Name: Analisi di fisiologica E-selectina-mediata rotolamento dei leucociti sullendotelio microvascolari (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-11T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 16 s
Description: Scopri l'analisi della camera a flusso a piastre parallele per studiare il rotolamento dei leucociti mediato da E-selectina sull'endotelio microvascolare. Questo metodo permette di investigare le interazioni leucocito-endotelio sotto stress di taglio fisiologico.

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Il finanziamento per questo progetto è stata fornita da un americano Society Scholar Award Cancer Research, (06-024-01-CSM di Charles J. Dimitroff), un National Institutes of Health / National Cancer Institute di sovvenzione (RO1CA118124 di Charles J. Dimitroff) e uno National Institutes of Health / National Institute of Arthritis e muscolo-scheletrico e malattie della pelle di sovvenzione (P30 AR042689 il Dr. Thomas S. Kupper, Brigham and Women Hospital, Boston, MA).

1. Preparazione di hBMEC (HBMEC-60 Cell) monostrato in piastre di Petri per camera di flusso <ol><li> Cappotto 35 x 10 millimetri di coltura tissulare piatti con 2 ml di fibronectina 20μg/ml (in PBS) notte a 4 ° C o per 3 ore a 37 ° C. </li><li> Aspirare soluzione fibronectina da piatti e aggiungere 1,5 x10-5 HBMEC 60 celle [Medium 199 con HEPES e glutammina, 10% FBS, 10% siero umano, 5 unità / ml di eparina, 1ng/ml umano ricombinante del fattore di crescita dei fibroblasti, 1% di penicillina- streptomicina] per il piatto e permettere loro di crescere fino a confluenza&gt; 90%. (Questo richiede 2 giorni) </li><li> Aspirare terreni di crescita e, in up-regolazione dell&#39;espressione E-selectina, aggiungere mezzo fresco con 50ng/mL IL-1β per 4-6 ore. Monostrati cellulari sono ora pronti per la laminazione del saggio. Per bloccare la funzione E-selectina, neutralizzanti anti-umano E-selectina Moab (clone BBIG-E4 (5D11)) possono essere aggiunti in 20μg/ml per ~ 1 ora a 37 ° C. </li></ol> 2. Preparazione di cellule progenitrici emopoietiche umane KG1a per camera di flusso <ol><li> Umane ematopoietiche cellule progenitrici KG1a sono cresciuto fino a confluenza (1x10 6 cellule / ml) in RPMI-1640 con la glutamina e il 10% FBS / 1% di penicillina-streptomicina e vengono aggiunti direttamente dal pallone per l&#39;uso in test di flusso da camera. </li><li> Numero di cellulare è calcolato utilizzando un emocitometro e poi le cellule sono risospese in 1 x 10 6 cellule / ml in HBSS con 10mM HEPES (H / H Buffer) e 2mM CaCl 2 </li><li> Le cellule sono conservati in ghiaccio fino al momento dell&#39;uso in test. </li></ol> 3. Preparazione del Microscopio, Parallel-Plate Chamber portata e di pompa a siringa (Figura 1) <img src="/files/ftp_upload/old/1009_2009_1_26_7/1009_figure1.png" alt="Figura 1" width="600" height="409" /> Figura 1. Illustrazione di Parallel-Plate Analisi dei flussi Camera. Microscopio invertito, Harvard pompa a siringa, computer / macchina fotografica e piatti paralleli camera di flusso sono collocati in una disposizione ottimale per l&#39;analisi cellulare efficiente e riproducibile. <ol><li> Accendere e fonte di luce per microscopio invertito e il potere di pompa a siringa e selezionare l&#39;obiettivo 10X sul microscopio. </li><li> Luogo 50mL tubo conico in porta e riempire con H / H e 2mM CaCl 2. </li><li> Mettere 5 ml provette di plastica in portaprovettoni sotto il tubo 50mL conica </li><li> Luogo siringa da 60 ml a pompa a siringa (Assicurarsi che sia lo stantuffo della siringa e del corpo sono entrambi protetti). </li><li> Allega 3-way rubinetto alla fine della siringa da 60 ml e attaccare la siringa 5 ml di 3-way rubinetto. </li><li> Posto in parallelo Camera apparato di flusso (GlycoTech, Inc.) sul palco microscopio con tubo di ingresso a destra, il tubo di uscita a sinistra e tubo a vuoto alla schiena. </li><li> Collegare il tubo a vuoto per vuoto e la valvola aperta per consentire apparato piastra parallela di aderire al palco. (Questo test se la gonna a vuoto sulla camera di flusso è a tenuta d&#39;aria.) Spegnere valvola dell&#39;aria. </li><li> Collegare il tubo linea di uscita (a sinistra del microscopio) a 3-way rubinetto. Apparecchio è ora pronto per l&#39;immissione sul HBMEC-60 piastre monostrato. </li><li> Luogo HBMEC-60 piastra monostrato e posto sul centro del microscopio. </li><li> Accendere il vuoto e la posizione dell&#39;apparato camera di flusso sopra la piastra in modo che la piastra monostrato si trova nel centro. </li><li> Abbassare delicatamente l&#39;apparato camera di flusso sul HBMEC-60 piastre monostrato e permettono camera apparato flusso di aspirazione verso il basso. (Non ci dovrebbero essere i suoni di aria che fuoriesce e, a questo punto potrebbe essere necessario applicare una pressione alla camera per comprimere la guarnizione di gomma.) </li><li> Una volta vuoto è stato stabilito, ingresso tubo posto (a destra) nel tubo 50mL conica contenente H / H con 2mM CaCl 2. </li><li> Aperto a 3 vie rubinetto per consentire il flusso all&#39;interno della siringa da 60 ml e la pompa posto in &quot;modalità pompa.&quot; </li><li> Per eliminare l&#39;aria da ingresso / uscita senza sollevare le cellule sulla piastra, utilizzare la pompa a siringa fissato a 2mL/minute per riempire il tubo di aspirazione, poi impostare rapidamente a 0,5 ml / minuto appena prima il liquido raggiunge l&#39;apparato. E &#39;imperativo per primo questo set con cautela ed evitare bolle d&#39;aria che alzerà il monostrato dal piatto. </li><li> Una volta fluido è visto spostare nella siringa da 60 ml, la camera di flusso e pompa a siringa è stato innescato e la camera di flusso è pronto per l&#39;uso. Questo set up verrà ripetuta per ogni corsa cella di input e per ogni nuova piastra necessario. </li></ol> 4. Acquisizione di leucociti Eventi di Rolling utilizzando elementi NIS <ol><li> Aprire NIS Elements sul desktop. </li><li> Premere l&#39;icona &quot;play&quot; per l&#39;immagine live. Esposizione automatica ti permetterà di vedere il piatto più semplice per ora e &#39;importante per la messa a fuoco. </li><li> Assicurarsi che microscopio si concentra correttamente sul monostrato cellulare. </li><li> Una volta concentrata, re-impostare l&#39;esposizione a 1 luce fotogrammi / secondo e regolare sul microscopio. L&#39;immagine dovrebbe comparire sul computer e non sarà più visibile nel mirino microscopio a causa del livello di scarsa illuminazione. Istogramma della luce può essere annuncioportato alla giusta rimuovere esposizione dello sfondo o migliorare la chiarezza delle cellule. </li><li> Clicca su bin 2X2 o Bin Live per ottenere un&#39;immagine che è l&#39;ideale per la registrazione di filmati </li><li> Clicca su &quot;macro&quot; sulla barra dei menu e selezionare &quot;scrivi a porta&quot;, selezionare la porta &quot;COM3&quot; e &quot;aperto&quot;. (Questo apre la porta a coordinarsi con la pompa a siringa. </li><li> Pipettare 1 ml di sospensione cellulare KG1a nella provetta 5 ml vicino alla linea di tubi d&#39;ingresso e poi posto tubi linea di ingresso al fondo della provetta. </li><li> Vai alla barra dei menu, cliccare su &quot;Capture&quot;, &quot;time-lapse acquisizione.&quot; </li><li> Un nuovo menu pop-up. Selezionare il secondo protocollo della durata di 210, questa è la durata del programma per la laminazione a HBMEC-60 celle. (Ogni fase è programmata per scattare una foto ogni secondo per tutta la durata del protocollo pompa. E &#39;inoltre configurato per inviare un comando tramite la porta COM3 per avviare la pompa.) In caso di time-lapse è interrotto, la pompa non si ferma da solo e deve essere ripristinato. Premere Annulla per tornare a vivere immagine. </li><li> Impostare la pompa a siringa a &quot;Modalità di programma&quot;, secondo il manuale di istruzioni. (Modalità di programmazione permette una programmazione manuale delle portate specifiche (ad esempio i livelli di stress di taglio) di essere impartito all&#39;interno della camera e dettare le interazioni delle cellule KG1a il monostrato HBMEC-60 cell.) Impostazioni per cellulari KG1a rotola su cellule hBMEC sono stati i seguenti 4,2 dyne / cm 2 per 45 s, 0,3 dyne / cm 2 per 60 s, ed aumenta gradualmente ogni 15 s ad un massimo di 4,2 dyne / cm 2 </li><li> Muro sforzo di taglio (W st) nella camera è stato calcolato secondo la seguente equazione: W st = 6μQ / a 2 b, dove μ è la viscosità stima dei media (0,0076 P), Q è la portata volumetrica in ml / s, una è l&#39;altezza del canale (spessore della guarnizione) in cm (0,03 cm) e b è la larghezza del canale in cm (0,5 cm). Le portate sono state regolate utilizzando la modalità programma della pompa a siringa. </li><li> Microscopio e computer sono ora pronti a catturare time-lapse fotografia. Premere il tasto &quot;Start Esegui&quot; sul computer per iniziare l&#39;acquisizione dati. Durante l&#39;esecuzione del programma, assicurarsi di aggiungere supporto per la provetta contenente le cellule KG1a al fine di mantenere l&#39;ingresso / uscita tubi pieni di media (Assicurarsi che non ci siano bolle d&#39;aria). </li></ol> 5. Dipendenza della Sialylation Terminale e Glicoproteina di superficie per E-selectina-mediato dalle cellule KG1a 5. Laminazione (Figura 2; Clip Video di 5,1-5,5) <ol><li> Saggio della cellula KG1a rotolamento sulla non-stimolata HBMEC-60 cellule. (Controllo negativo), le cellule KG1a sono stati preparati e infuse nella camera di flusso nel vivo non-IL-1β-stimolata HBMEC-60 come descritto sopra. </li><li> Saggio della cellula KG1a rotolamento su HBMEC-60 cellule pre-trattati con IL-1β. (E-selectina-dipendenza di controllo) KG1a cellule sono state preparate e infusa nella camera di flusso su vivere IL-1β-stimolata HBMEC-60 come descritto sopra. </li><li> Saggio della cellula KG1a rotolamento su HBMEC-60 cellule pre-trattati con IL-1β e poi neutralizzanti anti-umano E-selectina Moab. (E-selectina-dipendenza di controllo) KG1a cellule sono state preparate e infusa nella camera di flusso su vivere IL- 1β-stimolato HBMEC-60 pretrattati con neutralizzanti anti-umano E-selectina moab come descritto sopra. </li><li> Saggio della sialidasi-digerito cellule KG1a rotolamento su IL-1β-stimolata HBMEC-60. KG1a cellule pretrattate con 0.1U/ml Vibrio neuraminidasi Cholerae per 1 ora a 37 ° C sono stati preparati e infuse nella camera di flusso su vivere IL-1β-stimolata HBMEC-60 come descritto sopra. </li><li> Saggio della proteasi digerito cellule KG1a rotolamento su IL-1β-stimolata HBMEC-60. Cellule KG1a pretrattati con proteasi, bromelina 0.2U/ml per 1 ora a 37 ° C, sono stati preparati e infuse nella camera di flusso su vivere IL-1β-stimolata HBMEC-60 come descritto sopra. </li></ol> 6. Analisi di NIS-Elements-Catturato Cellule KG1a e grafico di Cell KG1a dati di Rolling <ol><li> Dopo la sequenza temporale viene acquisita, salvare i dati. </li><li> Vai alla scheda &quot;misura&quot; nella barra dei menu e selezionare &quot;definire soglia.&quot; Spostare le barre in modo che le cellule desiderate sono colorati in rosso. Selezionare &quot;tutte le immagini&quot; e poi &quot;Ok&quot;. L&#39;intero time-lapse sequenza dovrebbe ora essere modificato con visibile globuli rossi al rotolamento. </li><li> Vai su &quot;Misura&quot; e seleziona &quot;restrizioni&quot;. (Restrizioni consentire all&#39;utente di escludere gli oggetti thresholded che non rappresentano cellule di rotolamento. Questo è principalmente sfondo creato dal HBMEC-60 monostrato.) Selezionare &quot;area&quot; e min di ingresso e valori massimi per l&#39;area per le cellule di rotolamento. Ripetere questo passaggio per &quot;allungamento&quot; e &quot;circolarità&quot;. </li><li> Selezionare &quot;misura&quot; e selezionare &quot;creare binario utilizzando le restrizioni&quot;, e impostare i valori di restrizione per ottimizzare NIS-Elements software di riconoscimento delle cellule che rotola su monostrato di HBMEC-60 cellule. </li><li> Torna alla &quot;misura&quot;, selezionare &quot;i dati di campo&quot;, quindi selezionare &quot;Dati reset&quot;. Chiudere questo menu. </li><li> Torna a &quot;misura&quot; e seselezionare &quot;campo di scansione&quot;. </li><li> Aperto &quot;Misura&quot;, &quot;Campo dati&quot;, selezionare &quot;numero o oggetti&quot; e poi selezionare &quot;tutti i campi&quot; ed esportare dati in Microsoft Excel. </li><li> Selezionare &quot;dati chiari&quot; per preparare NIS-Elements acquisizione di cellule per la prossima raccolta dei dati. </li></ol> Risultati: <img src="/files/ftp_upload/old/1009_2009_1_26_8/1009_figure3.png" alt="Figura 3" width="600" height="382" /> Figura 3. Parallel-Plate Chamber Analisi del flusso di E-selectina-Binding attività sulle cellule KG1a. KG1a cellule trattate con sialidasi o proteasi sono stati analizzati per la laminazione efficienza su monostrati di HBMEC-60 cellule pre-trattati con IL-1β. Controllo negativo rotolamento esperimenti sono stati condotti anche attraverso l&#39;analisi delle cellule KG1a rotolamento sulla non-IL-1β-stimolata HBMEC -60 cellule o su IL-1β-stimolata HBMEC-60 cellule trattate con neutralizzanti anti-umano E-selectina Moab (5D11). Frequenze di laminazione delle cellule sono stati eseguiti in triplice copia ed analizzati con NIS-Elements. (* Significatività statistica p &lt;0,001) In questo video basato su report, abbiamo fornito una rappresentazione visiva di come analizzare i leucociti - le interazioni delle cellule endoteliali in condizioni fisiologiche sollecitazioni di taglio. In particolare, abbiamo analizzato il ruolo di E-selectina - E-selectina ligandi nella mediazione tethering leucociti e laminazione, un comportamento adesivo necessaria per l&#39;impegno dei secondaria attività più stabile legame attraverso i recettori, come le integrine e recettori acido ialuronico. Utilizzando il parallelo-piastra camera di flusso concepiti per essere utilizzati con un microscopio invertito, Harvard pompa a siringa, videocamera e computer / cellulare hardware di acquisizione, abbiamo condotto esperimenti in cui E-selectina ligando + cellule KG1a sono state usate come il nostro modello di leucociti e cellule hBMEC (HBMEC- 60) stimolati con citochine pro-infiammatorie, IL-1β, sono state usate come la nostra E-selectina + modello umano delle cellule endoteliali (1-6). Come riportato in precedenza, abbiamo osservato robusta cellula KG1a rotolamento su IL-1β-stimolata HBMEC-60 cellule in un range di livelli di stress di taglio in modo E-selectina-dipendente (Figura 3) (differenza statisticamente significativa se confrontata con cella KG1a rotola su non-IL-1β HBMEC-60 stimolate le cellule). Controlli negativi, che consisteva di cellule KG1a rotolamento sulla non-IL-1β-stimolata HBMEC-60 cellule o su IL-1β-stimolata HBEMC-60 cellule pretrattate con anti-umano E-selectina mAb, sono stati eseguiti in parallelo per dimostrare la dipendenza di stimolazione citochine ed E-selectina espressione per l&#39;attività di laminazione (Figura 3). Inoltre, l&#39;analisi laminazione di cellule KG1a pretrattate con Vibrio cholerae neuraminidasi (sialidasi) o con la bromelina, un non-specifico della proteasi noto per digerire E-selectina superficie ligando glicoproteina, ha sottolineato l&#39;importanza dei residui di acido sialico terminale e glicoproteina di superficie per l&#39;E-selectina ligando attività (2,3).

<ol><li>Dimitroff, C. J., Kupper, T. S., Sackstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+leukocytic+migration+to+inflamed+skin+with+a+novel+fluorosugar+modifier+of+cutaneous+lymphocyte-associated+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Prevention of leukocytic migration to inflamed skin with a novel fluorosugar modifier of cutaneous lymphocyte-associated antigen.</a> J. Clin. Invest. 112, 1008-1018 Forthcoming.</li>
<li>Dimitroff, C. J., Lechpammer, M., Long-Woodward, D., Kutok, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rolling+of+human+bone-metastatic+prostate+tumor+cells+on+human+bone+marrow+endothelium+under+shear+flow+is+mediated+by+E-selectin%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Rolling of human bone-metastatic prostate tumor cells on human bone marrow endothelium under shear flow is mediated by E-selectin.</a> Cancer Res. 64, 5261-5269 (2004).</li>
<li>Dimitroff, C. J., Descheny, L., Trujillo, N., Kim, R., Nguyen, V., Huang, W., Pienta, K. J., Kutok, J. L., Rubin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+leukocyte+E-selectin+ligands%2C+P-selectin+glycoprotein+ligand-1+and+E-selectin+ligand-1%2C+on+human+metastatic+prostate+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of leukocyte E-selectin ligands, P-selectin glycoprotein ligand-1 and E-selectin ligand-1, on human metastatic prostate tumor cells.</a> Cancer Res. 65, 5750-5760 (2005).</li>
<li>Descheny, L., Gainers, M. E., Walcheck, B., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ameliorating+Skin-Homing+Receptors+on+Malignant+T+cells+with+a+Fluorosugar+Analog+of+N-acetylglucosamine%3A+P-selectin+Ligand+is+a+More+Sensitive+Target+than+E-selectin+Ligand%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Ameliorating Skin-Homing Receptors on Malignant T cells with a Fluorosugar Analog of N-acetylglucosamine: P-selectin Ligand is a More Sensitive Target than E-selectin Ligand.</a> J Invest Dermatol. 126 (9), 2065-2073 (2006).</li>
<li>Gainers, M. E., Descheny, L., Barthel, S. B., Liu, L., Wurbel, M., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin-homing+receptors+on+effector+leukocytes+are+differentially+sensitive+to+glyco-metabolic+antagonism+in+allergic+contact+dermatitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Skin-homing receptors on effector leukocytes are differentially sensitive to glyco-metabolic antagonism in allergic contact dermatitis.</a> J. Immunology. 179 (12), 8509-8518 (2007).</li>
<li>Rood, P. M., Calafat, J., von dem Borne, A. E., Gerritsen, W. R., van der Schoot, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+of+human+bone+marrow+endothelial+cells%3A+characterisation+of+new+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Immortalization of human bone marrow endothelial cells: characterisation of new cell lines.</a> Eur J Clin Invest. 30 (7), 618-629 (2000).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse o divulgazioni.

Piatti paralleli analisi camera di flusso è un sistema specializzato in test in vitro utilizzati per lo studio dei leucociti - interazioni adesive endoteliale in condizioni di stress di taglio simili a quelli impartiti sulla superficie di un post-capillari venule. Come illustrato qui nella nostra presentazione visiva, dimostriamo il valore di questo sistema per indagare il ruolo di E-selectina - E-selectina ligandi nella mediazione tethering leucociti e rotolando sulla superficie dell&#39;endotelio microvascolare attivata. Ci rivelano anche l&#39;applicazione della proteasi, glicosidasi e trattamenti anticorpi blocco per chiarire il ruolo di E-selectina e dei suoi ligandi in questo sistema. Queste analisi sono altamente riproducibili e aiutare a formare una base sperimentale per lo studio di E-selectina - E-selectina funzione di legante in vivo. Oltre a studiare l&#39;adesione cellulare con monostrati di cellule microvascolari citochina-attivati ​​endoteliale (vena ombelicale hBMEC o umana o per assorbimento cutaneo delle cellule endoteliali microvascolari), le analisi possono essere eseguite utilizzando umana ricombinante purificata E-selectina o molecole chimeriche E-selectina-Ig come substrato per l&#39;adesione cellulare. Interazioni adesive altri mediato attraverso leucociti (L-)-selectina e delle piastrine (P)-selectina possono essere analizzati utilizzando la tecnologia a piatti paralleli camera di flusso. Variando il tipo di cellule monostrato / proteine ​​substrato o di leucociti ingresso / selectina-transfectant modelli cellulari, i ricercatori possono studiare il ruolo di queste interazioni in condizioni fisiologiche sollecitazioni di taglio.

<table><tbody><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6178-500ML</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>GIBCO, di Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>GIBCO, di Life Technologies</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>GIBCO, di Life Technologies</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Kit per camera di flusso a piastre parallele</td><td>GlycoTech</td><td>31-001</td><td></td></tr><tr><td>Pompa a siringa programmabile PHD2000</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PHD 2000</td><td></td></tr><tr><td>Piatto da coltura tissutale 35x10 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina, da plasma umano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86088-83-7 F2006-2MG</td><td></td></tr><tr><td>Interleuchina-1_, umana; ricombinante</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9401-5UG</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (soluzione salina tamponata di Hank)</td><td>GIBCO, di Life Technologies</td><td>14170</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199 con HEPES &amp;& Glutammina</td><td>Invitrogen</td><td>12320-039</td><td></td></tr><tr><td>Siero Umano</td><td>Innovative Research, Inc.</td><td>IPLA-SER1</td><td></td></tr><tr><td>Eparina</td><td>Abraxis BioScience</td><td>504011</td><td></td></tr><tr><td>fattore di crescita fibroblastico umano ricombinante</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina Streptomycin</td><td>GIBCO, di Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Tubi di plastica</td><td>BD Biosciences</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>Anti-E-selettina umana clone BBIG-E4(5D11)</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>BBA16</td><td></td></tr><tr><td>Bromelina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-4882</td><td></td></tr></tbody></table>

analisi di fisiologica e-selectina-mediata rotolamento dei leucociti sull&#39;endotelio microvascolari

Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium

E-selectina è un tipo-1 proteina presente sulla membrana delle cellule endoteliali microvascolari che aiuta a iniziare il reclutamento dei leucociti circolanti nei tessuti cutanei, ossei e infiammato. E-selectina espressione è costitutiva sul microcircolo cutaneo e ossa ed è inducibile da citochine pro-infiammatorie, quali IL-1α / e TNF-α, il microvasi nei tessuti infiammati. Questo recettore lectina media deboli interazioni di legame con carboidrati contro-recettore ligandi sui leucociti circolanti, che si traduce in un comportamento caratteristico di rotolamento. Poiché queste interazioni precedere eventi adesivo più stabile e attività diapedesi, caratterizzazione dei leucociti attività di rotolamento e l&#39;identificazione dei leucociti E-selectina ligandi sono stati gli obiettivi principali degli studi di traffico dei leucociti e l&#39;infiammazione e lo sviluppo di terapie anti-infiammatorie (1-5) . L&#39;intento di questo rapporto è di fornire una visuale, descrizione completa della tecnologia più diffusa per lo studio di E-selectina E-selectina interazioni ligando in condizioni fisiologiche del flusso sanguigno. Il nostro laboratorio in collaborazione con il Centro di Ricerca Malattie della pelle Harvard utilizza un state-of-the-art a piatti paralleli apparato camera di flusso accompagnato da visualizzazione digitale e software di nuova registrazione, NIS-Elements. Questa tecnologia ci permette di analizzare gli eventi adesione in tempo reale per la visualizzazione sullo schermo così come l&#39;attività di registrazione in sequenza in un formato video. Parametri di adesione cellulare, come la frequenza di rotazione, la resistenza al taglio e rilegatura / tethering efficienza, sono calcolati con NIS-Elements, esportati in un foglio Excel e sottoposti ad analisi statistica. Nella dimostrazione qui presentati, abbiamo impiegato i piatti paralleli camera di flusso per indagare E-selectina-dipendente l&#39;attività dei leucociti che rotola su cellule di midollo osseo umano vivente endoteliale (hBMEC). Umane ematopoietiche cellule progenitrici KG1a, che esprimono un alto livello di E-selectina ligando, sono stati utilizzati come modello dei leucociti, mentre un immortalata linea cellulare hBMEC, HBMEC-60 cellule, è stato utilizzato come modello delle cellule endoteliali (6). Per indurre e simulare nativo E-selectina espressione nella camera di flusso, HBMEC-60 cellule sono stati attivati ​​con IL-1. La nostra presentazione video ha mostrato che a piatti paralleli analisi del flusso è un metodo adeguato per lo studio fisiologico E-selectina-mediata dei leucociti al rotolamento e le attività che la caratterizzazione funzionale dei leucociti E-selectina ligando (s) nella camera di flusso può essere accertata mediante l&#39;implementazione della proteasi o glicosidasi digestioni.

Questo rapporto fornisce una rappresentazione visiva di piatti paralleli analisi del flusso della camera per lo studio delle interazioni tra leucociti endoteliale sotto fisiologiche sollecitazioni di taglio. Questo metodo è particolarmente utile per indagare il ruolo di endoteliale (E)-selectina e leucociti E-selectina ligandi che leucociti innescare rotolamento sulla superficie delle cellule endoteliali.

Analisi di fisiologica E-selectina-mediata rotolamento dei leucociti sull&#39;endotelio microvascolari

L'E-selectina è una proteina di membrana di tipo 1 presente sulle cellule endoteliali microvascolari che contribuisce a innescare il reclutamento dei leucociti circolanti nei tessuti cutanei, ossei...

Questo video illustra l'analisi mediante camera a flusso a piastre parallele per esaminare i fattori che innescano il rotolamento dei leucociti sulle superfici delle cellule endoteliali. Monociti di cellule endoteliali vengono stimolati con la citochina pro-infiammatoria IL-1β per aumentare l'espressione del S-selectina. Successivamente, la camera a flusso a piastre parallele viene posizionata sopra le cellule endoteliali e i leucociti positivi per S-selectina vengono infusi sulla monocellulare.Le interazioni cellulari nella camera sono quindi sottoposte a uno sforzo di taglio simile a quello presente nell'adesione dei leucociti post-capillare. Gli eventi di rotolamento vengono catturati e quantificati utilizzando NIS elements e un saggio per l'indipendenza da E-selectina. Ciao, sono George Weis nel laboratorio del Dott. Charles de Nitro del Dipartimento di Dermatologia del Brigman Women's Hospital, Harvard Medical School.Oggi vi mostreremo un procedimento per analizzare il ruolo di e selectina e dei suoi ligandi nell'adesione dei leucociti umani alle cellule endoteliali del midollo osseo umano in condizioni fisiologiche di flusso sanguigno. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare il ruolo delle molecole di superficie cellulare che iniziano l'adesione dei globuli bianchi o delle cellule tumorali metastatiche alle cellule endoteliali, che rivestono la superficie interna dei vasi sanguigni. Questo evento adesivo è caratterizzato da un comportamento di rotolamento simile a una palla da bowling che rotola lungo una pista.Iniziamo. Il primo passaggio di questa procedura consiste nel preparare le cellule endoteliali che rivestiranno la camera di flusso. Questo protocollo utilizza cellule H-B-M-E-C 60 derivate dal midollo osseo umano.Le piastre per colture di microvascolatura devono essere pre-ricoperte con fibronectina: incubare piastre da coltura tissutale da 35 millilitri con PBS contenente 20 microgrammi per millilitro di fibronectina. L'incubazione può avvenire per tutta la notte a quattro gradi Celsius oppure per tre ore a 37 gradi Celsius. Sospendere le cellule H-B-M-E-C 60 nel mezzo 1 99 e seminare a una densità di 10 alla quinta cellule per piastra, coltivando fino a raggiungere una confluenza superiore al 90%.Ci vorranno circa due giorni per aumentare l'espressione di e-selectina; aspirare il mezzo di crescita e aggiungere mezzo fresco contenente 50 nanogrammi per millilitro di IL-1β, quindi incubare per quattro-sei ore. I monociti cellulari sono ora pronti per il saggio con camera a flusso. Ulteriori piastre di cellule H-B-M-E-C 60 possono essere stimolate con IL-1β e trattate con un anticorpo neutralizzante anti-e-selectina umana a 20 microgrammi per millilitro per un'ora a 37 gradi Celsius.Questo consentirà di controllare l'espressione funzionale di e-selectina. Successivamente, preparare i leucociti positivi per l'e-selectina. Queste sono cellule progenitrici ematopoietiche umane KG1a.Queste vengono coltivate in sospensione fino a confluenza o fino a raggiungere sei cellule per millilitro in RPMI 1640. Le cellule KG1a possono essere prelevate direttamente dalla coltura e contate mediante emocitometro. Ri-sospendere le cellule a 10⁶ cellule per millilitro in HBSS con 10 millimoli di HEPES o tampone HH contenente cloruro di calcio 2 millimolare.Conservare le cellule sul ghiaccio fino al momento del saggio. I passaggi successivi prevedono la preparazione del microscopio, della camera a flusso a piastre parallele e della pompa per siringa. Per il saggio, accendere il microscopio e la pompa per siringa.Selezionare l'obiettivo 10x sul microscopio. Posizionare un tubo conico da 50 millilitri nel supporto e riempirlo con buffer HH contenente cloruro di calcio 2 millimolare. Quindi posizionare dei tubi da saggio in plastica da cinque millilitri nel supporto sottostante.Successivamente, inserire una siringa da 60 millilitri nella pompa per siringa. Assicurarsi che sia lo stantuffo che il corpo della siringa siano ben fissati. Collegare un rubinetto a tre vie all'estremità della siringa da 60 ml e quindi una siringa da 5 ml al rubinetto a tre vie.Posizionare l'apparato della camera a flusso parallelo sul palco del microscopio con il tubo di ingresso a destra, il tubo di uscita a sinistra e il tubo del vuoto sul retro. Dopo aver collegato i tubi al vuoto, aprire la valvola dell'aria per permettere all'apparato a piastre parallele di aderire al palco. Questo verificherà se la guarnizione a vuoto della camera a flusso è stagna all'aria.Dopo aver confermato la tenuta, spegnere la valvola dell'aria. Collegare ora il tubo di uscita al rubinetto a tre vie già connesso alla siringa. L'apparato è ora pronto per essere posizionato sopra le cellule H-B-M-E-C 60.Accendere delicatamente il vuoto, abbassare l'apparato della camera di flusso sulla piastra e lasciare che l'apparato venga aspirato. Non devono esserci suoni di fuoriuscita d'aria e a questo punto potrebbe essere necessario applicare pressione sulla camera per comprimere la guarnizione di gomma. Una volta stabilito il vuoto, posizionare il tubo di ingresso nel tubo conico da 50 millilitri.Aprire il rubinetto a tre vie verso la siringa da 60 mil e posizionare la pompa in modalità pompa per rimuovere l'aria dalle tubazioni senza sollevare le cellule dalla piastra. Utilizzare la pompa per siringa impostata a due mil al minuto per riempire il tubo di aspirazione. Quindi impostare rapidamente a 0,5 mil al minuto.Proprio prima che il fluido raggiunga l'apparato, è fondamentale preparare attentamente il sistema ed evitare bolle d'aria, che potrebbero sollevare il monostrato dalla piastra. Una volta che il fluido entra nella siringa da 60 mil, la camera a flusso e la pompa per siringa sono state preparate. A questo punto, fissare saldamente la camera a flusso sulla piastra utilizzando un pezzo di nastro su ciascuna delle linee di ingresso, uscita e vuoto.Questo garantisce che il campo visivo rimanga costante durante la visualizzazione e l'acquisizione dei dati. La camera a flusso è ora pronta per l'uso. Questi passaggi devono essere ripetuti per ogni esecuzione di immissione delle cellule e per ogni nuova piastra.Per catturare gli eventi di rolling sul sito Lucas, aprire NIS Elements sul desktop e premere l'icona di riproduzione per visualizzare un'immagine in tempo reale. L'esposizione automatica permetterà di vedere la piastra e di mettere a fuoco l'immagine. Assicurarsi che il microscopio sia correttamente focalizzato sul monolayer cellulare regolando manualmente la messa a fuoco sul microscopio.Una volta che l'immagine è a fuoco, reimpostare l'esposizione a un fotogramma al secondo e regolare la luce sul microscopio. L'immagine dovrebbe apparire sul computer e non dovrebbe più essere visibile attraverso il microscopio. Successivamente, è possibile regolare l'istogramma della luce per rimuovere l'esposizione di fondo o migliorare la chiarezza delle cellule; fare clic su bin 2x2 o bin in tempo reale per ottenere un'immagine ideale per la registrazione di un filmato.Fare clic su macro nella barra del menu e selezionare da destra la porta COM3 e aprire. Questa operazione apre la porta per coordinarla con la pompa a siringa. La camera di flusso è ora pronta per essere infusa con cellule KG1a: pipettare un millilitro di sospensione di KG1a nel tubo da prova da 5 ml vicino alla linea del tubo di ingresso.Quindi posizionare la linea di ingresso in fondo al tubo da saggio. Andare sulla barra del menu e fare clic su acquisizione e acquisizione con lapse temporale. Selezionare il protocollo della durata di 210 secondi.Questa è la durata del programma per il flusso su cellule H-B-M-E-C 60. Ogni fase è programmata per acquisire un'immagine ogni secondo per tutta la durata del protocollo della pompa. È inoltre configurata per inviare un comando attraverso la porta comm tre per avviare la pompa.Impostare la pompa per siringa sulla modalità programma, che consente la programmazione manuale di specifiche velocità di flusso. Questo determinerà i livelli di stress di taglio all'interno della camera e regolerà le interazioni tra cellule KG1a e cellule H-B-M-E-C 60. Le impostazioni per queste interazioni sono di 4,2 dine per centimetro quadrato per 45 secondi.Puntare a tre dinac per centimetro quadrato per 60 secondi e aumentare gradualmente ogni 15 secondi fino a un massimo di 4,2 dinac per centimetro quadrato. Il microscopio e il computer sono ora pronti per acquisire la fotografia a intervalli di tempo. Premere avvio esecuzione sul computer per iniziare l'acquisizione dei dati durante l'esecuzione del programma.Assicurarsi di aggiungere mezzo nel tubo contenente le cellule KG una A per mantenere i tubi di ingresso e uscita pieni di mezzo e impedire che bolle d'aria entrino nel sistema. Se l'intervallo temporale viene interrotto, la pompa non si fermerà da sola e dovrà essere reimpostata. Premere annulla per tornare all'immagine in tempo reale.Un monostrato di cellule endoteliali non stimolate funge da controllo negativo per questo esperimento. A tale scopo, infondere leucociti KG1a nella camera di flusso su cellule HBMEC-60 non trattate per controllare l'indipendenza dall'E-selettina, stimolare il monostrato di cellule endoteliali con IL-1β e infondere i leucociti su queste cellule per ulteriore controllo dell'indipendenza dall'E-selettina. Trattare le cellule HBMEC-60 con IL-1β e successivamente con un anticorpo anti-selettina S umana.Quindi analizzare gli eventi di rotolamento dei leucociti su queste cellule. Il rotolamento cellulare non è determinato solo dal S-selectina, ma anche dai residui di acido sialico sulla superficie cellulare dei leucociti. Per dimostrare questo, digerire le cellule KG1a con 0,1 unità per ml di neuraminidasi per un'ora a 37 °C.Quindi analizzare gli eventi di rotolamento sulle cellule H-B-M-E-C 60 stimolate. Anche le glicoproteine sulla superficie dei leucociti sono importanti per il rotolamento cellulare. Questo può essere dimostrato trattando le cellule KG one A con 0,2 unità per ml di bromelina per un'ora a 37 gradi Celsius, e successivamente infondendole nella camera di flusso.Dopo aver acquisito la sequenza temporale, i dati sono pronti per l'analisi. Salvare i dati e passare alla scheda misura sulla barra del menu e selezionare soglia definita. Spostare le barre in modo che le cellule desiderate siano colorate in rosso, selezionare tutte le immagini e quindi premere ok; l'intera sequenza a intervalli dovrebbe ora essere modificata con cellule arrotolate visibili in rosso.Vai a misurare e selezionare le restrizioni. Questo consente all'utente di escludere oggetti al di sotto della soglia che non rappresentano cellule in rotolamento. Si tratta principalmente di rumore di fondo generato dal monolayer di H-B-M-E-C 60; selezionare l'area e inserire i valori minimi e massimi, ideali per i leucociti in rotolamento.Ripetere questo passaggio per l'allungamento e la circolarità. Selezionare Misura e quindi selezionare Crea binario utilizzando restrizioni. Gli stessi valori di restrizione, impostati nel passaggio precedente, verranno ora utilizzati per ottimizzare il software degli elementi NIS al fine di riconoscere i leucociti rotolanti sul monolayer di cellule endoteliali. Tornare a Misura, selezionare Dati del campo e quindi selezionare Reimposta dati.Chiudere il menu, tornare alla misurazione e selezionare il campo di scansione, aprire i dati del campo di misurazione e selezionare il numero o gli oggetti. Quindi selezionare tutti i campi ed esportare i dati in Microsoft Excel. Infine, selezionare cancella dati.Gli elementi NIS sono ora pronti per ulteriori raccolte di dati. Questi dati rappresentativi mostrano come le interazioni tra leucociti e cellule endoteliali rispondano allo stress tangenziale fisiologico, testando in particolare il ruolo del ligando adesivo E-selettina.Un marcato rotolamento dei leucociti si verifica quando le cellule endoteliali sono pre-stimolate con IL-1β. Confrontando questo risultato con il controllo non stimolato, è evidente che il rotolamento cellulare dipende dalla stimolazione citochinica. Trattando le cellule H-B-M-E-C 60 con IL-1β e successivamente con un anticorpo anti-human E-selectina, risulta chiaro che il rotolamento cellulare dipende specificamente dall'E-selectina.Questo saggio può essere utilizzato anche per testare altri parametri. Ad esempio, quando le cellule stimolate vengono pretrattate con sase o con brolin, i risultati sono meno robusti. Questi dati evidenziano l'importanza dei residui di acido sialico terminali, nonché delle glicoproteine della superficie cellulare.Per l'attività del ligando del selectina S, abbiamo appena mostrato come analizzare le interazioni adesive mediata dalla selectina E tra leucociti e cellule endoteliali in condizioni che simulano le forze presenti in una venula postcapillare, la regione del sistema circolatorio in cui i leucociti lasciano il sangue ed entrano nei tessuti. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di utilizzare l'opportuno anticorpo bloccante o un controllo con trattamento enzimatico per validare la necessità della rispettiva selectina e del suo ligando in questo sistema sperimentale. Questo è tutto.Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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