Tecnica asettica nelle scienze ambientali

La tecnica asettica è un'abilità fondamentale in microbiologia e ha applicazioni cruciali nella ricerca ambientale.

Se le colture microbiologiche sono contaminate, il tempo, la manodopera e i costi finanziari che sarebbero necessari a un laboratorio per "ripulire" o sostituire le colture, in particolare gli isolati rari provenienti da ambienti unici, potrebbero essere molto elevati e proibitivi e alcuni campioni potrebbero essere insostituibili.

L'uso corretto delle tecniche asettiche riduce la probabilità di contaminazione batterica e fungina di reagenti, terreni di coltura e campioni ambientali ed evita anche la contaminazione incrociata tra i campioni. È anche una misura di sicurezza che riduce la potenziale trasmissione di microbi allo sperimentatore, il che è particolarmente importante quando si lavora con agenti patogeni.

Questo video introdurrà i principi dell'asepsi; diverse tecniche importanti per mantenere sterili i reagenti e le colture; e infine, alcuni dei loro usi nelle scienze ambientali.

L'obiettivo dell'utilizzo di tecniche asettiche è quello di creare e mantenere un ambiente di lavoro, attrezzature e reagenti sterili, in modo da ridurre al minimo la contaminazione dei campioni biologici. Le fonti comuni di contaminazione includono i microrganismi presenti nell'aria, i microbi presenti sul banco o sull'attrezzatura del laboratorio e quelli provenienti dai capelli, dal corpo e dagli indumenti del ricercatore.

Due tipi di agenti sono fondamentali per rimuovere o prevenire la contaminazione in laboratorio: i prodotti chimici disinfettanti e il calore. Soluzioni come l'etanolo al 70% e la candeggina diluita vengono spesso utilizzate per disinfettare le attrezzature, le superfici di lavoro e i guanti degli sperimentatori prima di impegnarsi in lavori asettici.

Allo stesso tempo, i microbi su o negli strumenti, nella vetreria e nei mezzi liquidi possono essere uccisi termicamente in un'autoclave, che è una camera che sterilizza il contenuto tramite esposizione a vapore pressurizzato ad alta temperatura. Inoltre, strumenti come le barre di vetro utilizzate per la placcatura e i circuiti di inoculazione in metallo possono essere sterilizzati a caldo utilizzando una fonte di fiamma, come un bruciatore Bunsen.

L'uso di una fonte di fiamma è anche uno dei modi più comuni per creare un ambiente di lavoro asettico. Il calore della fiamma provoca la convezione dell'aria, generando una corrente ascensionale che solleva eventuali contaminanti presenti nell'aria lontano dalle vicinanze del bruciatore e creando un "campo sterile" in cui condurre un lavoro sperimentale asettico.

Ora che hai compreso i principi alla base delle tecniche asettiche e perché sono importanti, esaminiamo un protocollo per creare un ambiente di lavoro asettico, creare terreni di crescita sterili e trasferire in modo asettico i batteri tra diverse condizioni di coltura.

Prima di iniziare il lavoro asettico, è importante che lo sperimentatore indossi adeguati dispositivi di protezione individuale, o DPI. Lo scopo di questo è sia quello di impedire allo sperimentatore di contaminare i campioni e le colture di laboratorio, sia di prevenire il trasferimento di microbi potenzialmente patogeni al ricercatore. Gli articoli DPI includono un camice da laboratorio, guanti e occhiali di sicurezza.

Il passo successivo consiste nel sterilizzare e conservare correttamente i terreni di coltura da utilizzare per la coltura dei campioni microbici. Innanzitutto, pesare la quantità corretta di componenti del mezzo solido e aggiungerli al volume appropriato di solvente liquido specificato dal produttore, come l'acqua deionizzata, in un contenitore autoclavabile Aggiungere un'ancoretta magnetica, posizionare il contenitore su un agitatore a piastra calda e sciogliere i componenti del mezzo solido a fuoco basso e mescolando.

Chiudere i contenitori del mezzo. Se si utilizza un recipiente di vetro con tappo a vite, assicurarsi di non serrare completamente il tappo, poiché l'aria all'interno dei recipienti si espanderà a causa del riscaldamento durante la sterilizzazione in autoclave e dovrà fuoriuscire. Senza scampo, il gas potrebbe causare la rottura del recipiente. Mettere un pezzo di nastro adesivo per autoclave sui recipienti e sterilizzare in autoclave il supporto secondo le istruzioni del produttore, ad esempio 20 minuti a 121 °C. Dopo la sterilizzazione in autoclave, verificare che le strisce sui nastri dell'autoclave siano diventate nere, indicando che è stata raggiunta la temperatura corretta.

Per i terreni di crescita liquidi, lasciarli raffreddare a temperatura ambiente e conservarli a temperatura ambiente o in frigorifero, a seconda dei casi. Per i terreni di crescita solidi a base di agar, lasciarli raffreddare a circa 50 ? C, quindi versare in piastre di Petri sterili. Lasciare raffreddare e solidificare l'agar agar prima di riporlo alla temperatura appropriata.

Per i terreni che non possono essere sterilizzati in autoclave a causa della presenza di componenti sensibili al calore, sterilizzare con filtro utilizzando un filtro da 0,22 m.

Una tecnica fondamentale nel lavoro microbiologico consiste nel trasferire in modo asettico colture batteriche tra diversi mezzi di crescita, sia solidi che liquidi. Prima di iniziare, pulire la superficie del banco da laboratorio con un disinfettante. Ciò riduce il rischio di contaminare colture o terreni sterili.

Il trasferimento di colture batteriche fa comunemente uso di uno strumento chiamato ansa di inoculazione, che deve essere sterilizzato prima dell'uso riscaldandolo in una fiamma.

Accendi una fonte di fiamma. Passare lentamente l'anello di inoculazione attraverso la punta della fiamma. Il ciclo diventerà rovente. Per trasferire una colonia batterica da una piastra di agar solida, aprire leggermente la piastra di Petri e picchiettare delicatamente l'ansa di inoculazione calda su una parte vuota della superficie dell'agar per evitare di uccidere i batteri con il calore. Raschiare una singola colonia con l'ansa di inoculazione e chiudere la piastra.

Per trasferire i batteri da un mezzo di coltura liquido, rimuovere il tappo dal contenitore di coltura. Per aiutare a prevenire la contaminazione, evitando di appoggiare il tappo sul banco. Passare la bocca del contenitore 2-3 volte attraverso la parte più calda della fiamma. Quindi, toccare con cura l'anello di inoculazione caldo e sterilizzato all'interno del contenitore e lasciarlo raffreddare prima di inserirlo nella coltura del brodo. Rimuovere un anello della coltura e chiudere immediatamente il tappo.

Per trasferire i batteri ottenuti in un terreno di coltura sterile, rimuovere il tappo da un contenitore con il brodo sterile e passare l'apertura del contenitore attraverso la fiamma 2-3 volte. Quindi, abbassare con cautela l'ansa di inoculazione nel terreno e agitare delicatamente per rilasciare i batteri. Chiudere immediatamente il tappo. Sterilizzare l'ansa di inoculazione dopo l'uso.

Se si trasferiscono i batteri su una piastra di agar sterile, aprire il coperchio di una piastra di Petri fresca con agar non inoculato. Striare il ciclo di inoculazione con la coltura batterica avanti e indietro su un settore dell'agar. Sterilizzare l'anello e raffreddarlo toccando una parte vuota dell'agar, quindi fare un'altra striscia sull'agar con un angolo ottuso rispetto alla prima striscia, assicurandosi di incrociare la prima striscia sui primi 1-2 colpi ma evitando di toccare la prima striscia sui colpi successivi. Ripetere la sterilizzazione e lo striature altre 2 volte. Chiudere la piastra di Petri e sterilizzare l'ansa di inoculazione.

Una volta inoculato, il brodo o la piastra di agar devono essere incubati alla temperatura di crescita ideale per il microrganismo in questione per ottenere una coltura vitale. Su terreno solido, un prato o un filamento continuo di batteri sarebbe visibile sull'agar coperto dalle prime due striature, ma le singole colonie dovrebbero essere ottenute sulla striscia finale. Tecniche asettiche scadenti provocherebbero la crescita di muffe e altri contaminanti sulla piastra.

Le tecniche asettiche sono importanti in molti esperimenti che coinvolgono campioni microbici provenienti dall'ambiente. In questo studio, i ricercatori hanno isolato i batteriofagi, che sono virus che infettano i batteri, dal comune batterio del suolo Arthrobacter. Le colture di Arthrobacter sono state inizialmente coltivate in condizioni asettiche. I campioni di terreno sono stati quindi lavati e filtrati in tampone fagico e la soluzione fagica è stata mescolata con la coltura batterica e placcata su piastre di agar. Sulla piastra si formerebbe un prato batterico, ma ci sarebbero delle radure, o "placche", nei punti in cui il virus aveva infettato e ucciso i batteri. I fagi potrebbero quindi essere purificati da queste placche per ulteriori studi.

Oltre all'utilizzo di bruciatori Bunsen, gli ambienti di lavoro asettici possono essere mantenuti anche in postazioni di lavoro specializzate note come cappe a flusso laminare, che utilizzano un flusso d'aria diretto e filtri per mantenere la sterilità. Qui, gli scienziati hanno lavorato in una cappa di flusso per isolare potenziali batteri e virus patogeni da campioni d'acqua. Questi isolati sono stati poi coltivati insieme alle amebe. Poiché le amebe normalmente mangiano o "fagocitano" i batteri, qualsiasi batterio che è stato in grado di resistere alla digestione amebale, e rimanere in questi organismi, può anche potenzialmente rimanere vitale nelle cellule umane e causare malattie.

Infine, le condizioni sterili consentono uno studio dettagliato dei meccanismi ecologici come la formazione di noduli radicali nelle piante leguminose - organi pieni di batteri che "fissano" l'azoto atmosferico in ammoniaca, che viene utilizzata dalla pianta per la crescita. I ricercatori hanno creato "microcosmi" per studiare il processo di nodulazione utilizzando piastre di Petri dentellate con terreno di coltura delle piante, vi hanno inserito piantine e inoculato le piantine con batteri rizobiali che formano noduli. L'ambiente asettico della cappa a flusso impedisce la contaminazione delle colture con altri batteri o funghi.

Hai appena visto il video di JoVE sulle tecniche asettiche nelle scienze ambientali. Ora dovresti capire perché le condizioni di lavoro asettiche sono importanti; come eseguire in modo asettico esperimenti microbiologici; e alcune applicazioni di tecniche asettiche alla ricerca ambientale. Come sempre, grazie per la visione!