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Determinare la costante di equilibrio di una reazione chimica può fornire informazioni importanti sulla misura in cui formerà prodotti nel tempo.
Ogni reazione chimica è associata a una costante di equilibrio, K, che riflette il rapporto tra le concentrazioni dei prodotti e dei reagenti quando la reazione ha smesso di progredire. Per misurare K, queste concentrazioni devono essere determinate.
Se una reazione contiene un singolo componente colorato, la sua interazione con la luce può essere misurata per discernerne la concentrazione. Le concentrazioni dei componenti non colorati possono quindi essere calcolate indirettamente utilizzando l'equazione chimica bilanciata. Questo video illustrerà l'uso di uno spettrofotometro per determinare empiricamente la costante di equilibrio per una reazione di tiocianante del ferro.
La maggior parte delle reazioni chimiche procede sia in avanti che in retromarcia. Man mano che la reazione progredisce, raggiunge un punto in cui le reazioni dirette e inverse si verificano alla stessa velocità. Questo è noto come equilibrio chimico. A questo stato stazionario, il rapporto tra le concentrazioni del prodotto e le concentrazioni dei reagenti, ciascuna elevata alla potenza dei propri coefficienti stechiometrici, corrisponde alla costante di equilibrio, K. Per misurare K per un sistema di interesse, i coefficienti devono essere noti e le concentrazioni devono essere determinate, direttamente o indirettamente. Secondo la legge di Beer-Lambert, la concentrazione di una specie colorata è proporzionale alla sua assorbanza, che è la quantità di energia che assorbe a una specifica lunghezza d'onda della luce. Questo può essere espresso matematicamente, dove A è l'assorbanza, l'epsilon è il coefficiente di attenuazione molare, che è specifico del composto, l è la lunghezza del percorso attraverso il campione e c è la concentrazione. Una curva di calibrazione viene creata testando più soluzioni di concentrazione nota e tracciando i valori di assorbanza risultanti. Con questa curva di calibrazione è possibile studiare soluzioni di concentrazione sconosciuta. Le misure di assorbanza vengono utilizzate per determinare la concentrazione delle specie colorate. Quindi, è possibile calcolare le concentrazioni dei reagenti e dei prodotti rimanenti. La seguente procedura studierà la reazione del ferro tre con il tiocianato per formare un complesso di tiocianato di ferro.
Una volta determinate le concentrazioni, il valore di K può essere calcolato con una tabella di equilibrio di variazione iniziale, o ICE, che verrà spiegata ulteriormente nei risultati.
Ora che hai capito come i metodi spettrofotometrici possono essere utilizzati per determinare la costante di equilibrio, sei pronto per iniziare la procedura.
Prima di misurare il campione, è necessario generare una curva di calibrazione.
Per iniziare, azzerare uno spettrofotometro UV-VIS utilizzando acqua distillata come bianco per rappresentare l'assenza di assorbanza. Quando si inserisce una cuvetta nello spettrofotometro, assicurarsi che sia orientata in modo che la luce passi attraverso i lati trasparenti e che il livello del liquido sia al di sopra del percorso del raggio.
Quindi, preparare 5 provette contenenti i volumi indicati di ciascuna soluzione reagente come mostrato nel protocollo di testo, che produrranno concentrazioni variabili del prodotto. Coprire ogni tubo con un dito guantato e agitare delicatamente per mescolare. Lasciare riposare le provette per 10 minuti.
Utilizzare una pipetta Pasteur per trasferire una piccola quantità del campione a media concentrazione, soluzione 3, in una cuvetta e inserirla nello spettrofotometro. Acquisisci uno spettro e registra il ?max (lunghezza d'onda massima), lambda max e la sua assorbanza. Quindi, iniziando con la soluzione più diluita, misurare l'assorbanza di tutte le soluzioni rimanenti al ?max (lambda max). Utilizzare la stessa cuvetta per tutte le misurazioni, assicurandosi di risciacquare 3 volte tra un campione e l'altro. Ripetere questo processo per le soluzioni 2 ? 5.
Traccia l'assorbanza misurata rispetto alla concentrazione di tiocianato di ferro per ogni soluzione. Determinare la linea di adattamento migliore per i dati. La pendenza di questa linea è il coefficiente di attenuazione molare.
Ora che i dati per le soluzioni standard sono stati acquisiti, preparare quattro provette contenenti i volumi di soluzioni indicati come mostrato nel protocollo di testo.
Coprire ogni tubo con un dito e agitare delicatamente per mescolare. Lasciarli riposare per almeno 10 minuti. Questo periodo di riposo permette alle soluzioni di raggiungere l'equilibrio chimico.
Utilizzare una pipetta Pasteur per trasferire una piccola quantità di soluzione 6 nella cuvetta e inserirla nello spettrofotometro. Acquisire uno spettro e registrare l'assorbanza misurata al ?max. Ripetere questo processo per le soluzioni da 7 a 9.
Una volta misurati tutti i campioni, i dati sulla molarità e sull'assorbanza per le soluzioni 1 ? 5 possono essere analizzati. È stato utilizzato un grande eccesso di tiocianato per garantire che tutto il ferro reagisse, il che semplifica l'analisi.
I dati vengono tracciati per creare una curva di calibrazione. La lunghezza del percorso della luce, l, è tipicamente di 1 cm e può essere scontata dai calcoli. La pendenza della linea, che è stata calcolata in 7600, è quindi il coefficiente di attenuazione. Per le soluzioni di prova 6 ? 9, questo valore e l'assorbanza vengono utilizzati per calcolare le concentrazioni di tiocianato di ferro all'equilibrio. Con questi dati, è stato possibile utilizzare la tabella ICE.
Le concentrazioni iniziali dei reagenti si basano sulle molarità note di ferro e tiocianato aggiunti alla soluzione e sul volume totale della reazione. Poiché il prodotto è formato dalla reazione 1:1 di ferro e tiocianato, la concentrazione di equilibrio di ciascuno diminuisce della quantità di prodotto formato. La concentrazione di equilibrio di ciascuna specie è ora nota. Questi valori vengono utilizzati per calcolare la costante di equilibrio per ciascuna soluzione. I valori sono approssimativamente costanti nell'intervallo di concentrazioni studiate.
Il concetto di costante di equilibrio è importante per una vasta gamma di campi scientifici. La costante di equilibrio può essere utilizzata per fornire informazioni utili sulla misura in cui una reazione formerà prodotti nel tempo. In questo esempio, sono state osservate due reazioni contenenti cristallovioletto.
La prima soluzione era composta da cristallovioletto e idrossido di sodio. È stato osservato che il colore cambia rapidamente dal viola all'incolore. Questa reazione ha un valore K molto grande, indicando che i prodotti si formano quasi completamente nel tempo.
Il cristallovioletto è stato quindi fatto reagire con acetato di sodio. Questa soluzione è rimasta viola a tempo indeterminato. Questa reazione ha un valore K molto basso, quindi non procede in avanti in misura significativa.
Infine, la costante di dissociazione ? un tipo specifico di costante di equilibrio ? può essere utilizzato per descrivere il comportamento delle proteine. In questo esempio, i cambiamenti nella struttura dell'RNA sono stati monitorati in tamponi di reazione al magnesio.
L'RNA purificato è stato mescolato in soluzione con concentrazioni note di magnesio e gli è stato permesso di raggiungere l'equilibrio. Quindi, è stata tracciata la struttura dell'RNA risultante.
In questo caso, concentrazioni più elevate di magnesio hanno causato una minore protezione dei siti reattivi sull'RNA, producendo un Kd che era la metà del valore.
Hai appena visto l'introduzione di JoVE alla determinazione spettrofotometrica della costante di equilibrio. A questo punto dovresti capire la relazione definita dalla legge di Beer-Lambert, come determinare la concentrazione dall'assorbanza utilizzando uno spettrofotometro e come calcolare una costante di equilibrio utilizzando le concentrazioni di equilibrio.
Grazie per l'attenzione!