Analisi di fisiologica E-selectina-mediata rotolamento dei leucociti sull'endotelio microvascolari

Questo video illustra l'analisi mediante camera a flusso a piastre parallele per esaminare i fattori che innescano il rotolamento dei leucociti sulle superfici delle cellule endoteliali. Monociti di cellule endoteliali vengono stimolati con la citochina pro-infiammatoria IL-1β per aumentare l'espressione del S-selectina. Successivamente, la camera a flusso a piastre parallele viene posizionata sopra le cellule endoteliali e i leucociti positivi per S-selectina vengono infusi sulla monocellulare.

Le interazioni cellulari nella camera vengono quindi sottoposte a uno sforzo di taglio simile a quello presente nell’adesione dei leucociti post-capillare. Gli eventi di rotolamento vengono catturati e quantificati utilizzando elementi NIS e un saggio per l’indipendenza da E-selectina. Ciao, sono George Weis nel laboratorio del Dottor Charles de Nitro del Dipartimento di Dermatologia del Brigman Women's Hospital, Harvard Medical School.

Oggi vi mostreremo un procedimento per analizzare il ruolo di e-selectina e dei ligandi della E-selectina nell'adesione dei leucociti umani alle cellule endoteliali del midollo osseo umano in condizioni fisiologiche di flusso sanguigno. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare il ruolo delle molecole di superficie cellulare che iniziano l'adesione dei globuli bianchi o delle cellule tumorali metastatiche alle cellule endoteliali, che rivestono la superficie interna dei vasi sanguigni. Questo evento adesivo è caratterizzato da un comportamento di rotolamento simile a una palla da bowling che rotola lungo una pista.

Iniziamo. Il primo passo di questa procedura consiste nel preparare le cellule endoteliali che rivestiranno la camera di flusso. Questo protocollo utilizza cellule H-B-M-E-C 60 derivate dal midollo osseo umano.

Le piastre per coltura di microvascolatura devono essere pre-ricoperte con fibronectina: incubare le piastre da 35 millilitri per coltura tissutale con PBS contenente 20 microgrammi per millilitro di fibronectina. L'incubazione può avvenire per tutta la notte a quattro gradi Celsius oppure per tre ore a 37 gradi Celsius. Sospendere le cellule H-B-M-E-C 60 nel mezzo 1 99 e seminare a una densità di 10 alla quinta cellule per piastra, coltivando fino a raggiungere una confluenza superiore al 90%.

Ci vorranno circa due giorni per aumentare l'espressione di e-selectina; aspirare il mezzo di crescita e aggiungere mezzo fresco contenente 50 nanogrammi per millilitro di IL-1β, quindi incubare per quattro-sei ore. I monociti cellulari sono ora pronti per il saggio nella camera a flusso. Ulteriori piastre di cellule H-B-M-E-C 60 possono essere stimolate con IL-1β e trattate con un anticorpo neutralizzante anti-e-selectina umana a 20 microgrammi per millilitro per un'ora a 37 gradi Celsius.

Questo consentirà di controllare l'espressione funzionale di e-selectina. Successivamente, preparare i leucociti positivi per l'e-selectina. Queste sono le cellule KG1a, cellule progenitrici ematopoietiche umane.

Queste vengono coltivate in sospensione fino alla confluenza o fino a raggiungere sei cellule per millilitro in RPMI 1640. Le cellule KG1a possono essere prelevate direttamente dalla coltura e contate con un emocitometro. Risospendere le cellule a 10⁶ cellule per millilitro in HBSS con 10 millimoli di HEPES o tampone HH contenente cloruro di calcio 2 millimolare.

Mantenere le cellule sul ghiaccio fino al momento del saggio. I passaggi successivi prevedono l'allestimento del microscopio, della camera a flusso parallelo e della pompa per siringa. Per il saggio, accendere il microscopio e la pompa per siringa.

Selezionare l'obiettivo 10x sul microscopio. Posizionare un tubo conico da 50 millilitri nel supporto e riempirlo con buffer HH contenente cloruro di calcio due millimolare. Quindi posizionare dei tubi di prova in plastica da cinque millilitri nel supporto sottostante.

Successivamente, inserire una siringa da 60 millilitri nella pompa per siringa. Assicurarsi che sia lo stantuffo che il corpo della siringa siano ben fissati. Collegare un rubinetto a tre vie all'estremità della siringa da 60 ml e quindi una siringa da 5 ml al rubinetto a tre vie.

Posizionare l'apparato della camera a flusso parallelo sul palco del microscopio con il tubo di ingresso a destra, il tubo di uscita a sinistra e il tubo del vuoto sul retro. Dopo aver collegato i tubi al vuoto, aprire la valvola dell'aria per permettere all'apparato a piastre parallele di aderire al palco. Questo verificherà se la gonna a vuoto della camera a flusso è ermetica.

Una volta confermata la chiusura ermetica, spegnere la valvola dell'aria. Collegare ora il tubo di uscita al rubinetto a tre vie già connesso alla siringa. L'apparato è ora pronto per essere posizionato sopra le cellule H-B-M-E-C 60.

Accendere delicatamente il vuoto, abbassare lentamente l'apparato della camera di flusso sulla piastra e lasciare che l'apparato venga aspirato. Non devono esserci rumori di fuoriuscita d'aria e a questo punto potrebbe essere necessario applicare pressione sulla camera per comprimere la guarnizione di gomma. Una volta stabilito il vuoto, posizionare il tubo di ingresso nel tubo conico da 50 millilitri.

Aprire il rubinetto a tre vie verso la siringa da 60 ml e impostare la pompa in modalità pompa per rimuovere l'aria dalle linee senza sollevare le cellule dalla piastra. Utilizzare la pompa per siringa impostata a due ml al minuto per riempire il tubo di aspirazione. Quindi impostare rapidamente a 0,5 ml al minuto.

Subito prima che il fluido raggiunga l'apparecchiatura, è fondamentale preparare attentamente il sistema ed evitare bolle d'aria, che potrebbero sollevare il monocstrato dalla piastra. Una volta che il fluido entra nella siringa da 60 mil, la camera di flusso e la pompa per siringa sono state preparate. A questo punto, fissare saldamente la camera di flusso alla piastra con un pezzo di nastro applicato su ciascuna delle linee di ingresso, uscita e vuoto.

Questo garantisce che il campo visivo rimanga costante durante la visualizzazione e l'acquisizione dei dati. La camera a flusso è ora pronta per l'uso. Questi passaggi devono essere ripetuti per ogni esecuzione di immissione delle cellule e per ogni nuova piastra.

Per catturare gli eventi di rotolamento delle cellule nel sito di Lucas, aprire NIS Elements sul desktop e premere l'icona di riproduzione per visualizzare un'immagine in tempo reale. L'esposizione automatica permetterà di vedere la piastra e di mettere a fuoco l'immagine. Assicurarsi che il microscopio sia correttamente focalizzato sul monolayer cellulare regolando manualmente la messa a fuoco sul microscopio.

Una volta che l'immagine è a fuoco, reimpostare l'esposizione a un fotogramma al secondo e regolare la luce sul microscopio. L'immagine dovrebbe apparire sul computer e non dovrebbe più essere visibile attraverso il microscopio. Successivamente, è possibile regolare l'istogramma della luce per eliminare l'esposizione di fondo o migliorare la chiarezza delle cellule; fare clic su bin 2x2 o bin in tempo reale per ottenere un'immagine ideale per la registrazione di un filmato.

Fare clic su macro nella barra del menu e selezionare "right to port", quindi scegliere la porta com3 e aprire. Questa operazione apre la porta per coordinarla con la pompa a siringa. La camera di flusso è ora pronta per essere riempita con cellule KG1a: pipettare un millilitro di sospensione di KG1a nel tubo da prova da 5 ml vicino alla linea del tubo di ingresso.

Quindi posizionare la linea di ingresso nella parte inferiore del tubo da saggio. Andare sulla barra del menu e fare clic su acquisizione e acquisizione con lapse temporale. Selezionare il protocollo della durata di 210 secondi.

Questa è la durata del programma per il flusso su cellule H-B-M-E-C 60. Ogni fase è programmata per acquisire un'immagine ogni secondo per tutta la durata del protocollo della pompa. È inoltre configurata per inviare un comando attraverso la porta comm tre per avviare la pompa.

Impostare la pompa per siringa sulla modalità programma, che consente la programmazione manuale di specifiche velocità di flusso. Questo determinerà i livelli di stress di taglio all'interno della camera e regolerà le interazioni tra cellule KG1a e cellule H-B-M-E-C 60. Le impostazioni per queste interazioni sono di 4,2 dine per centimetro quadrato per 45 secondi.

Puntare a tre dini per centimetro quadrato per 60 secondi e aumentare gradualmente ogni 15 secondi fino a un massimo di 4,2 dini per centimetro quadrato. Il microscopio e il computer sono ora pronti per acquisire la fotografia in time-lapse. Premere avvio esecuzione sul computer per iniziare l'acquisizione dei dati durante l'esecuzione del programma.

Assicurarsi di aggiungere mezzo nel tubo contenente le cellule KG una A per mantenere i tubi di ingresso e uscita pieni di mezzo e per evitare che bolle d'aria entrino nel sistema. Se l'intervallo di tempo viene interrotto, la pompa non si fermerà autonomamente e dovrà essere reimpostata. Premere annulla per tornare all'immagine in tempo reale.

Un monostrato di cellule endoteliali non stimolato funge da controllo negativo per questo esperimento. A tale scopo, infondere leucociti KG1a nella camera di flusso su cellule HBMEC-60 non trattate per verificare l'indipendenza da E-selectina, stimolare il monostrato di cellule endoteliali con IL-1β e infondere i leucociti su queste cellule per ulteriormente controllare l'indipendenza da E-selectina. Trattare le cellule HBMEC-60 con IL-1β e successivamente con un anticorpo anti-human S-selectina.

Quindi analizzare gli eventi di rotolamento dei leucociti su queste cellule. Il rotolamento cellulare è determinato non solo dal S-selectina, ma anche dai residui di acido sialico sulla superficie cellulare dei leucociti. Per dimostrare questo, digerire le cellule KG1a con 0,1 unità per ml di neuraminidasi per un'ora a 37 gradi Celsius.

Quindi analizzare gli eventi di rotolamento sulle cellule H-B-M-E-C 60 stimolate. Anche le glicoproteine sulla superficie dei leucociti sono importanti per il rotolamento cellulare. Questo può essere dimostrato trattando le cellule KG one A con 0,2 unità per ml di bromelina per un'ora a 37 gradi Celsius, per poi infonderle nella camera di flusso.

Dopo aver acquisito la sequenza temporale, i dati sono pronti per l'analisi. Salvare i dati e passare alla scheda misura sulla barra del menu e selezionare soglia definita. Spostare le barre in modo che le cellule desiderate siano colorate in rosso, selezionare tutte le immagini e quindi premere ok; l'intera sequenza a intervalli dovrebbe ora essere modificata con cellule arrotolate visibili in rosso.

Vai a misurare e selezionare le restrizioni. Questo consente all'utente di escludere oggetti al di sotto della soglia che non rappresentano cellule in rotolamento. Si tratta principalmente di rumore di fondo generato dal monolayer di H-B-M-E-C 60; selezionare l'area e inserire i valori minimi e massimi, ideali per i leucociti in rotolamento.

Ripetere questo passaggio per l'allungamento e la circolarità. Selezionare Misura e quindi selezionare Crea binario utilizzando restrizioni. Gli stessi valori di restrizione, impostati nel passaggio precedente, verranno ora utilizzati per ottimizzare il software degli elementi NIS nel riconoscimento dei leucociti rotolanti sul monolayer di cellule endoteliali. Tornare a Misura, selezionare Dati del campo e quindi selezionare Reimposta dati.

Chiudere il menu, tornare alla misurazione e selezionare il campo di scansione, aprire i dati del campo di misurazione e selezionare il numero o gli oggetti. Quindi selezionare tutti i campi ed esportare i dati in Microsoft Excel. Infine, selezionare cancella dati.

Gli elementi NIS sono ora pronti per ulteriori raccolte di dati. Questi dati rappresentativi mostrano come le interazioni tra leucociti e cellule endoteliali rispondano allo stress tangenziale fisiologico, testando in particolare il ruolo del ligando adesivo E-selettina.

Un marcato rotolamento dei leucociti si verifica quando le cellule endoteliali sono pre-stimolate con IL-1β. Confrontando questo risultato con il controllo non stimolato, è evidente che il rotolamento cellulare dipende dalla stimolazione citochinica. Trattando le cellule H-B-M-E-C 60 con IL-1β e successivamente con un anticorpo anti-human E-selectina, risulta chiaro che il rotolamento cellulare dipende specificamente dall'E-selectina.

Questo saggio può essere utilizzato anche per testare altri parametri. Ad esempio, quando le cellule stimolate vengono pretrattate con sase o con brolin, i risultati sono meno robusti. Questi dati evidenziano l'importanza dei residui terminali di acido slicico, nonché delle glicoproteine della superficie cellulare.

Per l'attività del ligando del selectina S, abbiamo appena mostrato come analizzare le interazioni adesive mediata dalla selectina E tra leucociti e cellule endoteliali in condizioni che simulano le forze presenti in una venula postcapillare, la regione del sistema circolatorio in cui i leucociti lasciano il sangue ed entrano nei tessuti. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di utilizzare l'anticorpo bloccante appropriato o un controllo con trattamento enzimatico per validare la necessità della rispettiva selectina e del suo ligando in questo sistema sperimentale. Questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.