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Pipette tirando
Utilizzando un filamento estrattore come un Sutter P-97 Flaming Puller microelettrodo / Brown, tirare un insieme di circa 10-20 pipette.
- Seleziona il tuo bicchiere. Noi usiamo borosilicato (BF150-86-10, OD = 1,5 mm, ID = 0,86 mm). Conservare con cura il vetro in modo che rimane pulito e senza polvere.
- Progettare un programma di trazione. L'obiettivo primario è una punta di apertura circa la dimensione desiderata, che dipende dalla applicazione. Sutter P-97 Cookbook Pipettare 2 è un eccellente punto di riferimento.
- Osservate la vostra pipette al microscopio per determinare diametro di apertura e morbidezza. Eliminare ruvido, consigli irregolare, o irregolari. Per la registrazione standard di patch clamp, un'apertura punta che è di 2-4 micron tutto è meglio. Una punta smussata porta ad una minore resistenza per il diametro dell'apertura stessa, che si preferisce. Forma e dimensioni possono essere modificate durante la lucidatura, di seguito.
Pressione lucidatura pipette
- Collegare un titolare pipetta con una linea pulita ed aria compressa. Utilizzando un regolatore, impostare la pressione dell'aria compressa linea a ~ 40 PSI. Collegare la linea di aria compressa ad una valvola a 4 vie di controllo che permetterà la pressione titolare pipetta ad essere attivata e disattivata. Collegare un titolare pipetta alla valvola di controllo con una lunghezza di ⅛ in Tygon ® tubazione.
- Utilizzare un impianto di lucidatura (microforge) con un alta pressione titolare pipetta, una bobina di lucidatura controllato da un pedale, un microscopio equipaggiato con un ingrandimento basso e alto, lunga distanza (idealmente, 10x e 100x) aria obiettivi. E 'fondamentale essere in grado di osservare l'apertura pipetta durante il protocollo.
- Opzionale: Cappotto la pipetta con un isolante idrofoba per diminuire capacità e migliorare le caratteristiche del rumore (vedi "pipette Pulling" per questa tecnica).
- Verificare che la valvola è in posizione off. Inserire una pipetta nel supporto pipetta e stringere il raccordo di a mano.
Nota di sicurezza: se la pipetta venga mantenuta ferma nel supporto pipetta, la pressione dell'aria provoca la pipetta di essere espulso dal titolare pipetta.
- Posizionare la pipetta e titolare nel microforge. Posizionare il titolare pipetta sul palco microscopio in modo che sia la punta e la bobina lucidatura sono visibili in basso (10x) accendere il microforge. Portare la punta ~ 75 micron dal filamento. Tieni presente che il filamento si espande quando riscaldato.
- Passare alla elevata potenza (100x) obiettivo. Sia la punta della pipetta e la bobina lucidatura dovrebbe essere a fuoco e nel campo di vista. In caso contrario, regolare l'altezza della bobina lucidatura. (La posizione della pipetta non può essere regolata). La punta della pipetta e la bobina di lucidatura dovrebbe essere vicino ai lati opposti del campo visivo. Evitare di posizionare la bobina troppo vicino alla punta della pipetta, perché si espanderà in caso di riscaldamento e di rilievo nella vostra pipetta.
- Girate la valvola per dirigere l'aria pressurizzata nella pipetta, e il calore la punta della pipetta fino a quando il cono dietro la punta comincia a palloncino verso l'esterno.
- Interrompere il riscaldamento prima che la punta palloncini troppo ampiamente. La sperimentazione è necessaria per determinare la distanza appropriata, il calore, e il tempo per la forma desiderata.
- Opzionale: ridurre il diametro di apertura punta da lucidare la punta, in assenza di pressione. I punti 7 e 8 può ripetere per mettere a punto sia la forma e le dimensioni della punta della pipetta.
- Spegnere la pressione e puntando la punta della pipetta in una direzione sicura, rimuovere la pipetta e metterla in un contenitore pulito, dove sarà protetta dalla polvere.
Nota di sicurezza: Se la pressione dell'aria non è spento, la pipetta può essere espulso dal titolare pipetta durante la rimozione.
Note sui microforge
Usiamo un microforge assemblato da off-the-shelf parti disponibili in commercio. (È possibile anche acquistare un kit di lucidatura pressione da alcune aziende, ad esempio, ALA Scienza, GlassWorx). Indipendentemente dal microforge, è essenziale avere ottiche che sono buone abbastanza per vedere l'apertura punta, che è spesso solo un paio di micron di diametro. Usiamo un lungo lavoro obiettivo 100x a distanza per questo scopo. Inoltre, il cappotto la bobina di lucidatura ad alta temperatura di fusione del vetro in modo da minimizzare il deposito di metallo vaporizzato sul pipette.
Parte 3: risultati attesi
Lucidatura moderata pressione può ridurre la resistenza di una pipetta senza modificare sensibilmente l'apertura diametro. Se lo si desidera, questo protocollo può essere usato per fare pipette con sub-micron aperture e resistenze tra 5-10MΩ.