Questa è una guida per modificare la forma di micropipette di vetro. In particolare, utilizzando il calore e la pressione dell'aria la conicità è allargato senza aumentare l'apertura punta, con conseguente minore resistenza pipetta. Questo è fondamentale per ottenere registrazioni a basso rumore di piccole cellule, ma è utile in molte applicazioni.
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Articolo metodologico
Pressione lucidatura Pipette per una migliore patch-clamp di registrazione
In questo articolo
Sommario
Abstract
Pressione lucidatura è un metodo per modellare pipette di vetro per patch-clamp registrazione. In primo luogo abbiamo sviluppato questo metodo per la realizzazione di pipette adatto per la registrazione di piccole dimensioni (<3 m) corpi cellulari neuronali. Il principio di base è simile al vetro soffiato e combina la pressione dell'aria e del calore per modificare la forma di pipette di patch preparata da un estrattore micropipetta convenzionale. Può essere applicato ai cosiddetti soft (calce sodata) e difficile (borosilicato) occhiali. In generale, la lucidatura della pressione può ridurre la resistenza pipetta del 25% senza diminuire il diametro dell'apertura punta (Goodman e Lockery, 2000). Può essere applicato a qualsiasi tipo di vetro e richiede solo l'aggiunta di un valvola di alta pressione e montato su un microforge. Questa tecnica è essenziale per la registrazione da cellule ultrasmall (<5 m) e può anche migliorare singolo canale di registrazione, riducendo al minimo la resistenza pipetta. La forma smussata è utile anche per la registrazione perforata-patch clamp, perché i risultati in forma di questa punta una bozza membrana più disponibile per la perforazione.
Protocollo
Pipette tirando
Utilizzando un filamento estrattore come un Sutter P-97 Flaming Puller microelettrodo / Brown, tirare un insieme di circa 10-20 pipette.
- Seleziona il tuo bicchiere. Noi usiamo borosilicato (BF150-86-10, OD = 1,5 mm, ID = 0,86 mm). Conservare con cura il vetro in modo che rimane pulito e senza polvere.
- Progettare un programma di trazione. L'obiettivo primario è una punta di apertura circa la dimensione desiderata, che dipende dalla applicazione. Sutter P-97 Cookbook Pipettare 2 è un eccellente punto di riferimento.
- Osservate la vostra pipette al microscopio per determinare diametro di apertu....
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Discussione
Inizialmente abbiamo sviluppato questo metodo per pipette utile per patch-clamp registrazione 2-3 micron neuroni in C. elegans 1. E 'in uso di routine nel laboratorio Goodman. Noi pipette pressione smalto non solo per la registrazione da piccolo C. elegans neuroni, ma anche per l'ottenimento di registrazioni macropatch e single-channel dei canali ionici espressi in ovociti di Xenopus. Per un dato in punta di apertura del diametro, la forma smussata produce una minore resistenza pipetta. Resistenza pipett.......
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Ringraziamenti
La pressione di lucidatura tecnica è stata sviluppata in collaborazione con Lockery SR.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti | |
|---|---|---|---|---|
| Capillari di vetro | Consumabile | Sutter Instrument Co. | BF150-85-10 (o simili) | Il metodo funziona con qualsiasi tipo di capillare, tranne quelli in quarzo. Tuttavia, si consiglia di utilizzare capillari con filamento interno. |
| Microscopio invertito | Microscopio | Leica Microsystems | DM IL (o simili) | Qualsiasi microscopio invertito semplice è adeguato. È tuttavia essenziale disporre di un ingrandimento sufficiente per vedere le pipette durante la lucidatura. A tale scopo, utilizziamo un obiettivo metallografico da 100x con lunga distanza di lavoro. |
| Kit microforge | Strumento | ALA Science | CPM-2 | Fornisce bobina per lucidatura, controller e pedale. |
| Sorgente di pressione d'aria | Strumento | ALA Science | PR-60 | Accessorio per fornire alta pressione, include una valvola adatta. In alternativa, si può utilizzare l'aria compressa dell'edificio abbinata a un filtro/regolatore (impostato a 40 PSI) e a una valvola a 4 vie (vedi sotto) |
| Valvola a 4 vie | Strumento | Cole-Parmer | A-98150-01 | Saranno necessari raccordi per collegare la valvola al tubo |
| Portapipetta con connettore Luer | Strumento | World Precision Instruments, Inc. | MPH-6S20 | Utilizzare un raccordo maschio Luer-a-barb per collegare il portapipetta al tubo ad alta pressione |
| Tubazione Tygon® | Strumento | Cole-Parmer | 06408-62 | Utilizzare questa tubazione per collegare il portapipetta alla valvola a 4 vie |
Riferimenti
- Goodman, M. B., Lockery, S. R. Pressure polishing: a method for re-shaping patch pipettes during fire polishing. . J Neurosci Methods. 100, 13-15 (2000).
- Sutter Instrument, P-97 Pipette Cookbook. , Sutter Instrument. http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf (2008).
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Ristampe e permessi
