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Analisi della qualità dell'acqua tramite organismi indicatori

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Water Quality Analysis via Indicator Organisms

2.6: Community DNA Extraction from Bacterial Colonies

2.13: Culturing and Enumerating Bacteria from Soil Samples

29,376 Views

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08:17 min

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April 30, 2023

Overview

Fonte: Laboratori del Dr. Ian Pepper e del Dr. Charles Gerba -Università dell’Arizona
Autore dimostrativo: Luisa Ikner

L’analisi della qualità dell’acqua monitora le influenze antropogeniche come inquinanti, sostanze nutritive, agenti patogeni e qualsiasi altro componente che possa influire sull’integrità dell’acqua come risorsa. La contaminazione fecale contribuisce ai patogeni microbici che minacciano la salute di piante, animali e umani con malattie o malattie. L’aumento della domanda di acqua e i rigorosi standard di qualità richiedono che l’acqua fornita per le risorse umane o ambientali sia monitorata per bassi livelli di agenti patogeni. Tuttavia, il monitoraggio di ciascun agente patogeno associato all’inquinamento fecale non è fattibile, poiché le tecniche di laboratorio comportano manodopera, tempo e costi estesi. Pertanto, il rilevamento di organismi indicatori fornisce una tecnica semplice, rapida ed economica per monitorare gli agenti patogeni associati a condizioni non igieniche.

Principles

Gli indicatori sono organismi facilmente rilevabili la cui presenza è direttamente correlata a uno o più agenti patogeni che contaminano un ambiente. Per essere considerato un indicatore appropriato, un organismo deve soddisfare i cinque seguenti criteri:

L’organismo indicatore deve essere presente quando l’agente patogeno è presente e l’organismo indicatore deve essere assente quando l’agente patogeno è assente.
La concentrazione dell’organismo indicatore deve essere correlata alla concentrazione dell’agente patogeno. Tuttavia, l’organismo indicatore dovrebbe sempre essere trovato a numeri più alti.
L’organismo indicatore dovrebbe essere in grado di sopravvivere più facilmente e più a lungo nell’ambiente rispetto all’agente patogeno.
Il rilevamento per l’organismo indicatore dovrebbe essere facile, sicuro e poco costoso.
L’organismo indicatore dovrebbe essere efficace per tutti i tipi di acqua.

La maggior parte degli indicatori sono organismi enterici o virus, che si trovano comunemente nei sistemi gastrointestinali di mammiferi e aviari a sangue caldo, dando una connessione diretta alla contaminazione fecale. Tuttavia, molti indicatori possono mancare di efficacia a causa di una scarsa correlazione con alcuni agenti patogeni. Due degli organismi indicatori batterici più ampiamente accettati sono Escherichia coli e coliformi a causa dei loro legami fecali e facilità nelle analisi di laboratorio.

Colilert è un approccio DST (Defined Substrate Technology) per il rilevamento simultaneo, l’identificazione specifica e la conferma per E. coli e coliformi totali nei campioni di acqua. Questa tecnica di laboratorio utilizza nutrienti del substrato specifici per la via metabolica di ciascun organismo indicatore, enumerando solo i microrganismi desiderati, che rilasciano un segnale quando i batteri alterano il composto. In presenza di un coliforme, il nutriente orto-nitrofenil-β-D-galattopiranoside (ONPG) viene idrolizzato dall’enzima β-galattosidasi del coliforme. Il composto del prodotto, l’orto-nitrofenile, è un cromogeno che rilascia un segnale di colore, trasformando l’acqua in giallo (Figura 1).

Figura 1. Schema che mostra l’orto-nitrofenile che rilascia un segnale di colore, trasformando l’acqua in giallo.

In presenza di E. coli,il nutriente metilbebelliferil-β-D-glucuronide (MUG) viene scisso dall’enzima glucuronidasi dei batteri, producendo un prodotto metilumbelliferone che fluoresce blu-verde sotto la luce ultravioletta (Figura 2).

Figura 2. Schema che mostra il nutriente metilumbelliferil-β-D-glucuronide (MUG) scisso dall’enzima glucuronidasi dei batteri, producendo un prodotto metilumberlliferone che fluoresce blu-verde sotto la luce ultravioletta.

Colilert può essere eseguito come test di presenza-assenza (P-A) per indicare se gli organismi esistono o meno nel campione. Questo test viene completato sciogliendo il substrato in campioni di acqua da 100 ml, incubando a 35 ± 0,5 °C per 24 ore e osservando i segnali di colore. La presenza degli indicatori può anche essere quantificata utilizzando un sistema che determina il numero più probabile (MPN) per ciascun organismo. Questa procedura prevede la dissoluzione del substrato in campioni di acqua da 100 ml che vengono sigillati in un vassoio contenente 49 grandi pozzi e 48 piccoli pozzi. Il vassoio viene incubato a 35 ± 0,5 °C per 24 ore, quindi vengono contati i pozzi contenenti cambiamenti di colore positivi. Il rapporto tra pozzi grandi e piccoli contenenti segnali positivi è allineato al grafico MPN che fornisce la quantificazione per la presenza di ciascun organismo indicatore presente. Le normative per l’acqua potabile negli Stati Uniti richiedono che zero coliformi siano presenti in 100 ml di acqua potabile.

Procedure

1. Presenza di Colilert – Test di assenza (P – A)

Aprire la bottiglia di plastica Colilert da 100 ml. La bottiglia include una piccola quantità di reagente in polvere che è necessario per le reazioni corrette, non scartare questa polvere.
Aggiungere 100 ml di campione d’acqua nella bottiglia Colilert.
Aprire il tubo del cuscino contenente il substrato nutritivo e versare il contenuto nel campione d’acqua all’interno della bottiglia Colilert.
Tappare e sigillare la bottiglia Colilert. Agitare vigorosamente la bottiglia, invertendo ripetutamente la bottiglia fino a quando il substrato non è completamente sciolto.
Incubare la miscela di reagente/campione d’acqua all’interno del flacone a 35 ± 0,5 °C per 24 ore.
Osservare il cambiamento di colore giallo nella miscela di reagente/campione d’acqua. Il colore giallo indica la presente coliforme. Acqua limpida o nessun cambiamento di colore indica che i coliformi sono assenti.
Esporre il campione di reagente/acqua alla luce ultravioletta e osservare la fluorescenza blu. La fluorescenza blu indica che E. coli è presente. Nessuna fluorescenza indica che E. coli è assente (Figura 3).

Figura 3. Test P-A negativo (a sinistra), coliforme positivo (al centro) ed E. coli positivo (a destra).

2. Colilert MPN: Quanti-vassoio 2000

Aprire la bottiglia Colilert e 100 ml di campione d’acqua nella bottiglia Colilert.
Aprire il tubo del cuscino contenente substrato nutritivo e versare il contenuto nel campione d’acqua all’interno della bottiglia Colilert.
Tappare e sigillare la bottiglia Colilert. Agitare vigorosamente la bottiglia, invertendo ripetutamente la bottiglia fino a quando il substrato non è completamente sciolto.
Aprire con attenzione Quanti-tray 2000 spremendo i bordi nella parte superiore del vassoio e tirando indietro la linguetta della carta. Continuare a spremere in modo che il vassoio sia aperto.
Versare la miscela di reagente/campione d’acqua nel vassoio, quindi incubare il campione all’interno del vassoio a 35 ± 0,5 °C per 24 ore.
Osservare il cambiamento di colore giallo nella miscela di reagente/campione d’acqua. Contare il numero di pozzi grandi e piccoli che segnalano la presenza positiva per i coliformi. Il colore giallo indica la presente coliforme. Acqua limpida o nessun cambiamento di colore indica che i coliformi sono assenti.
Esporre il campione di reagente/acqua alla luce ultravioletta e osservare la fluorescenza blu. Contare il numero di pozzi grandi e piccoli che segnalano la presenza positiva per E. coli. La fluorescenza blu indica che E. coli è presente. Nessuna fluorescenza indica che E. coli è assente.
Utilizzare il foglio Quanti-tray 2000 MPN (Figura 4) per quantificare la concentrazione per ciascun organismo indicatore presente in 100 ml di acqua. Usa il foglio di calcolo per confrontare il rapporto tra pozzi positivi grandi e piccoli per enumerare la presenza di entrambi gli organismi indicatori.

Figura 4. Quanti-vassoio negativo (a sinistra), coliforme positivo (al centro) ed E. coli positivo (a destra).

L’analisi della qualità dell’acqua è fondamentale per salvaguardare l’integrità delle risorse idriche. La presenza di microrganismi indicatori è correlata alla presenza di materia fecale, che può contenere agenti patogeni che causano malattie. Gli organismi indicatori possono quindi essere utilizzati per valutare la sicurezza delle riserve idriche.

La contaminazione fecale nell’acqua rappresenta un rischio significativo per la salute di piante, animali e esseri umani, poiché i patogeni gastrointestinali vengono versati in numero molto elevato nelle feci. Tuttavia, il monitoraggio dei campioni di acqua per ogni tipo di agente patogeno unico associato all’inquinamento fecale non è fattibile. Il rilevamento degli organismi indicatori fornisce un modo semplice, rapido ed economico per rilevare la contaminazione fecale nelle risorse idriche.

Questo video illustrerà i principi alla base dell’utilizzo di organismi indicatori per valutare la qualità dell’acqua, come testare i campioni d’acqua raccolti e l’interpretazione e la quantificazione dei dati risultanti.

Per essere utilizzati come indicatore di qualità dell’acqua, gli organismi devono soddisfare cinque criteri specifici. In primo luogo, dovrebbe essere rilevabile in acqua dove è presente l’agente patogeno e assente quando l’agente patogeno è assente. In secondo luogo, il numero di organismi indicatori deve corrispondere ai livelli di agenti patogeni. Dovrebbe anche essere più duro e persistere più a lungo nell’ambiente rispetto all’agente patogeno. Infine, il rilevamento dovrebbe essere facile, sicuro ed economico ed efficace in tutti i tipi di acqua.

Due dei gruppi di indicatori batterici più comuni sono i coliformi totali e i coliformi fecali, tipicamente E. coli. I coliformi totali possono essere trovati nell’intestino dei mammiferi, ma possono anche verificarsi naturalmente nel suolo e nelle acque superficiali. I coliformi fecali sono un sottoinsieme che risiede interamente all’interno dei tratti gastrointestinali di mammiferi e uccelli e viene continuamente versato nelle feci. I coliformi sono vulnerabili agli stessi stress di molti comuni agenti patogeni intestinali, come il trattamento dell’acqua o bassi livelli di nutrienti, la loro presenza in un campione d’acqua è un utile indicatore della potenziale presenza di agenti patogeni. Sia i coliformi totali che E. coli sono prontamente rilevati in laboratorio.

Per il rilevamento, i substrati chimici vengono aggiunti al campione che i coliformi metabolizzano, con conseguente cambiamento di colore. Per i coliformi totali, l’ONPG aggiunto viene convertito in nitrofenolo, trasformando l’acqua in giallo. Per i coliformi fecali, E. coli converte MUG in un prodotto metil-umbelliferone che fluoresce blu-verde sotto la luce ultravioletta. Nella sua applicazione più semplice, il test del substrato può confermare la presenza o l’assenza di coliformi esistenti nell’acqua al momento del campionamento.

In contrasto con questo metodo qualitativo, il numero di coliformi totali per campione può essere stimato utilizzando un vassoio partizionato specializzato. Dopo che il substrato reattivo è stato sciolto, il campione d’acqua viene aggiunto a un vassoio contenente pozzi grandi e piccoli e quindi incubato. I pozzettaggio che mostrano il cambiamento di colore vengono contati e il rapporto tra pozzi piccoli e grandi che dimostrano segnali colorimetrici positivi è allineato a un grafico che indica una quantità. Le forniture di acqua potabile degli Stati Uniti devono contenere zero coliformi totali per 100 ml.

Ora che abbiamo familiarità con i principi dell’utilizzo di organismi indicatori per identificare e quantificare la contaminazione dell’acqua, diamo un’occhiata a come questo viene effettuato in laboratorio.

Una volta raccolti i campioni, portarli in laboratorio per i test. Per iniziare, apri una bottiglia di plastica da 100 ml. I flaconi possono contenere una piccola quantità di reagente di tiosolfato di sodio in polvere che viene utilizzato per garantire la neutralizzazione di qualsiasi cloro che potrebbe essere presente. Aggiungere 100 ml di campione d’acqua nella bottiglia. Aprire un tubo a cuscino contenente substrato nutritivo e versare il contenuto nel campione d’acqua all’interno della bottiglia. Tappare e sigillare la bottiglia, quindi agitare vigorosamente, invertendo ripetutamente la bottiglia fino a quando il substrato non è completamente sciolto. Quindi, incubare il flacone campione-reagente a 35 °C per 24 ore.

Osservare il cambiamento di colore giallo nella miscela campione-reagente. Il colore giallo indica che sono presenti coliformi. Nessun cambiamento di colore indica che i coliformi sono assenti. Infine, esporre la miscela campione-reagente alla luce ultravioletta e osservare. La fluorescenza blu, in combinazione con un cambiamento di colore giallo, indica che E. coli è presente. Nessuna fluorescenza indica assenza.

Il numero più probabile, o MPN, può anche essere determinato per i campioni. Aprire una bottiglia e aggiungere 100 ml di campione d’acqua. Aprire il tubo del cuscino del substrato nutritivo e versare il contenuto nel campione di acqua nella bottiglia. Tappare e sigillare la bottiglia. Agitare vigorosamente, invertendo ripetutamente fino a quando il substrato è completamente sciolto. Aprire con attenzione il vassoio spremendo i bordi nella parte superiore e tirare indietro la linguetta di carta. Applicare una pressione costante per mantenere aperto il vassoio. Versare la miscela campione-reagente nel vassoio e sigillare. Incubare il vassoio a 35 °C per 24 ore.

Osservare il cambiamento di colore nel vassoio della miscela campione-reagente. Conta il numero di grandi pozzi e piccoli pozzi che sono diventati gialli per indicare la presenza di coliformi. Quindi, esporre il vassoio del reagente campione alla luce ultravioletta e osservare la fluorescenza blu. Contare il numero di pozzi grandi e piccoli che segnalano la presenza positiva di E. coli.

Utilizzando il foglio MPN fornito, quantificare la concentrazione per ciascun organismo indicatore presente in 100 ml di acqua. Trova il numero di piccoli pozzi positivi lungo la parte superiore della tabella e il numero di grandi pozzi positivi sull’asse laterale sinistro. L’intersezione dei due fornirà una cifra che rappresenta il numero più probabile, che è il numero stimato di organismi per 100 ml.

I test di rilevamento dei coliformi totali e di E. coli vengono utilizzati per verificare la contaminazione in una varietà di campioni di acqua.

L’acqua destinata al consumo umano, o potabile, viene regolarmente testata per la contaminazione. Affinché l’acqua sia considerata sicura, dovrebbe contenere meno di 1 coliforme per 100 ml. Qui, l’acqua di un rubinetto è stata raccolta e testata per la contaminazione totale da coliformi o E. coli, come precedentemente dimostrato. I risultati hanno determinato se una fonte d’acqua era sicura per il consumo.

Un altro campione comunemente testato sono le acque reflue trattate. L’acqua deve essere testata per garantire che sia sicura per il rilascio nell’ambiente o il riutilizzo per uso umano. Poiché prima del trattamento erano previsti alti livelli di contaminazione, il campione di acque reflue grezze è stato diluito a 1:100.000. Questi campioni sono stati quindi sottoposti a test di rilevamento dei coliformi totali e di E. coli e sono stati calcolati i valori MPN. Il valore sicuro dopo l’elaborazione dovrebbe essere zero batteri indicatori rilevabili.

Hai appena visto l’introduzione di JoVE per testare la qualità dell’acqua utilizzando organismi indicatori. Ora dovresti capire come testare i campioni di acqua per E. coli e altri coliformi e come quantificare il grado di contaminazione presente. Grazie per l’attenzione!

Applications and Summary

Gli organismi indicatori sono impiegati per determinare rapidamente ed economicamente la contaminazione ambientale. I saggi Colilert vengono utilizzati per analizzare la qualità dell’acqua per fonti potabili, ricreative e di acque reflue. La qualità dell’acqua deve soddisfare gli standard legali stabiliti dall’Environmental Protection Agency (EPA) e dai dipartimenti normativi statali per essere accettata come risorsa per il consumo umano e / o ambientale.

I saggi di Colilert sono anche strategicamente utilizzati come marcatori di bilancio di massa all’interno della ricerca ambientale e questi dati possono essere analizzati insieme ad altri saggi ambientali per misurare la correlazione tra i risultati. L’esecuzione di un semplice test P-A Colilert fornisce indicazioni se un campione è contaminato, che può essere analizzato insieme ai risultati della ricerca. Se il campione P-A mostra che c’è contaminazione nell’acqua, allora i campioni di acqua utilizzati nella ricerca possono anche avere una contaminazione che porta a risultati male interpretati, mentre il vassoio MPN Quanti fornisce una quantificazione di base per la contaminazione presente. Ad esempio, gli organismi indicatori possono essere utilizzati per correlare le quantificazioni degli indicatori con il numero di agenti patogeni trovati in un campione d’acqua. Se il vassoio quantifica enumera numeri di indicatori bassi, ciò suggerisce che anche il campione di acqua dovrebbe sperimentare tendenze simili con bassi livelli di agenti patogeni.

Transcript

Water quality analysis is vital to safeguard the integrity of water resources. The presence of indicator microorganisms is correlated with the presence of fecal matter, which may contain disease-causing pathogens. Indicator organisms can therefore be used to evaluate the safety of water supplies.

Fecal contamination in water poses a significant risk to the health of plants, animals, and humans, as gastrointestinal pathogens are shed in very high numbers in the feces. However, monitoring water samples for each type of unique pathogen associated with fecal pollution is not feasible. Surveying for Indicator organisms provides a simple, rapid, and cost effective way to detect fecal contamination in water resources.

This video will illustrate the principles behind using indicator organisms to evaluate water quality, how to test collected water samples, and the interpretation and quantification of resulting data.

To be used as a water quality indicator, organisms must meet five specific criteria. First, it should be detectable in water where the pathogen is present, and absent when the pathogen is absent. Second, the number of indicator organisms must correspond with pathogen levels. It should also be tougher and persist longer in the environment than the pathogen. Finally, detection should be easy, safe, and inexpensive, and effective across all water types.

Two of the most common bacterial indicator groups are total coliforms and fecal coliforms, typically E. coli. Total coliforms can be found in the mammalian gut, but may also occur naturally in soil and surface water. Fecal coliforms are a subset that reside entirely within the gastrointestinal tracts of mammals and birds and are continuously shed in feces. Coliforms are vulnerable to the same stresses as many common gut pathogens, such as water treatment or low nutrient levels, their presence in a water sample is a useful indicator of the potential presence of pathogens. Both total coliforms and E. coli are readily detected in the laboratory setting.

For detection, chemical substrates are added to the sample that the coliforms metabolize, resulting in a color change. For total coliforms, added ONPG is converted to nitrophenol, turning the water yellow. For fecal coliforms, E. coli converts MUG to a methyl-umbelliferone product that fluoresces blue-green under ultraviolet light. In its simplest application, the substrate test can confirm the presence or absence of coliforms existing in the water at the time of sampling.

In contrast to this qualitative method, the number of total coliforms per sample can be estimated using a specialized partitioned tray. After the reactive substrate is dissolved, the water sample is added to a tray containing large and small wells, and then incubated. Wells exhibiting the color change are counted, and the ratio of small to large wells demonstrating positive colorimetric signals is aligned to a chart that indicates a quantity. US drinking water supplies must contain zero total coliforms per 100 mL.

Now that we are familiar with the principles of using indicator organisms to identify and quantify water contamination, let’s take a look at how this is carried out in the laboratory.

Once samples have been collected, bring them into the laboratory for testing. To begin, open a 100-mL plastic bottle. Bottles may contain a small amount of powdered sodium thiosulfate reagent that is used to ensure the neutralization of any chlorine that might be present. Add 100 mL of water sample into the bottle. Open a pillow tube containing nutrient substrate and pour the contents into the water sample inside the bottle. Cap and seal the bottle, then shake vigorously, repeatedly inverting the bottle until the substrate is completely dissolved. Next, incubate the sample-reagent bottle at 35 °C for 24 h.

Observe the yellow color change in the sample-reagent mixture. Yellow color indicates that coliforms are present. No change in color indicates that coliforms are absent. Finally, expose the sample-reagent mixture to ultraviolet light and observe. Blue fluorescence, in combination with a yellow color change, indicates that E. coli is present. No fluorescence indicates absence.

Most Probable Number, or MPN, can also be determined for samples. Open a bottle, and add 100 mL of water sample. Open the pillow tube of nutrient substrate and pour the contents into the water sample in the bottle. Cap and seal the bottle. Shake vigorously, inverting repeatedly until the substrate is completely dissolved. Carefully open the tray by squeezing the edges at the top and pull back the paper tab. Apply constant pressure to keep the tray open. Pour the sample-reagent mixture into the tray and seal. Incubate the tray at 35 °C for 24 h.

Observe the color change in the sample-reagent mix tray. Count the number of large wells and small wells that have turned yellow to indicate the presence of coliforms. Next, expose the sample-reagent tray to ultraviolet light and observe blue fluorescence. Count the number of large and small wells that signal positive presence of E. coli.

Using the provided MPN sheet, quantify the concentration for each indicator organism present in 100 mL of water. Find the number of small positive wells along the top of the table, and the number of large positive wells on the left side axis. The intersection of the two will give a figure representing the Most Probable Number, which is the estimated number of organisms per 100 mL.

Total coliform and E. coli detection tests are used to check for contamination in a variety of water samples.

Water that is meant for human consumption, or potable, is routinely tested for contamination. In order for water to be deemed safe, it should contain fewer than 1 coliform per 100 mL. Here, water from a tap was collected, and tested for total coliform or E. coli contamination, as previously demonstrated. The results determined if a water source was safe for consumption.

Another sample commonly tested is treated wastewater. The water must be tested to ensure it is safe for release into the environment or repurposing for human use. As high levels of contamination were expected prior to treatment, the raw sewage sample was diluted to 1:100,000. These samples were then subjected to total coliform and E. coli detection tests, and MPN values calculated. The safe value after processing should be zero detectable indicator bacteria.

You’ve just watched JoVE’s introduction to testing water quality using indicator organisms. You should now understand how to test water samples for E. coli and other coliforms, and how to quantify the degree of contamination present. Thanks for watching!