:
Negli esempi mostrati di seguito, gli embrioni vengono sezionati in fasi HH 10 (A), 12 (B) e 11 (C); Embrioni mostrano espressione di PAX 7 in emergenti Crestas neurali così come in somiti e del tubo neurale (A, B); In (C), notocorda è etichettato con 15.3B9 (Non-1) (Anticorpi fornite dal Developmental Studies Ibridoma Bank).