Analisi di fisiologica E-selectina-mediata rotolamento dei leucociti sull'endotelio microvascolari

Questo video mostra l'analisi della camera di flusso a piastre parallele per esaminare i fattori che innescano il rotolamento dei leucociti sulle superfici delle cellule endoteliali. I monostrati di cellule endoteliali sono stimolati con la citochina pro-infiammatoria IL one beta per sovraregolare l'espressione della S selectina. La camera di flusso a piastre parallele viene quindi posizionata sopra le cellule endoteliali e i leucociti positivi alla selectina S vengono infusi sul monostrato.

Le interazioni cellulari nella camera sono quindi impartite con uno stress puro che è simile a quello dell'adesione post capillare es leucocitaria. Gli eventi in sequenza vengono acquisiti ed enumerati utilizzando elementi NIS e un test per l'indipendenza della selezione E. Ciao, sono George Weis nel laboratorio del Dr.Charles de Nitro nel Dipartimento di Dermatologia del Brigman Women's Hospital, Harvard Medical School.

Oggi vi mostreremo una procedura per analizzare il ruolo della e selectina, ligandi della E selectina nell'adesione dei leucociti umani alle cellule endoteliali del midollo osseo umano in condizioni fisiologiche di flusso sanguigno. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare il ruolo delle molecole di superficie cellulare che avviano l'adesione dei globuli bianchi o delle cellule tumorali metastatiche alle cellule endoteliali, che rivestono la superficie interna dei vasi sanguigni. Questo evento adesivo è caratterizzato da un comportamento di rotolamento come una palla da bowling che rotola lungo una corsia.

Quindi iniziamo. Il primo passo di questa procedura è la preparazione delle cellule endoteliali che rivestiranno la camera di flusso. Questo protocollo utilizza cellule H-B-M-E-C 60 derivate dal midollo osseo umano.

piastre per colture microvascolari devono essere pre-rivestite con fibronectina per preparare queste piastre per colture tissutali da 35 millilitri con PBS contenenti 20 microgrammi per mil di fibronectina. Questi possono essere incubati durante la notte a quattro gradi Celsius o per tre ore a 37 gradi Celsius. Sospendi 60 cellule H-B-M-E-C nel terreno 1 99 e semina da 10 a 5 cellule per piatto, fai crescere le colture a oltre il 90% di confluenza.

Ci vorranno circa due giorni per aumentare la selezione e l'espressione di aspirare il terreno di crescita e aggiungere terreno fresco con 50 nanogrammi per mil di IL un beta incubare per quattro o sei ore. I monostrati cellulari sono ora pronti per il saggio in camera di flusso. Ulteriori piastre di cellule H-B-M-E-C 60 possono essere stimolate con IL one beta e trattate con anticorpi neutralizzanti anti-selezionina umana a 20 microgrammi per mil per un'ora a 37 gradi Celsius.

Questo controllerà l'espressione funzionale della e selectina. Successivamente, prepara i leucociti e selectina positivi. Si tratta di KG una cellula progenitrice ematopoietica umana.

Questi vengono coltivati in sospensione fino alla confluenza o tendono alle sei cellule per mil in RPMI 1640. Le cellule KG uno A possono essere pipettate direttamente dalla coltura e contate su un emocitometro. Resus sospendere le cellule a 10-6 cellule per mil in HBSS con 10 millimolari di hep o tampone HH che contiene due millimolari di cloruro di calcio.

Conservare le cellule in ghiaccio fino al momento del saggio. I passaggi successivi prevedono la preparazione del microscopio, della camera di flusso a piastre parallele e della pompa a siringa. Per il test accendere il microscopio e la pompa a siringa.

Selezionare l'obiettivo 10 x sul microscopio. Inserire una provetta conica da 50 millilitri nel supporto e riempirla con tampone HH con due millimolari di cloruro di calcio. Quindi posizionare le provette di plastica da cinque millilitri nel supporto sottostante.

Quindi, inserire una siringa da 60 millilitri nella pompa a siringa. Assicurarsi che sia lo stantuffo che il corpo della siringa siano saldi. Collegare un rubinetto di arresto a tre vie all'estremità della siringa da 60 mil e quindi una siringa da cinque mil al rubinetto di arresto a tre vie.

Posizionare l'apparecchio a camera di flusso parallelo sul tavolino del microscopio con il tubo di ingresso sul tubo di uscita destro a sinistra e il tubo a vuoto nella parte posteriore. Dopo che il tubo è stato collegato al vuoto, aprire la valvola dell'aria per consentire all'apparecchio a piastre parallele di aderire al tavolino. Questo verificherà se il mantello del vuoto sulla camera di flusso è ermetico.

Quando la tenuta è confermata, chiudere la valvola dell'aria. Collegare ora la linea del tubo di uscita al rubinetto di arresto a tre vie già collegato alla siringa. L'apparecchio è ora pronto per essere posizionato sopra le celle H-B-M-E-C 60

Accendere l'aspirapolvere, abbassare delicatamente l'apparecchio della camera di flusso sulla piastra e lasciare che l'apparecchio aspiri verso il basso. Non dovrebbero esserci rumori di fuoriuscita d'aria e a questo punto potrebbe essere necessario applicare pressione alla camera per comprimere la guarnizione in gomma. Una volta stabilito il vuoto, posizionare il tubo di ingresso nel tubo conico da 50 millilitri.

Aprire il rubinetto di arresto a tre vie della siringa da 60 mil e posizionare la pompa in modalità pompa per rimuovere l'aria dalle linee senza sollevare le celle sulla piastra. Utilizzare la pompa a siringa impostata a due mil al minuto per riempire il tubo di aspirazione. Quindi impostare rapidamente a 0,5 mil al minuto.

Poco prima che il fluido raggiunga l'apparato, è fondamentale adescare con cura la configurazione ed evitare bolle d'aria, che solleveranno il monostrato dalla piastra. Una volta che il fluido si sposta nella siringa da 60 mil, la camera di flusso e la pompa a siringa vengono innescate. A questo punto, fissare il flusso nella camera al tavolino con un pezzo di nastro adesivo su ciascuna delle linee di ingresso, uscita e vuoto.

Ciò garantisce che il campo visivo rimanga costante durante la visualizzazione e la raccolta dei dati. La camera di flusso è ora pronta per l'uso. Questi passaggi devono essere ripetuti per ogni ciclo di ingresso della cella e per ogni nuova piastra.

Per catturare gli eventi di rotazione del sito Lucas, apri gli elementi NIS sul desktop, premi l'icona di riproduzione per un'immagine dal vivo. L'esposizione automatica ti permetterà di vedere la lastra e di mettere a fuoco l'immagine. Assicurarsi che il microscopio sia messo a fuoco correttamente sul monostrato cellulare regolando manualmente la messa a fuoco sul microscopio.

Una volta che l'immagine è a fuoco, reimpostare l'esposizione a un fotogramma al secondo e regolare la luce sul microscopio. L'immagine dovrebbe apparire sul computer e non dovrebbe più essere visibile al microscopio. L'istogramma della luce può quindi essere regolato Per rimuovere l'esposizione dello sfondo o per migliorare la nitidezza delle celle, fare clic su Raccoglitore due per due o Raccoglitore dinamico per ottenere un'immagine ideale per l'acquisizione di filmati.

Fare clic sulla macro sulla barra dei menu e selezionare a destra per la porta, selezionare la porta com tre e aprire. Questo apre la porta per coordinarsi con la pompa a siringa. La camera di flusso è ora pronta per essere infusa con una pipetta di celle KG 1 A, un mil di sospensione KG one A S nella provetta da cinque mil vicino alla linea del tubo di ingresso.

Quindi posizionare la linea di ingresso sul fondo della provetta. Vai alla barra dei menu e fai clic su acquisizione e acquisizione time lapse. Selezionare il protocollo della durata di 210 secondi.

Questa è la lunghezza del programma per la laminazione su celle H-B-M-E-C 60. Ogni fase è programmata per scattare una foto ogni secondo per tutta la durata del protocollo della pompa. È inoltre predisposto per inviare un comando attraverso la porta di comunicazione tre per avviare la pompa.

Impostare la pompa a siringa sulla modalità di programmazione, che consente la programmazione manuale di portate specifiche. Questo determinerà i livelli di stress all'interno della camera e determinerà le interazioni tra le celle KG 1 A e le celle H-B-M-E-C 60. Le impostazioni per queste interazioni sono 4,2 cene per centimetro quadrato per 45 secondi.

Punto tre cenini per centimetro quadrato per 60 secondi e passo avanti aumenta ogni 15 secondi fino a un massimo di 4,2 cenini per centimetro quadrato. Il microscopio e il computer sono ora pronti per catturare la fotografia time lapse. Premere start run sul computer per iniziare ad acquisire dati durante l'esecuzione del programma.

Assicurarsi di aggiungere il fluido al tubo contenente celle KG uno A per mantenere il tubo di uscita di ingresso pieno di fluido e per evitare che bolle d'aria entrino nel sistema. Se il time lapse viene interrotto, la pompa non si fermerà da sola e dovrà essere ripristinata. Premere Annulla per tornare all'immagine dal vivo.

Un monostrato di cellule endoteliali non stimolato funge da controllo negativo per questo esperimento. Per fare ciò, infondere leucociti KG one A nella camera di flusso su cellule H-B-M-E-C 60 non trattate per controllare l'indipendenza e, stimolare il monostrato di cellule endoteliali con IL one beta e infondere i leucociti su queste cellule per controllare ulteriormente l'indipendenza dell'eect. Trattare le cellule H-B-M-E-C 60 con IL one beta e poi con anticorpo anti-selectina S umana.

Quindi analizza gli eventi di rollio dei leucociti su queste cellule. Il rollio cellulare non è determinato solo dalla S selectina, ma anche dai residui di acido slic sulla superficie cellulare dei leucociti. Per dimostrarlo, digerire le cellule KG uno A con 0,1 unità per mil neuraminidasi per un'ora a 37 gradi Celsius.

Quindi analizzare gli eventi di rotolamento su cellule H-B-M-E-C 60 stimolate. Anche le glicoproteine sulla superficie dei leucociti sono importanti per il rollio cellulare. Ciò può essere dimostrato trattando le celle KG uno A con 0,2 unità per mil broma lane per un'ora a 37 gradi Celsius, e quindi infondendole nella camera di flusso.

Dopo l'acquisizione della sequenza temporale, i dati sono pronti per l'analisi. Salva i dati e vai alla scheda di misura sulla barra dei menu e seleziona la soglia definita. Sposta le barre in modo che le celle desiderate siano colorate in rosso, seleziona tutte le immagini e poi ok, l'intera sequenza time-lapse dovrebbe ora essere modificata con celle rosse visibili.

Vai alla misurazione e seleziona le restrizioni. Ciò consente all'utente di escludere gli oggetti di soglia che non rappresentano celle in scorrimento. Si tratta principalmente di uno sfondo creato dall'area di selezione monostrato H-B-M-E-C 60 e di valori minimi e massimi in ingresso, ideali per i leucociti in rotolamento.

Ripetere questo passaggio per l'allungamento e la circolarità Selezionare la misura e quindi selezionare Crea binario utilizzando le restrizioni. Gli stessi valori di restrizione, che sono stati impostati nel passaggio precedente, saranno ora utilizzati per ottimizzare il software degli elementi NIS per il riconoscimento dei leucociti rotanti sul monostrato delle cellule endoteliali. Torna a misurare, seleziona i dati del campo, quindi seleziona Ripristina dati.

Chiudere il menu, tornare alla misurazione e selezionare il campo di scansione, aprire i dati del campo di misurazione e selezionare il numero o gli oggetti. Quindi seleziona tutti i campi ed esporta i dati in Microsoft Excel. Infine, seleziona cancella dati.

Gli elementi NIS sono ora pronti per una maggiore raccolta di dati. Questi dati rappresentativi mostrano come le interazioni tra le cellule endoteliali leucocitarie rispondano allo stress fisiologico, testando in particolare il ruolo del ligando adesivo. E selezionando.

Il robusto rollio leucocitario si verifica quando le cellule endoteliali sono prestimolate con IL one beta. Confrontando questo risultato con il controllo non stimolato, è chiaro che il rotolamento cellulare dipende dalla stimolazione delle citochine. Trattando le cellule H-B-M-E-C 60 con IL one beta e poi con l'anticorpo anti-selectina E umana, diventa chiaro che il rotolamento cellulare dipende specificamente dalla e selectina.

Questo test può essere utilizzato anche per testare altri parametri. Ad esempio, quando le cellule stimolate vengono pretrattate con un sase o con brolin, i risultati sono meno robusti. Questi dati evidenziano l'importanza dei residui terminali di acido slic e delle glicoproteine della superficie cellulare.

Per l'attività del ligando della selectina S, vi abbiamo appena mostrato come analizzare le interazioni adesive basate sulla selectina tra leucociti e cellule endoteliali in condizioni che imitano le forze presenti in un veniale post capillare, la regione del sistema circolatorio in cui i leucociti lasciano il sangue ed entrano nei tessuti. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di utilizzare l'anticorpo bloccante appropriato o il controllo del trattamento enzimatico per convalidare la necessità della rispettiva selectina e del suo ligando in questo sistema di analisi. Quindi questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.